Asia1型口蹄疫病毒单克隆抗体的制备及双抗体夹心ELISA方法的建立

为建立Asia1型口蹄疫(FMD)快速病原学诊断方法,本研究采用纯化的Asia1型口蹄疫病毒(FMDV)免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合并筛选到一株能够稳定分泌抗Asia l型FMDV单克隆抗体(MAb)2E10。经间接免疫荧光试验特异性鉴定,2E10为FMDV型特异型MAb。其抗体亚类为Ig G1/资,杂交瘤细胞上清和腹水抗体效价分别为1颐256和1颐104,相对亲和力常数为2.5 mol/L。在此基础上,以本实验室前期制备的MAb 2D8为包被抗体,以HRP标记的MAb 2E10为检测抗体建立了检测Asia1型FMDV抗原的双抗体夹心ELISA(DAS-ELISA)方法。该方法针对FMDV细胞毒的最低检出量为103TCID50,对O型FMDV、A型FMDV、牛肠道病毒、牛呼肠孤病毒及牛传染性鼻气管炎病毒检测结果均为阴性。本研究建立的Asia1型FMDV DAS-ELISA方法为Asia1型FMD病原学诊断试剂盒的研发奠定了基础。     

鸭新城疫病毒单克隆抗体的制备及双抗体夹心ELISA方法的初步建立

为了对目前流行的鸭新城疫进行快速诊断,应用蔗糖密度梯度离心纯化后的鸭新城疫病毒免疫6周龄雌性Balb/c小鼠,取免疫后小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合.采用ELISA方法筛选阳性细胞克隆,经3次亚克隆后获得一株能稳定分泌鸭新城疫病毒特异性单克隆抗体的细胞株2C1.以PEG纯化后的2C1腹水为捕获抗体,辛酸-硫酸铵纯化的兔抗鸭新城疫病毒多克隆抗体为第二抗体,HRP标记的羊抗兔抗体作为酶标抗体,建立了检测鸭新城疫病毒抗原的双抗体夹心ELISA方法.结果表明,当2C1包被量为4μg/孔,鸭新城疫病毒1:10稀释,兔抗鸭新城疫病毒多抗作用量为0.1 μg/孔,HRP标记的羊抗兔二抗1:10 000倍稀释,每次作用时间为1h时,P/N比值最高,且阳性OD值最接近1.0.试验表明,该方法特异性好,不与IBV、ARV、GPV、DPV、DHV尿囊液及H5、H9标准阳性抗原发生反应;可以检测出0.2 μg纯化病毒,比传统的HA试验的敏感性至少高64倍;批间和批内变异系数均小于10％.本研究建立的双抗体夹心ELISA方法为鸭新城疫病毒的快速诊断奠定了基础.     

牛细小病毒VP2蛋白单克隆抗体的制备及双抗体夹心ELISA方法的建立

为建立一种快速检测牛细小病毒(BPV)的方法,本研究通过PCR扩增BPV VP2基因,构建pProHTa-BPV-VP2重组表达载体,转化后获得重组大肠杆菌,通过诱导表达获得VP2重组蛋白,将其纯化后免疫小鼠(100μg/只),经细胞融合、克隆和筛选共获得了5株阳性杂交瘤细胞株,分别命名为5G9、2B5、6A3、7E8和2B6。经鉴定,其分泌抗体亚型分别为IgG2a、IgG2b、IgM、IgM和IgA。间接免疫荧光结果显示,5株单克隆抗体(MAb)与BPV均可发生特异性反应。同时,将纯化后的BPV VP2重组蛋白免疫新西兰兔,制备兔抗BPV VP2多抗。利用制备的2B5作为检测抗体,BPV VP2多抗作为捕获抗体,初步建立检测BPV的双抗体夹心ELISA方法。该方法的特异性试验结果显示,除BPV外,与牛轮状病毒、猪伪狂犬病毒、猪传染性肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、牛病毒性腹泻病毒均不发生反应。敏感性试验结果显示,该方法对BPV最低检出量为3.125×10~(2.8)TCID50/mL。重复性试验结果显示,该方法批内、批间变异系数均小于10%。利用该方法对269份临床猪腹泻病料样品进行检测,检出BPV阳性样品14份,与PCR方法符合率达100%。综上,本研究利用抗BPV VP2蛋白的MAb和兔抗BPV VP2多抗建立了双抗体夹心ELISA方法,该方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,为BPV感染的快速诊断提供一种有效的检测方法,并为流行病学研究和疫病防控提供一种可靠的手段。     

用单克隆抗体建立双抗体夹心ELISA检测传染性法氏囊病毒

利用抗传染性法氏囊病病毒(IBDV)特异性单克隆抗体建立单抗克隆抗体夹心ELISA,本方法对16株IBDV均呈阳性反应.对人工感染和自然发病的鸡法氏囊病的检出率为100％;同时对其它脏器进行了检测,以脾和肾的检出率最高,肝次之,心和肺较低.本法对IBDV蛋白的最小检出量为7.5ng/ml,因而是一种高度灵敏、特异、简便、快速的检测IBDV的方法。     

非洲猪瘟病毒p72重组蛋白单克隆抗体的制备及双抗体夹心ELISA方法的建立

为了建立一种快速检测非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)的方法,试验利用GenBank中ASFV的p72基因(登录号为MK128995.1)序列构建原核重组表达质粒pGEX-6P-1-p72和真核重组表达质粒pCAGGS-myc-p72,通过大肠杆菌原核表达系统获得p72重组蛋白,将其纯化后免疫小鼠,获得阳性杂交瘤细胞,通过Western-blot和间接免疫荧光鉴定筛选单克隆细胞株,并用单克隆抗体亚类鉴定试剂盒鉴定各单克隆抗体的亚型。通过对p72兔源多克隆抗体包被浓度及纯化的3株单克隆抗体稀释度进行优化,初步建立检测ASFV的双抗体夹心ELISA方法,并用该方法测试纯化的3株单克隆抗体分别与p72兔源多克隆抗体两两组合后所能检测的p72重组蛋白的灵敏度。结果表明：p72重组蛋白大小为99 ku;以纯化的原核表达的p72重组蛋白作为抗原免疫3只小鼠,抗体效价均大于1∶10 000;经细胞融合、克隆和筛选共获得5株阳性杂交瘤细胞,将其分泌的单克隆抗体分别命名为2C4C8、2C4B8、5C11F11、5C11D12、7D10C9,5株单克隆抗体与真核...     

猪蓝耳病病毒抗体双抗原夹心ELISA方法的建立及初步应用

根据PRRSV VR-2332株序列设计了1对扩增PRRSV N蛋白基因的特异性引物,从PRRSV北方株感染细胞中提取总RNA,通过RT-PCR获得长约372 bp的N蛋白编码基因片段。将其克隆到pGEX-6p-1质粒,构建了原核表达载体pPRRS-N。重组基因在大肠杆菌中表达出相对分子质量约为41 000的融合蛋白,目的蛋白表达量约占菌体蛋白的28.5%。利用此重组融合N蛋白建立了一种检测PRRSV特异性抗体的双抗原夹心ELISA,并通过与商品化试剂盒的应用比较对本方法进行了系统评价。分析了来自北京、山东、河南、河北4省区13个养猪场的260份血清,结果表明,本方法的敏感性和特异性分别为93.5%和86.7%,与IDEXX PRRSV抗体检测试剂盒检测结果的符合率达到91.5%。     

检测坦布苏病毒的双抗体夹心ELISA方法建立及初步应用

以鹅源坦布苏病毒JS804毒株制备的多克隆抗体为捕获抗体,抗鹅坦布苏病毒NS1蛋白的单克隆抗体4A9作为检测抗体,建立了检测坦布苏病毒的双抗体夹心ELISA方法。该方法的最佳反应条件为:兔抗鹅坦布苏病毒多克隆抗体的最适稀释度为1∶1 600,单克隆抗体的最适稀释度为1∶160,样品反应时间为1 h,酶标羊抗鼠二抗工作浓度为1∶5 000,以OD450nm≥0.245作为阳性判定标准。该方法的板间、板内重复性变异系数小于10%,病毒最低检测量为386.25TCID50/0.1 mL,与新城疫病毒(NDV)、禽流感病毒(AIV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、鸭肝炎病毒(DHV)和鹅细小病毒(GPV)无交叉反应。应用该方法与RT-PCR方法同时检测22份临床样品,符合率达到86.36%。结果表明,建立的双抗体夹心ELISA方法具有特异性好、灵敏性高和重复性好等优点,可用于坦布苏病毒的快速检测。     

对虾白斑综合症病毒双抗体夹心ELISA方法的建立

用将纯化的对虾白斑综合症病毒VP28蛋白免疫BALB/c小鼠,分离免疫鼠脾细胞,与SP2/0细胞融合,经间接ELISA筛选,得到了2株（2G9,3E5）可以稳定分泌抗对虾白斑综合症病毒特异性单抗的杂交瘤细胞株。用纯化的VP28蛋白免疫家兔,按常规方法制备多抗。选用单抗（3E5）包被ELISA板,用兔多抗作为捕获抗体,建立了对虾白斑综合症病毒的双抗体夹心ELISA检测方法。该方法具有良好的特异性和敏感性,为对虾白斑综合症病毒的检测提供了有效工具。     

绵羊肺腺瘤病毒囊膜蛋白在大鼠体内的表达

为探讨绵羊肺腺瘤病毒囊膜蛋白(OPAV-Env)引起肺泡Ⅱ型上皮恶变的机理,将真核表达质粒pcDNA3.1-env用体内转染试剂经尾静脉转染到幼龄大鼠体内,用RT-PCR及免疫组化法检测绵羊肺腺瘤病毒囊膜蛋白在大鼠体内的表达,并采用SSCP法及基因克隆法结合序列分析检测H-ras基因是否发生突变.结果显示,绵羊肺腺瘤病...     

犬瘟热病毒单克隆抗体夹心ELISA检测方法的建立

为建立方便快捷的犬瘟热病毒(CDV)检测方法,本实验应用杂交瘤细胞融合技术,建立了4株分泌抗CDV单克隆抗体(MAb)的杂交瘤细胞株,分别命名为A2、F7、H4和G12.相加ELISA试验显示4株MAb作用于CDV不同的抗原表位.选取相加指数较高的两株MAb G12和A2分别作为捕获抗体和酶标检测抗体,建立检测CDV的夹心ELISA检测方法,并对实验条件进行了优化.结果显示,该方法与犬细小病毒、犬副流感病毒、犬腺病毒1型、犬冠状病毒等犬类病毒无交叉反应,敏感度为5 μg/mL,变异系数小于6％.利用该方法与RT-PCR方法同时检测57份临床样品,两种方法的符合率为100％.本实验建立的MAb夹心ELISA方法具有特异、敏感、方便快捷等优点,适用于大批量临床样品检测.     

牛病毒性腹泻病毒双抗体夹心ELISA检测方法的建立

将牛病毒性腹泻病毒超免疫血清以常规方法提取IgG，采用过碘酸钠法标记辣根过氧化物酶（HRP），建立了从粪样中检测牛病毒性腹泻病毒抗原的双抗体夹心ELISA。结果，抗体的最佳包被量为150μg／mL，酶标抗体最适工作浓度为1：200；封闭液为50mL／L的兔血清；待检粪样及酶标抗体的感作时间为37℃ 120min；底物显色时间为室温15min。应用建立的检测方法对河北省8个大中型奶牛场298份乳牛腹泻粪样进行了检测，结果，阳性检出率为42．6％。     

水泡性口炎病毒双抗体夹心ELISA检测方法的建立

为建立方便快捷的水泡性口炎病毒(VSV)检测方法,本研究以抗VSV单克隆抗体(MAb)为捕获抗体,兔抗VSV多克隆抗体为检测抗体,建立VSV双抗体夹心ELISA检测方法。结果显示,该方法的最佳工作条件为:抗VSV MAb 1A2的包被浓度为3.09μg/mL,兔抗VSV多克隆抗体和酶标抗体的工作浓度分别为5.16μg/mL和1∶5 000,以OD450nm≥0.231作为阳性判定标准。该ELISA方法对猪水泡病病毒、猪水疱疹病毒及羊传染性脓疱病毒等均无交叉反应;敏感度可达3.125μg/mL(101TCID50);其重复性变异系数小于10%。采用建立的ELISA方法与RT-PCR方法同时检测187份临床样品,符合率达到97.9%,具有良好的相关性。本实验建立的VSV双抗体夹心ELISA检测方法具有特异性好、敏感性高、成本低及方便快捷等优点,可以用于VSV的快速检测。     

用抗传染性氏囊病毒单克隆抗体建立夹心阻断ELISA检测鸡血清抗体及 …

用酶标记抗传染性法氏囊病毒（ＩＢＤＶ）单克隆抗体，建立夹心阻断ＥＬＩＳＡ，检测ＩＢＤＶ鸡血清抗体。用Ｄ７８细胞毒免疫２４日龄的雏鸡，每周采血一次，共４次，用夹心阻断ＥＬＩＳＡ、微量细胞中和试验（ＶＮ）、琼脂扩散试验（ＮＧＰ）检测鸡血清抗体，结果表明：夹心阻断ＥＬＩＳＡ同ＶＮ之间具有较高的相关性（ｒ＝０．８１２６），与ＡＧＰ的相关性较低（ｒ＝０Ｘ．７５７５）。     

检测F种肠道病毒双抗体夹心ELISA方法的建立及初步应用

依据F种肠道病毒(enterovirus species F,EV-F) SD-S67毒株的基因组序列设计合成引物,RT-PCR扩增出该毒株的VP1基因,并将其克隆到原核表达载体pGEX-4T-1的BamHⅠ/EcoRⅠ位点,表达出VP1重组蛋白。以纯化VP1重组蛋白为免疫原,制备兔源多克隆抗体,并以制备的抗体建立了检测F种肠道病毒的双抗体夹心ELISA方法,同时对山东和河南省部分地区牛群感染EV-F进行了初步的流行病学调查。结果显示,捕获抗体的最佳包被量为400 ng/孔,HRP酶标抗体的最佳稀释倍数为1∶400;确定的方法判断标准为样品的D₄₉₀>0.217时判定为阳性。建立的ELISA方法可以特异性检测出EV-F病毒抗原,而EV-E和BVDV病毒抗原检测结果均为阴性,表明方法具有较好的特异性。以建立的ELISA方法检测不同稀释倍数的阳性样品,结果稀释1 000倍后的样品检测结果仍为阳性,表明建立的方法具有较高的敏感性。应用建立的方法检测部分样品,组内变异系数为1.05%～9.24%,组间变异系数为1.39%～6.78%,说明该方法具有良好的重复性。同时...     

检测非洲猪瘟病毒抗原的双抗体夹心ELISA方法的建立

利用非洲猪瘟病毒(ASFV)p72蛋白不同抗原表位的2株单克隆抗体,1株作为捕获抗体,另1株用辣根过氧化物酶(HRP)标记后作为检测抗体,采用方阵法对ELISA反应条件进行优化,建立了检测ASFV抗原的双抗体夹心ELISA方法。结果显示,该方法中捕获抗体包被质量浓度为1.25 mg/L,酶标单克隆抗体的最适稀释度为1∶4 000。通过试验确定该方法的临界值为0.299,当样品D₄₅₀值≥0.3,且P/N大于2时,判定为阳性。该双单抗夹心ELISA方法可特异性检测ASFV抗原,其他抗原检测结果均为阴性,特异性强;重复性好,批内和批间变异系数(CV)均小于8%。应用本研究建立的方法与荧光PCR方法同时对225份临床样品进行检测,总符合率为96.89%。结果表明,本研究建立的双抗体夹心ELISA方法可用于ASFV抗原的大量样品检测,为ASF防控提供了技术支持。     

绵羊肺腺瘤病毒囊膜蛋白引起绵羊绒毛膜滋养层细胞的恶性转化

为了明确绵羊肺腺瘤病毒(JSRV)囊膜蛋白(Env)的致瘤作用,将重组真核表达质粒pEGFP-C1/exJSRVenv和pEGFP-C1/enJSRV-env分别转染到永生化绵羊绒毛膜滋养层细胞(STCs)中,筛选最佳转染条件并利用软琼脂集落形成试验检测是否引起细胞的恶性转化;用平板克隆试验检测囊膜蛋白的表达对细胞增殖的影响。结果显示:在STCs中转染pEGFP-C1/exJSRV-env质粒后细胞在软琼脂中生长并产生集落,同时表现细胞接触抑制性消失;转染pEGFP-C1/enJSRV-env质粒的STCs则表现为不能在软琼脂中产生集落;平板克隆试验结果经SPSS软件分析,转染pEGFP-C1/exJSRV-env的绵羊绒毛膜滋养层细胞的克隆形成率显著高于转染pEGFP-C1/enJSRV-env细胞、pEGFP-C1空载体的细胞以及未转染的细胞(P0.01)。exJSRV-Env的表达可以诱导STCs发生恶性转化以及细胞增殖。本试验可以为进一步探讨绵羊肺腺瘤逆转录病毒囊膜蛋白的功能提供理论依据,并为研究绵羊肺腺瘤病的致瘤机制提供新思路。     

猪瘟病毒E2蛋白双抗体夹心ELISA定量方法的建立

本研究旨在建立定量检测猪瘟病毒(CSFV)E2重组蛋白的双抗体夹心ELISA方法。用CSFV WH303单克隆抗体包被96孔酶标板,用CSFV 1B6单克隆抗体连接HRP作为酶标抗体,以杆状病毒表达纯化的CSFV E2蛋白作为标准品蛋白,建立双抗体夹心ELISA定量方法。用SDS-PAGE方法检测标准品蛋白的纯度,BCA蛋白定量法定量标准品蛋白的浓度。稀释标准品至线性区间,绘制标准曲线。用棋盘法确定包被单克隆抗体和酶标抗体及标准品蛋白的最适稀释度。用批间重复和批内重复试验验证该方法的重复性和稳定性。SDS-PAGE结果显示,CSFV E2蛋白的标准品纯度95%,BCA蛋白定量法测定CSFV E2蛋白的标准品浓度为1.553 mg/mL。包被单克隆抗体的浓度为0.1μg/mL,酶标抗体的最适稀释度为1∶400。CSFV E2蛋白标准品稀释浓度在2.43～77.65μg/mL范围内有很好的线性关系,相关系数R~2值在0.99以上。批间和批内重复性检测试验变异系数均15%。本试验成功建立了定量检测CSFV E2重组蛋白的双抗体夹心ELISA检测方法,该方法具有良好的重复性和稳定性,为CSFV E2蛋白的定量提供了有效方法。     

猪瘟病毒E2蛋白双抗体夹心ELISA定量方法的建立

本研究旨在建立定量检测猪瘟病毒（CSFV）E2重组蛋白的双抗体夹心ELISA方法。用 CSFV WH303单克隆抗体包被96孔酶标板,用CSFV 1B6单克隆抗体连接HRP作为酶标抗体,以杆状病毒表达纯化的CSFV E2蛋白作为标准品蛋白,建立双抗体夹心ELISA定量方法。用SDS-PAGE方法检测标准品蛋白的纯度,BCA蛋白定量法定量标准品蛋白的浓度。稀释标准品至线性区间,绘制标准曲线。用棋盘法确定包被单克隆抗体和酶标抗体及标准品蛋白的最适稀释度。用批间重复和批内重复试验验证该方法的重复性和稳定性。SDS-PAGE结果显示,CSFV E2蛋白的标准品纯度>95%,BCA蛋白定量法测定CSFV E2蛋白的标准品浓度为1.553 mg/mL。包被单克隆抗体的浓度为0.1 μg/mL,酶标抗体的最适稀释度为1∶400。CSFV E2蛋白标准品稀释浓度在2.43~77.65 μg/mL范围内有很好的线性关系,相关系数R²值在0.99以上。批间和批内重复性检测试验变异系数均<15%。本试验成功建立了定量检测CSFV E2重组蛋白的双抗体夹心ELISA检测方法,该方法具有良好的重复性和稳定性,为CSFV E2蛋白的定量提供了有效方法。     

绵羊肺腺瘤病毒囊膜基因表面蛋白的表达及其单克隆抗体的制备

在E．coli BL21中诱导表达含有绵羊肺瘤病毒囊膜表面蛋白（SU）重组质粒pGEX-4T-1-SU,表达的GST融合蛋白经纯化后用佐剂乳化,作为抗原免疫BALB／c小鼠,并进行细胞融合、克隆化、ELISA法初步筛选抗SU单抗。最终获得了3株抗SU的单抗,为深入探讨JSRV的分子生物学特性及研制诊断试剂盒打下了基础。