小鼠胚胎干细胞裂解液诱导鸡胚成纤维细胞发生重编程的研究

本研究采用小鼠胚胎干细胞(ESCs)裂解液与鸡胚成纤维细胞共孵育,通过形态学观察和多能性检测,旨在探讨小鼠ESCs裂解液逆转化鸡胚成纤维细胞为多能干细胞的可行性。结果表明:与小鼠ESCs裂解液共孵育的鸡胚成纤维细胞均变为圆形细胞,形成了42.33个细胞集落;经AKP染色以及Oct-4和SSEA-1免疫细胞化学染色,均呈阳性反应,表现出一定的多能干细胞特性;经核型分析表明这些细胞来源于鸡胚成纤维细胞。单独的重编程操作过程和与鸡胚成纤维细胞裂解液共孵育均无法将鸡胚成纤维细胞重编程为具有ESCs特征的细胞,说明参与重编程鸡胚成纤维细胞的物质来源于小鼠ESCs裂解液。因此,ESCs裂解液诱导体细胞重编程逆转化为多能干细胞的作用能够在小鼠和鸡之间发生。     

牛胎儿成纤维细胞的分离培养

研究了牛胎儿组织成纤维细胞的分离、培养、纯化方法和生长特征,并对培养细胞的冷冻保存和复苏进行了观察.采取组织块培养法进行原代培养,在接种第5天到第6天成纤维细胞生长旺盛;用0.25%胰蛋白酶消化,传代培养细胞生长状态良好;用液氮冷冻法保存传代细胞,解冻后持续传代至第12代仍生长良好,第8代细胞冻存前和复苏后的活率分别为97.0% 和94.3%,无显著差异(P>0.05);分离纯化的胎牛成纤维细胞的生长曲线都正常;成功地建立了牛胎儿成纤维细胞系.该细胞可经多次传代培养和冷冻保存.     

牛胎儿成纤维细胞分离与体外培养

本研究以 4 5d牛胎儿为材料 ,使用 0 .2 5 %胰酶 + 0 .0 4 %EDTA消化液 ,分离得到牛胎儿成纤维细胞 ,体外培养传代至第 2 8代。本实验描绘出牛胎儿成纤维细胞生长曲线 ,并发现α MEM是一种适合牛胎儿成纤维细胞生长的培养基。分离得到的牛胎儿成纤维细胞传至第 1 8代时核型仍然正常 ,冷冻、解冻后细胞可继续传代     

牛胎儿成纤维细胞的培养及性别鉴定

为了探索和建立牛胎儿成纤维细胞体外分离培养及性别鉴定的技术方法,试验取自怀孕40 d的奶牛胎儿耳组织用组织块贴附法进行原代培养和传代培养,用倒置相差显微镜观察成纤维细胞形态;根据牛Y染色体上的性别决定区域(SRY)基因序列设计合成1对PCR引物作为性别鉴定引物, 同时根据牛403 bp的β-珠蛋白基因序列设计1对引物作为内参照引物,建立PCR 反应体系进行性别鉴定.结果表明:分离的成纤维细胞可在体外快速贴壁生长、增殖;阳性对照和第1牛胎儿成纤维细胞系PCR鉴定扩增得到255 bp的片段和403 bp的β-珠蛋白基因片段,第2,3牛胎儿成纤维细胞系和母牛血液PCR扩增只得到403 bp的β-珠蛋白基因片段,通过电泳证明PCR产物255 bp的片段为SRY基因片段,说明有255 bp扩增带的细胞系为雄性;无255 bp扩增带的细胞系为雌性.结果说明该方法所获得的牛胎儿成纤维细胞可在体外稳定培养,利用PCR鉴定牛胎儿性别具有简单、快速、准确的特点,可应用于基因克隆动物研究中体细胞系的早期性别鉴定.     

牛胎儿皮肤成纤维细胞体外培养及其特性研究

该试验研究了牛胎儿皮肤成纤维细胞的分离、培养、纯化方法及其生长特征.牛胎儿皮肤细胞贴壁传代2～4次.可成功获得均一稳定的成纤维细胞群体.取传至4代的牛胎儿皮肤成纤维细胞进行细胞计数,并绘制其生长曲线.     

VPA对牛胎儿成纤维细胞体外培养的影响

为了研究组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDACIs)丙戊酸(VPA)处理对牛胎儿成纤维细胞体外培养的影响,试验采用培养到第3代的牛胎儿成纤维细胞经VPA处理后,进行细胞生长曲线绘制及形态、活力、细胞周期的检测,并通过Real-time PCR检测Oct4和Cdx2的表达情况,经梯度浓度的VPA处理牛胎儿成纤维细胞,于24 h后观察细胞形态。结果表明:当VPA浓度高于0.5 mmol/L时,细胞开始出现异常形态,死细胞数目增多。0.5 mmol/L VPA处理牛成纤维细胞24 h可以显著抑制细胞活力,可将60%以上细胞的周期阻滞在G0/G1期;但处理48 h将导致细胞染色体整倍率显著下降。与对照组相比,VPA处理后,Oct4的表达量显著升高,而Cdx2基因的表达量则显著降低。说明用HDACIs VPA处理过的牛成纤维细胞作为体细胞核移植的供体细胞,可能更有利于克隆胚胎重编程及发育。     

通过Forskolin将小鼠成纤维细胞重编程为神经元试验

为了给临床神经退行性疾病治疗提供有应用价值的方法、突破试验不能转化为临床这一瓶颈,试验通过使用单一小分子化合物Forskolin调控小鼠成纤维细胞命运的方法,使其重编程为神经元,并进行了RT-qPCR、免疫荧光检测。结果表明：经诱导后的神经元表现出典型的神经元形态;RT-qPCR结果显示神经元相关基因表达上调,成纤维相关基因表达下调;免疫荧光结果显示,诱导神经元的神经元相关蛋白TUJ1、MAP2的表达呈阳性。说明使用Forskolin替代转录因子在体外可以实现将小鼠成纤维细胞直接重编程为神经元,应用此成果可在临床治疗上避免外来遗传物介入导致的致瘤致病风险。     

白藜芦醇和褪黑素对绵羊胎儿成纤维细胞转染及卵母细胞体外成熟的影响

试验旨在利用白藜芦醇(Re)和褪黑素(MT)提高绵羊胎儿成纤维细胞电穿孔转染(电转)效率、优化卵母细胞体外成熟体系,以提高转基因动物生产效率。将绵羊胎儿成纤维细胞分为6组:对照组、添加白藜芦醇高、中、低(R^-5、R^-6、R^-7)3种浓度组及白藜芦醇和褪黑素联合添加组(R^-5M^-5、R^-6M^-7),通过电转效率和细胞凋亡情况确定电转体系优化方案;通过对细胞周期、线粒体膜电位及活性氧(ROS)的检测研究其作用机制。将绵羊卵母细胞分为对照组及白藜芦醇和褪黑素(R^-5M^-5、R^-6M^-7)联合添加组,通过绵羊卵母细胞体外成熟后卵丘细胞扩展、第一极体排出及体外受精胚胎的卵裂率检测其对卵母细胞体外成熟的作用。研究结果显示,分离的绵羊胎儿成纤维细胞P3代增殖旺盛,细胞生长曲线呈典型的S型;与对照组相比,所有试验组胎儿成纤维细胞的电转效率均显著提高(P<0.05),R^-5M^-5组电转效率最高;R^-6M^-7组显著降低细胞凋亡率(P<0.05),R^-5、R^-6、R^-5M^-5和R^-6M^-7组均显著促进细胞增殖(P<0.05);R^-6、R^-7、R^-5M^-5和R^-6M^-7组G1期细胞增加,S期细胞相对减少,但差异均不显著(P>0.05);R^-6、R^-7、R^-5M^-5和R^-6M^-7组成纤维细胞内ROS水平均显著降低(P<0.05),R^-6、R^-5M^-5和R^-6M^-7组线粒体膜电位均显著增加(P<0.05);R^-6M^-7组显著促进绵羊卵丘细胞扩展、提高卵母细胞第一极体排出率和体外受精胚胎发育能力(P<0.05)。综上,白藜芦醇和褪黑素可以优化绵羊胎儿成纤维细胞电转体系,提高卵母细胞体外成熟效率,为白藜芦醇和褪黑素在转基因动物生产中的应用提供参考依据。     

牛胎儿皮肤成纤维细胞的分离培养及转染Ipr1基因

为了为核移植提供供体细胞,本研究构建了真核表达载体PEGFP-SRA-Ipr1,并研究了牛胎儿皮肤成纤维细胞的体外分离培养,进行了Ipr1基因转染.克隆Ipr1基因和SR-A启动子,并构建了巨噬细胞特异性真核表达载体.用组织块贴壁法分离培养牛胎儿皮肤成纤维细胞,在体外经传代、纯化后,用电穿孔法将真核表达载体PEGFP-SRA-Ipr1转染至经体外纯化的第4～10代牛胎儿成纤维细胞,24 h后观察荧光表达,48 h后加入600μg·mL-1 G418,筛选1周,300 p.g·mL-1持续筛选,然后挑选单克隆,继续扩大培养.对稳定转染的牛胎儿成纤维细胞进行PCR检测和核型分析.结果,转染24 h后有绿色荧光蛋白表达,并经G418筛选获得稳定转染PEGFP-SRA-Ipr1的牛胎儿成纤维细胞株,经PCR检测在大约1500 bp处有目的片段,经流式细胞仪分析转染细胞染色体倍型未发生变化,仍是二倍体.说明目的基因已经成功整合,同时保持了遗传稳定性.可以作为核移植进行转基因克隆牛研究.     

利用CRISPR/Cas9技术制备敲除Myostatin基因牛胎儿成纤维细胞株

CRISPR/Cas9系统作为第3代人工核酸内切酶,是一种具有广阔应用前景的基因定点修饰工具。肌肉生长抑制素(Myostatin,MSTN)基因能够负向调节肌肉的生长,影响动物的产肉量。为了获得MSTN基因敲除的细胞株,给转基因动物的制备提供材料,试验利用CRISPR/Cas9系统的不同类型的表达载体对牛MSTN基因外显子序列随机设计靶位点,利用T7核酸内切酶I(T7EI)从中挑选出敲除效率最高的靶位点的表达载体,在无筛选标记条件下对牛胎儿成纤维细胞进行基因敲除。结果表明:经过长时间培养获得了基因敲除的细胞株。说明CRISPR/Cas9技术用于基因敲除方面的研究应用前景广阔。     

转乳铁蛋白肽和α干扰素基因的牛胎儿成纤维细胞的制备

旨在构建含有乳铁蛋白肽基因和a干扰素基因的载体,并制备转基因牛胎儿成纤维细胞,为研制抗乳房炎和口蹄疫转基因克隆牛提供供体细胞.本研究构建了由山羊β-酪蛋白启动子启动的牛乳铁蛋白肽基因和由CMV启动子调控的人α干扰素基因的载体,以EGFP基因作为报告基因,neo基因作为筛选基因;分别采用脂质体和电击法转染牛胎儿成纤维细胞,G418筛选得到转基因阳性细胞,并用PCR方法检测转基因细胞中目的基因的整合情况,用Western blotting检测α干扰素蛋白的表达.结果,得到了同时含有牛乳铁蛋白肽基因和人α干扰素基因的转基因牛胎儿成纤维细胞,并且α干扰素蛋白在转基因细胞中能有效表达.     

表达靶向牛病毒性腹泻病毒shRNA的绵羊胎儿成纤维细胞的制备和鉴定

为了获得具有抗牛病毒性腹泻病毒(BVDV)能力的绵羊胎儿成纤维细胞,采用组织块和酶消化法分离培养绵羊胎儿成纤维细胞,利用脂质体转染法将shRNA转基因表达载体转染绵羊胎儿成纤维细胞,经抗性筛选获得抗性细胞克隆,利用PCR方法对获得的细胞克隆进行鉴定,用BVDV侵染转基因细胞,利用real-time PCR和病毒滴定测定法分析不同细胞克隆抑制BVDV复制的能力。结果显示:试验成功构建了靶向BVDV表达shRNA的转基因表达载体pNeo-2loxp-u6-sh BVDV,经抗性筛选共获得22个抗性细胞克隆;22个细胞克隆中12个细胞克隆含有目的基因,为转基因细胞,其中5个转基因细胞克隆具有明显的抗BVDV复制的能力,最高抗病毒效率达到90.7%。结论:在细胞水平能有效抑制BVDV病毒增殖的转基因绵羊胚胎成纤维细胞的获得,为进一步利用体细胞核移植技术制备转基因绵羊提供了合适的供体细胞。     

FDFT1基因shRNA和过表达载体的构建及在牛胎儿成纤维细胞中的验证

构建了带有绿色荧光标记的法尼基二磷酸法尼基转移酶1(farnesyl-diphosphate farnesyltransferase 1,FDFT1)基因shRNA干扰载体以及过表达载体,将其转染牛胎儿成纤维细胞(bovine fetal fibroblasts,BFF),采用荧光定量PCR和Western blot的方法,检测FDFT1基因mRNA和蛋白的表达水平,在细胞水平验证了shRNA干扰载体的干扰效率和过表达载体的有效性。结果显示:shRNA组FDFT1-Bos-520的FDFT1基因mRNA表达水平降低至shRNA NC组的40.7%(P0.01),蛋白质表达水平降低至shRNA NC组的39.61%(P0.01);而FDFT1基因pBI-CMV3-FDFT1过表达组FDFT1基因mRNA的表达水平为pBI-CMV3空载体组的137.9倍(P0.01),蛋白表达水平升高至空载体组的2.34倍(P0.01)。本试验通过荧光定量PCR和Western blot的检测方法验证了FDFT1基因过表达载体及干扰载体转染BFF后,FDFT1基因表达量的变化,为进一步研究FDFT1基因对胆固醇代谢和脂质代谢的影响和作用机制提供了实验材料及分子依据。     

固醇调节元件结合蛋白基因的过表达对促进牛胎儿成纤维细胞脂肪形成的影响

为了研究固醇调节元件结合蛋白(sterol regulatory element binding factor 1,SREBP1)基因的表达与细胞脂肪形成的关系,本研究构建了pEGFP-C1-SREBP1重组质粒,利用脂质体介导法将重组质粒pEGFP-C1-SREBP1及pEGFP-C1空质粒转染至牛胎儿骨骼肌成纤维细胞培养48 h,实时荧光定量PCR和Western blotting分析目标基因表达水平的变化,并采用油红O染色检测细胞内脂滴。结果发现,pEGFP-C1-SREBP1重组质粒转染细胞内SREBP1 mRNA的表达水平显著高于空白对照组和阴性对照组(P<0.05);SREBP1蛋白也出现明显上调;空白对照组和pEGFP-C1阴性对照组细胞内均未见有红染细胞,而pEGFP-C1-SREBP1重组质粒转染组中出现了清晰的红染细胞。说明SREBP1的表达可促进牛胎儿骨骼肌成纤维细胞脂肪合成,证实牛胎儿成纤维细胞中SREBP1表达和脂滴形成之间存在直接关系。     

牛肿瘤坏死因子样凋亡微弱诱导剂及其受体成纤维细胞生长因子诱导早期反应蛋白14的分子结构与特性研究

本试验分离了编码肿瘤坏死因子样凋亡微弱诱导剂(TWEAK)及其受体成纤维细胞生长因子诱导早期反应蛋白14(Fn14)的全长cDNA,用生物信息学分析其基因结构、功能、进化关系、并预测其结合位点及三维结构。实时定量PCR(Q-PCR)结果发现,TWEAK和FN14在牛的多种组织中为组成型表达。用酵母双杂交对牛TWEAK和Fn14的相互作用进行了分析,结果发现,TWEAK-FN14通路在进化上高度保守。这将有助于开展TWEAK/Fn14系统在这个重要动物模型中的生物学作用的研究从而对TWEAK和Fn14家族的分子进化进行更深入的了解。