砂生槐根瘤内生细菌多样性及其促生潜力研究

以珍稀植物砂生槐为材料,对该植物根瘤内生细菌种群组成及其促生潜力进行研究,为砂生槐在荒漠化地区生态恢复与重建中的应用提供理论依据。采用YMA培养基通过平板涂布分离法分离内生细菌,通过16S rDNA序列同源性分析其遗传多样性,采用溶磷圈和钼锑抗比色法测定溶磷能力,Salkowski比色法测定IAA分泌量,微量凯氏定氮法测定固氮量。结果表明,从砂生槐根瘤中分离到19株代表性内生细菌,分别属于芽孢杆菌属(Bacillus)、解糖假苍白杆菌(Pseudochrobactrum)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、沙雷氏菌属(Serratia)和普罗威登斯菌属(Providencia)等5个属,其中芽孢杆菌属为优势菌属。在19株供试细菌中,7株具有良好的溶解无机磷能力,溶磷量达到100 mg/L以上;6株菌株具有良好的溶解有机磷能力,溶磷量达到42 mg/L以上;5株菌株具有良好的固氮能力,固定氮量达44 mg/L以上;3株菌株具有良好的IAA分泌能力,IAA分泌量达45μg/mL以上。利用种子发芽指标测定高溶磷菌株的促生能力,其中菌株R24能明显提高砂生槐种子的萌发率。综上,西藏砂生槐根瘤内生细菌遗传多样性丰富,且具有良好促生能力,是重要的生物资源。     

2株蓝莓溶磷内生真菌的筛选、鉴定及溶磷效果评价

从蓝莓植株内生真菌中筛选出具有溶磷、耐盐功能的菌株,为研究和评价其溶磷效果,采用固体溶磷圈法,根据是否产生溶磷圈来筛选蓝莓溶磷内生真菌,选取具有溶磷圈的真菌进行经典形态学和内源转录间隔区(ITS)序列分析和鉴定;采用液体培养法测定发酵液的有效磷含量及pH值;采用超高效液相色谱仪测定有机酸的种类及其含量,分析菌株的溶磷机制;采用固体培养法,设置不同NaCl浓度梯度用于分析蓝莓溶磷内生真菌的耐盐性。经形态学和分子生物学鉴定,菌株G14为烟管菌(Bjerkandera adusta)、菌株FG54为阿达青霉(Penicillium adametzii)。菌株FG54于5 d后有效磷含量最高,达到587.315μg/mL,菌株G14于5 d后有效磷含量最高,达到523.730μg/mL。通过对2株菌株有机酸的测定,发现该菌株的溶磷能力主要通过自身分泌的丙二酸、甲基丙二酸和柠檬酸等有机酸降低菌株发酵液的pH值,从而达到溶解磷的效果。同时,菌株FG54能较好的适应不同含量氯化钠浓度,在较高浓度的氯化钠培养基中也能生长。在氯化钠低浓度情况下,菌株G14生长速度较快,FG54生长较慢。通过筛选得到了2...     

溶磷内生菌的筛选鉴定及其对薏苡生长发育的影响

【目的】筛选具有溶磷能力的薏苡内生细菌并明确其类型,为后续研制生物菌肥提供优良菌株资源。【方法】以播种25 d的薏苡幼苗为试验材料,采用研磨稀释涂板法从薏苡的根、茎、叶中分离筛选具有溶磷能力的薏苡内生菌,探索该类菌溶解有机磷、无机磷、分泌磷酸酶的能力;通过盆栽试验探究溶磷内生菌对薏苡幼苗的促生长作用。【结果】筛选到溶解有机磷细菌8株,溶解无机磷细菌5株。其中,编号为R24的菌株溶解有机磷能力最强,摇瓶5 d后,上清液可溶性磷含量为37.20 mg·L^-1;编号为L21的菌株溶解无机磷能力最强,摇瓶5 d后,上清液可溶性磷含量为62.93 mg·L^-1。2株溶磷菌及等比例混合菌液能够促进盆栽薏苡的株高、茎粗、分蘖数,促生长能力从大到小为：L21>R24>混合菌液[V(R24)∶V(L21)=1∶1]。通过16S rDNA序列鉴定,R24为短小芽孢杆菌,L21为贝莱斯芽孢杆菌。【结论】溶磷菌L21和R24对薏苡生长有显著促进作用。     

草地早熟禾根际磷细菌效能测定

利用选择性培养基从草地早熟禾(Poa pratensis)根际土壤中筛选到7株无机磷细菌(phosphate solubilizing bacteria)和8株有机磷细菌(organic phosphate solubilizing bacteria)进行磷细菌溶磷定性判断和磷细菌溶磷量测定。结果表明,从草地早熟禾根际筛选得到的无机磷细菌菌株及有机磷细菌菌株均表现出一定的溶磷能力,溶磷量分别为17.05~62.37μg/mL、15.23~57.28μg/mL,其中无机磷细菌菌株PM2、PM3以及PM5溶磷量较高,有机磷细菌菌株PO2、PO3、PO6、PO7溶磷效能较强。这些菌株在后续微生物菌肥研制中具有较大潜力。     

茅苍术叶片可培养内生细菌多样性及其促生潜力

对江苏省道地药材茅苍术叶片可培养内生细菌的多样性及其固氮、解磷、解钾、产生长素的能力进行研究.依据菌落形态的不同,共分离得到52株内生细菌.能正常传代培养的45株内生细菌经ARDRA分析后归入14个聚类簇,簇内菌株的BOX-PCR指纹图谱相似度不高,在属水平上显示出茅苍术内生细菌丰富的多样性.各聚类簇代表菌株16S rDNA的序列分析表明分离得到的内生细菌与泛菌属、微杆菌属、短杆菌属、农杆菌属、假单胞菌属、芽孢杆菌属细菌亲缘关系相近,优势内生细菌与假单胞菌属细菌亲缘关系相近.45株能正常传代培养的内生细菌中,有10株能够在无氮培养基上正常生长,具固氮潜力.使用nifH基因通用引物对其基因组进行扩增后,除ALEB 33外,其它9株内生细菌均可获得与nifH基因片段大小相近的条带.分别使用NBRIP培养基和蒙金娜有机磷培养基筛选后获得19株和15株能够溶解磷酸钙和卵磷脂的内生细菌,其中ALEB 43溶解无机磷的能力最强,达(251.43±6.55) mg/L;ALEB 4A溶解有机磷的能力最强,达(23.63±1.46) mg/L.部分内生细菌溶解无机磷的能力与其产酸能力呈正相关,而菌株溶解有机磷的能力却无此相关性.通过硅酸盐培养基的筛选,获得具有解钾潜力的菌株24株.43株内生细菌能够将色氨酸转化为生长素,其中ALEB 44产生长素的能力最强,达(268.44±10.12) μg/mL.本研究首次揭示了江苏省道地药材茅苍术体内丰富的内生细菌资源及其促生长潜力,对进一步阐述茅苍术与内生菌之间的相互关系具有重要意义.     

2株番木瓜根际促生菌的解磷解钾作用

用平板涂布、划线与固体平板-透明圈法从番木瓜根际土壤中筛选出2株解磷解钾细菌(PK-1、PK-2)。通过摇瓶培养,测定PK-1、PK-2发酵液中水溶性磷、水溶性钾含量和磷、钾总量;分析PK-1、PK-2解磷解钾能力;对PK-1、PK-2进行分子鉴定。结果表明,PK-1溶解无机磷能力的溶量为1.63μg/m L,PK-2溶量为17.26μg/m L,溶解无机磷能力表现为PK-1﹤PK-2,即PK-2具有更强的解无机磷能力;PK-1溶解有机磷能力的溶量为8.49μg/m L,PK-2溶量为2.38μg/m L,溶解有机磷能力表现为PK-1PK-2,即PK-1的解有机磷能力更好;PK-1溶解钾能力的溶量为8.15μg/m L,PK-2溶量为8.49μg/m L,溶解钾能力表现为PK-1﹤PK-2,PK-1和PK-2的解钾能力接近。经16S r DNA序列分析,初步鉴定PK-1为肠杆菌属(Enterobacter),PK-2为芽孢杆菌属(Bacillus)。供试菌株PK-1和PK-2具有良好的解磷解钾功能,可为进一步研制专用的番木瓜微生物肥料提供菌种资源和依据。     

溶磷细菌筛选及对复垦土壤磷素有效性的评价

【目的】为了评价溶磷微生物对提高复垦土壤有效性的作用.【方法】通过PVK平板稀释法从石灰性土壤中分离筛选出7株溶磷细菌,7株菌株的溶磷能力在296.5～563.5 mg/kg之间,菌株的溶磷能力与溶磷圈直径(D)/菌落直径(d)的比值呈显著正相关;16sRNA序列分析表明,W_1、W_6属于Enterobacter sp.,W_2、W_4属于Burkholderia sp.,W_3、W_5属于Rahnella sp.,W_7属于Fluorescent pseudomonas.选择W_1、W_3、W_4、W_7作为试验菌株,研究其对复垦土壤有效磷、磷酸酶及各形态无机磷含量的影响.【结果】溶磷细菌可以提高复垦土壤有效磷含量、降低pH、增加磷酸酶含量,与接种灭菌菌液处理相比,4株溶磷细菌对复垦土壤有效磷增加在0.30～3.72 mg/kg之间,降低pH 0.03～0.09之间,土壤碱性和酸性磷酸酶提高幅度在9.68～34.22 mg/kg和0.21～47.66 mg/kg;溶磷细菌不仅可以增加复垦土壤Ca_2-P、Ca_8-P、Fe-P、Al-P的含量,而且可以显著减少复垦土壤Ca_(10)-P,与接种灭菌菌液处理相比,4株菌株增加Ca_2-P、Ca_8-P、Fe-P、Al-P的范围分别在4.7%～33.8%、11.1%～26.0%、5.3%～24.1%、4.8%～30.0%,Ca_(10)-P的减少幅度在12.9%～14.9%,溶磷细菌对O-P影响不显著.【结论】溶磷细菌在提高复垦土壤磷素有效性方面发挥着重要的作用.     

产多糖溶磷细菌对难溶性Ca-P的活化特性

以肠杆菌EnHy-401、节杆菌ArHy-505、固氮菌AzHy-510和巨大芽孢杆菌P17为材料,比较了4种溶磷细菌在摇瓶培养条件下对不同难溶性Ca-P中的磷活化能力.结果表明,4种溶磷细菌均能促使难溶性Ca-P中的磷活化, 但3种产多糖的溶磷细菌(EnHy-401、ArHy-505、AzHy-510)对难溶性Ca-P的活化能力普遍强于不产多糖的溶磷细菌(P17),肠杆菌EnHy-401对Ca3-P、Ca8-P和Ca10-P中的磷活化率分别达61.53%、63.40%和4.32%.在产多糖的溶磷细菌中,有机酸和多糖均高的菌株活化磷的能力最高,3种产多糖的溶磷细菌活化难溶磷酸钙能力的大小顺序依次为肠杆菌EnHy-401、节杆菌ArHy-505、固氮菌AzHy-510.结果还表明,产多糖的溶磷细菌对难溶磷的活化作用是由分泌有机酸和多糖的协同作用实现的,多糖对磷的吸持推动了磷的溶解平衡向溶解方向移动,且该协同作用受胞外多糖持磷能力和环境中C/N的影响,单位体积发酵液中多糖持磷量与菌株的磷活化能力呈正相关.在本试验条件下,C/N值高时,多糖产量高,有机酸分泌多,活化磷的能力就强.同一菌株只有在最适于产有机酸和产多糖的C/N值下,才能表现出最佳的溶磷效果.     

1株溶磷真菌的分离鉴定及溶磷特性分析

【目的】对从长春市农安县西盐碱地土壤样品中筛选出的溶磷能力强的菌株进行溶磷特性研究,为盐碱地改良提供菌种资源。【方法】以160份采自长春市农安县西的盐碱土为样品,利用NBRIP培养基对菌株进行筛选,对筛选出的菌种P1通过形态学特征、培养特征和ITSrDNA序列分析进行鉴定,分析该菌株溶解磷酸钙、磷酸铝和磷酸铁的能力,通过L25(54)正交试验,以溶磷量为考察指标,碳源、氮源、pH和磷酸钙为考察因素,分析该菌株培养的最优条件,最后分析了该菌株利用硝酸盐的能力。【结果】从160份供试土壤中分离出307株溶磷菌,其中菌株P1生长表现最好。经鉴定菌株P1为绳状青霉(Penicillium funiculosum),其96h能将9cm培养皿内的白色无机磷固体培养基溶解至完全透明;在NBRIP液体培养基中培养168h,溶磷量可达1 064.21μg/mL。菌株P1对磷酸铝和磷酸铁有较好的溶解能力,最高溶磷量为96.02和15.34μg/mL;在磷酸钙、磷酸铝和磷酸铁的培养液中,菌株P1的溶磷量与pH值呈显著负相关。以可溶性淀粉为碳源、蛋白胨为氮源、初始pH值为7、底物磷酸钙用量为10g/L时,培养菌株P1的溶磷效果最好,溶磷量达1 276.75μg/mL。此外,菌株P1对硝态氮也有一定的利用能力,在以硝酸钠、硝酸钾为唯一氮源的液体培养基中培养168h后,使硝态氮含量分别下降了92.90和196.79μg/mL。【结论】从盐碱土中筛选到1株对难溶性磷酸盐有较强溶解能力、对硝态氮有一定利用能力的绳状青霉P1菌株,其具有良好的应用前景。     

一株溶磷解钾菌的分离筛选与鉴定

为获得具有高效溶磷解钾能力的菌株,采用选择性培养基从柑橘根部土壤中分离筛选具有溶磷解钾作用的菌株,通过液体培养法进一步比较筛选菌株的溶磷解钾能力,选择溶磷解钾能力强的菌株进行形态特征、生理生化特征、16S rDNA及gyrB基因同源性分析。结果表明,LW-1、LW-2、LW-3和LW-4这4株菌株具有解磷解钾作用;其中,LW-3的解磷解钾能力最强,其溶解无机磷量为19.06μg/mL,相对增加38.64%,溶解有机磷量为17.06μg/mL,相对增加28.57%,溶解钾量为33.59μg/mL,相对增加15.96%;经鉴定确定菌株LW-3为纺锤形赖氨酸芽孢杆菌LW-3,是理想的菌肥生产用菌株。     

分离自高寒牧草根际溶磷菌的溶磷动态

溶磷菌能增加土壤中磷元素的有效性,提高植物对磷素的利用率。本研究采用蒙金娜有机磷和PKO无机磷固体培养基,对高寒牧草燕麦(Avena sterilis)、披碱草(Elymus dahuricus)根际分离的14株溶磷菌进行平板培养,在观察菌落形态特征的基础上,采用溶磷圈对菌株的溶磷能力进行了动态测定。结果表明,供试菌株大部分颜色为灰白色和淡黄色,菌落中间突起,表面湿润圆滑,生长速度中等。培养期间,供试菌株对有机磷的溶磷能力随着培养天数的增加呈现出先增加后减少再增加的变化趋势,供试菌株对无机磷的溶解能力随着培养天数的增加逐渐增加。其中,菌株PYXP4、PYXP5、PYXP16、PYXP21、PYXY1具有较强的溶解有机磷的能力,菌株PWXP3、PWXP9、PWXP18具有较强的溶解无机磷的能力,这些菌株具有开发溶磷菌肥的潜力,其他特性有待进一步研究。     

一株烟草根际溶磷细菌的筛选鉴定及其培养基优化

溶磷微生物可以加速土壤磷素循环,促进植物生长,具有较好的应用前景。本试验以无机磷为唯一磷源的选择性培养基从烟田土壤中筛选具有溶磷功能的细菌,同时分别运用钼锑抗显色法、Salkowski显色法对其溶磷能力、产IAA能力进行检测。通过生理生化特征和16S r RNA测序对溶磷效果较好的菌株JP6进行鉴定。通过模拟试验验证JP6对土壤中有效磷释放的影响;运用单因子试验确定最佳碳源、有机氮源、无机氮源和无机盐,并通过正交试验进行培养基配比优化。结果显示:菌株JP6具有较好的溶磷能力,发酵液中有效磷含量为50.1 mg/L,同时该菌株具有产IAA能力,在R_2A培养基中分泌IAA含量为128.9μg/m L,通过生理生化和16S r RNA序列比对将JP6鉴定为阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae),在土壤中具有较好的溶磷作用,最佳培养基配比为在10%黄豆芽基础上1.5%葡萄糖,2%豆粕,0.5%NH_4Cl,0.5%Ca CO_3。     

盐碱地中溶磷真菌的筛选及培养条件优化

为缓解板结土壤中由于不溶性磷酸盐的积累过多对土壤造成的板结问题,从东北长期板结土壤中筛选出多株具有溶磷能力的溶磷真菌。通过解磷圈测量及钼蓝比色法对分别以磷酸钙、磷酸铝及磷酸铁为主的培养物中可溶性磷含量进行测定,获得了1株溶磷能力较大的菌株P10,其对磷酸钙、磷酸铝及磷酸铁的分解能力分别为250,13,31μg/m L,经分子生物学鉴定,该菌株为具疣蓝状菌(Vorte plave gljivice)。该菌的最佳碳源、氮源、p H及底物磷酸钙用量分别为蔗糖、大豆粉、p H 6.0及10 g/kg,优化后,可溶性磷含量达378μg/m L。     

流沙河流域土壤自生固氮菌数值分类及BOX-PCR研究

对分离自流沙河流域不同海拔高度土壤中的53株自生固氮菌,进行了数值分类及BOX-PCR分析。数值分析结果表明,供试菌株在碳、氮源的利用及抗逆性能等方面存在明显差异,表现出丰富的表型多样性,在82.6%相似水平处,所有供试菌株被分成17个表观群,其中第5和第12表观群最大,分别由9个和14个菌株组成,表明它们是该区域的优势自生固氮菌;BOX-PCR较好地揭示了不同菌株间的差异,供试菌株被划分成10个不同的遗传类群,聚群结果与数值分类有较好的一致性。     

流沙河流域土壤自生固氮菌数值分类及BOX-PCR研究

对分离自流沙河流域不同海拔高度土壤中的53株自生固氮菌,进行了数值分类及BOX-PCR分析。数值分析结果表明,供试菌株在碳、氮源的利用及抗逆性能等方面存在明显差异,表现出丰富的表型多样性,在82.6%相似水平处,所有供试菌株被分成17个表观群,其中第5和第12表观群最大,分别由9个和14个菌株组成,表明它们是该区域的优势自生固氮菌;BOX-PCR较好地揭示了不同菌株间的差异,供试菌株被划分成10个不同的遗传类群,聚群结果与数值分类有较好的一致性。     

玉米根际溶磷细菌的分离、筛选及溶磷能力研究

采用传统的微生物分离培养法,对玉米根际溶磷细菌进行分离,筛选出38株解无机磷菌株和35株解有机磷菌株,并发现无论是细菌总数,还是溶磷细菌总数,根际土壤都比非根际土壤要多.对筛选获得的73株菌株进行菌落形态观察发现,大多数菌落呈乳白色或黄色、形状不规则或近圆形、光滑黏稠、扁平、不透明、边缘不整齐.进一步利用钼锑抗比色法测定其溶磷能力,发现无机磷菌株溶解的有效磷含量与培养液pH之间存在显著的相关性,有机磷菌株则无明显相关.各菌株溶解磷酸钙和卵磷脂的能力差异较大.无机磷菌株和有机磷菌株对无机磷(磷酸钙)和有机磷(卵磷脂)的溶磷量分别为8.88～108.31和0.51～3.53 mg/L.菌株中SWJ1-4和SWJ3-1溶解无机磷能力较强,RYJ1-6溶解有机磷能力较强,且这3株菌株生长快、生长状况良好,在后续微生物菌肥研制中具有较大潜力.     

兼溶多种难溶磷的溶磷菌筛选及其对玉米幼苗生长的影响

采用固体平板和液体摇瓶实验,以自玉米根际分离获得的10株优良溶磷菌为材料,进一步筛选出4株兼具 较好利用Ga3(PO4)2,AlPO4,FePO4 和卵磷脂的溶磷菌株(P1,P17,P35,P21).4株溶磷菌对不同难溶磷的溶解能 力从大到小依次为Ga3(PO4)2、混合难溶磷>AlPO4、FePO4>卵磷脂.其中,菌株P21对混合难溶磷、AlPO4、 FePO4 以及卵磷脂的溶磷量(全磷、有效磷)均为最大,该菌株在上述各难溶磷培养液中的全磷分别为128.84, 30.23,27.20和6.79μg/mL,有效磷分别为90.27,25.03,21.47和6.53μg/mL,对Ca3(PO4)2 也能较好地溶解 (全磷85.07μg/mL、有效磷56.68μg/mL),表明在室内培养条件下,菌株P21对多种难溶磷的兼溶能力更为突 出.盆栽实验表明,与CK相比,4株溶磷菌均能显著提高玉米幼苗干物质量、可溶性糖和可溶性蛋白质量分数及 根系活力;可能受多种环境因素影响,菌株P21对幼苗的促生效应不及P17,P35菌株突出,表现出溶磷菌实际应 用的复杂性.     

云南省南苜蓿和天蓝苜蓿根瘤菌BOX-PCR分析

[目的]进行南苜蓿和天蓝苜蓿根瘤菌的BOX-PCR分析,为苜蓿高效固氮根瘤菌的筛选和接种剂的研究提供理论依据。[方法]采用boxAlR单引物对90株根瘤菌供试菌株及5株标准菌株进行BOX-PCR分析,并进行聚类分析。[结果]经过扩增得到了较多的条带,90株供试菌株共有31种BOX图谱类型。聚类分析结果显示,所有菌株在40％相似性水平上聚为一群;而在69％的相似性水平上,供试菌株可细分为7个遗传群,群1的菌株全部分离自云南省江川县路居镇天蓝苜蓿的根瘤,群3内的菌株都分离自德宏州盈江县的南苜蓿根瘤,并与标准菌株Enisfermeliloti USDA 1002^T聚在一群,在群4、5、6中,除SWF67340的宿主为南苜蓿外,其他菌株的宿主都为天蓝苜蓿,群7中,除SWF66320、SWF67343、SWF65116和SWF673704株菌的宿主为天蓝苜蓿外,其余菌株的宿主都为南苜蓿。[结论】供试菌株具有丰富的遗传多样性,BOX-PCR能够区分它们之间的差异;大多数菌株按宿主及采集地聚群,但也有交叉。     

一株溶磷黑曲霉的溶磷特性及溶磷机制初探

测定了溶磷黑曲霉ML4在不同的无机磷培养基摇瓶培养时pH的变化和磷浓度的变化。当以KH2 PO4 作为无机磷培养基的唯一磷源时,测试灭菌后的发酵液的溶磷能力,发现其溶磷量只有5 6 1.99mg/L。用液相色谱测定发酵液中有机酸的成分,发现发酵液中含有草酸、α-酮戊二酸等有机酸,分析得出:溶磷菌的溶磷机制除了有机酸的溶解作用外,还存在其他的溶磷机制,有待进一步探讨。     

中国北方地区甘草根瘤菌表型及遗传多样性研究

【目的】了解中国北方地区甘草根瘤菌的生物多样性。【方法】采用表型数值分类、16S rDNA PCR-RFLP分析和BOX-PCR指纹图谱分析的方法对北方地区的甘草根瘤菌进行表型、遗传多样性分析。【结果】供试菌株在数值分类聚类分析中约85％的相似水平上产生2个表观群，有11株菌未与已知参比菌株聚群。16S rDNA PCR-RFLP分析表明，供试的20株菌共产生14种遗传型，表现出丰富的遗传多样性。BOX-PCR指纹图谱分析进一步证明与甘草共生的根瘤菌的基因组也具有多样性。【结论】在中国北方地区与甘草共生的根瘤菌在Sinorhizobium、Rhizobium和Mesorhizobium属中均有分布。