双峰驼天然单域抗体库的构建及鉴定

重链抗体的可变区VHH是目前天然存在的具有完整功能的最小抗体分子片段,该抗体在基础研究、药物开发等领域应用前景极为广阔。为了构建双峰驼天然单域抗体库并对其进行初步鉴定,从5峰未经免疫的健康骆驼全血中分离淋巴细胞,提取其总RNA,之后反转录为cDNA,利用PCR技术扩增全套编码重链抗体可变区的基因序列,将经过回收并酶切纯化的VHH序列克隆到噬菌体载体上,电转化大肠杆菌TG1感受态细胞,共转化343次。结果表明,构建的双峰驼天然单域抗体库库容为4.4×10~7,转化阳性率为75%,多样性良好,体现为CDR3区碱基序列及长度存在显著差异。成功地构建了双峰驼天然单域抗体库,为今后从中筛选出具有应用价值的特异性单域抗体奠定了基础。     

骆驼天然单域重链抗体库的构建与鉴定

构建骆驼非免疫噬菌体抗体库,完成抗体库的鉴定。从未经免疫的健康骆驼的外周血淋巴细胞中提取总RNA后,特异性扩增骆驼重链抗体可变区(VHH)片段,将其与噬菌粒载体pCANTAB5E连接获得重组子,多次电转感受态大肠埃希菌TG1后获得VHH抗体基因库,并分析其库容量及多样性。结果表明,经过吸附-洗脱的淘选过程筛选出能够与莱克多巴胺人工抗原特异性结合的噬菌体展示纳米抗体。构建的骆驼天然重链单域抗体库的库容量为107,多样性良好,独立克隆所占比例为90%,筛选出针对莱克多巴胺人工抗原的噬菌体颗粒。已成功构建骆驼天然噬菌体重链抗体库,并筛选出抗莱克多巴胺的噬菌体颗粒,为抗莱克多巴胺纳米抗体的表达和莱克多巴胺的免疫学检测奠定基础,并为后续淘选针对特定抗原的单域重链抗体奠定了基础。     

牛骨骼肌酵母双杂交cDNA文库构建

为构建应用于酵母双杂交系统的牛骨骼肌cDNA文库,利用Trizol法提取牛骨骼肌总RNA,采用SMART技术PCR扩增合成cDNA第二链片段,并与文库线性载体pGADT7-Rec共转化酵母菌Y187构建酵母双杂交文库。结果显示文库容量达到1．7×10^7cfu／mL,插入片段主要在0．5～3kb范围内,文库重组率为80％。以上结果表明该文库质量好,能够通过筛选文库得到与目的蛋白相互作用的蛋白质。     

梨酵母双杂交cDNA文库的构建与鉴定

酵母双杂交是检测蛋白质之间相互作用的有效手段。构建梨酵母双杂交cDNA文库,能为利用酵母双杂交技术探究梨基因功能的互作机制提供技术支撑。本研究以沙梨主栽品种‘圆黄’梨的叶片和果肉为材料,采用Trizol法提取其RNA,利用SMART技术经LD-PCR合成全长cDNA,通过同源重组法与pGADT7载体连接,再电转化至大肠杆菌菌株。经检测,构建的cDNA文库滴度为1.76×108 cfu/mL,文库片段插入阳性率为100%,片段长度主要分布在600~1500 bp。该研究结果表明,构建的cDNA文库质量较高,完整性较好,能为后续利用酵母双杂交技术鉴定基因的互作蛋白奠定基础。     

利用SMART技术构建猪血管内皮细胞酵母双杂交cDNA文库

本研究旨在建立猪血管内皮细胞酵母双杂交cDNA文库,进而为研究猪瘟病毒的基因功能及致病机理提供良好的试验体系。体外培养猪血管内皮细胞,提取细胞总RNA,并用Oligotex mRNA Mini Kit纯化PolyA+mRNA,利用SMART技术合成双链cDNA(ds cDNA)。经CHROMA SPINTM TE-400Column纯化后的dsDNA与线性化的pGADT7-Rec共转化酵母感受态细胞Y187中,以同源重组的方式在酵母细胞内构建猪血管内皮细胞cDNA文库。结果获得的文库容量在6×106 CFU/mL,随机挑选24个克隆进行PCR检测,插入的片段大小集中在400² 000bp之间,平均插入长度为1 000bp左右,文库重组率为100%。本研究为从文库中高通量地筛选出与猪瘟病毒互作的重组子,即寻找与该病毒相互作用的受体蛋白奠定了坚实的基础。     

MDCC-MSB1细胞酵母双杂交cDNA表达文库的构建与鉴定

提取生长状态良好的MDCC-MSB1细胞的mRNA,以5'端标记有生物素的Oligo dT primer为引物反转录,合成双链后连接Adapter。分级纯化后,通过BP重组反应构建入门文库,滴度为1×10⁵ CFU/mL,文库总容量为1.1×10⁶ CFU,平均插入片段长度为1190 bp,阳性重组率为100%。入门文库扩增后提取质粒,通过LR重组反应转化为表达文库,平均滴度为1×10⁵ CFU/mL,文库总容量为1.2×10⁶ CFU,平均插入片段长度为1087 bp,重组率为100%。构建的表达文库具有较高的质量,为研究鸡传染性贫血病毒的受体及其细胞嗜性奠定了基础。     

采用双峰驼重链抗体特异的抗血清检测不同抗原免疫骆驼过程中血清重链抗体的水平

为了探究重链抗体在骆驼免疫保护中的生物学作用,本研究利用Protein G和Protein A亲和层析纯化新疆双峰驼血清中总IgG和重链抗体IgG2,并免疫昆明小白鼠制备抗双峰驼总IgG和抗双峰驼重链抗体IgG2的多抗血清;通过ELISA检测双峰驼在体液免疫应答过程中针对spaA-N、溶菌酶和蒜氨酸酶3种抗原的重链抗体的滴度变化。结果从新疆双峰驼血清中亲和层析纯化出天然重链抗体IgG2,蛋白质分子质量约为46 ku;免疫昆明小白鼠后获得抗双峰驼总IgG多抗血清的效价为1∶204800,抗双峰驼重链抗体IgG2多抗血清的效价为1∶6400。在spaA-N免疫骆驼诱导的体液免疫应答过程中,重链抗体IgG2出现延迟反应。3种蛋白均能诱导抗原特异的IgG2亚类重链抗体的产生。     

猪肺泡巨噬细胞酵母双杂交cDNA文库的构建与鉴定

为研究猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)与猪肺泡巨噬细胞(porcine alveolar macrophages,PAM)蛋白质间相互的作用,本研究使用SMART技术成功构建了猪肺泡巨噬细胞酵母双杂交cDNA文库。首先提取PAM总RNA,使用SMART RACE法经LD PCR合成双链cDNA,运用SMART技术,通过同源重组的方法将双链cDNA与pGADT7-Rec质粒共转化进酵母Y187感受态,再利用营养缺陷的方法在SD/-Leu平板上筛选阳性克隆,最终构建的文库滴度达到了6.96×10~7 CFU/mL,重组率初步计算达到95%,插入片段范围在200~2 000bp。本研究为PRRSV致病蛋白的筛选以及相关疾病的研究奠定了基础。     

瑟氏泰勒虫感染的牛外周血单个核细胞酵母双杂交cDNA文库构建及鉴定

为了研究牛瑟氏泰勒虫与牛外周血单个核细胞之间蛋白的相互作用,以自然感染瑟氏泰勒虫的牛外周血单个核细胞为材料,纯化并提取总RNA,应用SMART技术合成双链cD NA(ds cD NA)。利用纯化柱纯化ds cD NA,并与线性化的p GADT7-Rec共转化酵母菌Y187,以同源重组的方式在酵母细胞内构建牛外周血单个细胞的酵母双杂交cD NA表达文库。结果显示,文库容量为4.0×108CFU/mL,随机挑取单克隆进行菌落PCR检测,插入的双链cD NA片段大小集中在0.4~2.0 kb,文库重组率为95%。表明此文库达到要求,可用于酵母双杂交筛选。     

弓形虫酵母双杂交cDNA文库构建及与Rop38相互作用蛋白的筛选

为筛选与弓形虫棒状体蛋白38基因(Rop38)相互作用的宿主细胞蛋白,本研究利用MatchmakerTM Gold酵母双杂交系统,构建了人成纤维细胞(HFF)和人T细胞(CEM.NKR)的c DNA文库,以构建的p GBKT7-Rop38作为诱饵质粒,采用PEG/Li Ac法转化酵母菌株Y2H,利用表型筛选法检测Rop38的自激活作用并进行酵母双杂交筛选。结果表明,诱饵蛋白在酵母双杂交系统中无毒性和自激活作用,而且通过酵母双杂交筛选共获得29个与Rop38蛋白相互作用的宿主蛋白,其中HFF文库筛选到20个蛋白,CEM.NKR文库筛选到11个蛋白。本实验为进一步研究Rop38调节宿主细胞基因表达的信号通路奠定了基础。     

ST细胞酵母双杂交cDNA文库的构建及鉴定

为了筛选与猪细小病毒（porcine parvovirus,PPV）结构蛋白VP2相互作用的宿主蛋白,深入研究病毒入侵及致病的分子机制,本试验建立了ST细胞酵母双杂交cDNA文库。采用RNeasy Min Kit提取ST细胞的总RNA,反转录合成cDNA第一链之后,通过SMART技术合成了双链cDNA,并利用同源重组的方法,构建了ST细胞的酵母cDNA文库。结果显示,文库滴度为8.1×10⁸ CFU/mL,插入的双链cDNA片段大小为250~1 000 bp,平均大小约为500 bp,文库的重组率为96%。此文库可用于筛选与病毒相互作用的ST细胞宿主蛋白,为进一步阐明病毒的致病机制奠定了基础。     

环形泰勒虫TRAP-A蛋白酵母双杂交诱饵质粒的构建与鉴定

为了筛选出环形泰勒虫TRAP蛋白在虫体入侵媒介蜱唾液腺过程中相互作用蜱源蛋白,构建了能够用于酵母双杂交筛选系统的重组诱饵质粒pGBKT7-TRAP-A。本研究以环形泰勒虫裂殖体为材料,根据环形泰勒虫TRAP-A结构域的基因序列设计引物,经过PCR扩增获得576 bp的基因片段,将其连接到线性化载体pGBKT7上。经双酶切鉴定和序列分析以及重组诱饵质粒在酵母双杂交系统中的自激活、细胞毒性及其表达情况检测,结果显示,本研究成功构建了酵母双杂交重组诱饵质粒pGBKT7-TRAP-A,构建的诱饵质粒对Y2HGold酵母菌无自激活活性和细胞毒性,且构建的诱饵质粒pGBKT7-TRAP-A可以在Y2HGold酵母菌内正确表达。表明所构建的诱饵质粒pGBKT7-TRAP-A可以用于筛选小亚璃眼蜱唾液腺酵母双杂交c DNA文库,获得可能与环形泰勒虫TRAP-A蛋白相互作用的蜱源蛋白。     

鸭胚成纤维细胞酵母双杂交cDNA文库的构建与鉴定

为了解与坦布苏病毒(TMUV)E蛋白相互作用的宿主细胞蛋白,本试验制备鸭胚成纤维细胞(DEF)。采用Trizol法提取细胞总RNA,通过LD-PCR技术合成双链cDNA,经CHROMA SPIN TE-400column纯化后,与pGADT7载体连接,利用同源重组的方法克隆到Y187酵母感受态细胞,构建了鸭胚成纤维细胞的cDNA文库。结果显示:构建的文库滴度为3×107 CFU/mL,文库插入的双链cDNA片段为0.5~2.5kb,平均约为1.5kb,符合酵母双杂交筛选的要求。     

双峰驼IgM部分重链的原核表达及其多克隆抗体的制备

为获取双峰驼免疫球蛋白M(IgM)重链恒定区的表达产物及抗体,首先在GenBank找出收录的双峰驼IgM、IgA、IgE、IgG重链恒定区基因序列,比对IgM与IgA、IgE和IgG的氨基酸序列,选取一段差异较大的蛋白序列片段,转换成相对应的基因片段,PCR扩增选取的基因片段,插入pET-28a(+)载体构建重组载体,转化进大肠埃希菌BL21,并诱导重组蛋白表达,SDS-PAGE鉴定重组蛋白,后利用纯化的蛋白免疫家兔,制备抗血清,ELISA和Western blot鉴定获得的血清。结果显示,成功构建了载体pET-28a-IgM,诱导表达的目的蛋白分子质量为18.7 ku,与预期相符。ELISA方法检测抗血清效价为1∶32 000,Western blot结果显示该血清能特异性识别原核表达蛋白,说明双峰驼IgM兔抗血清的成功制备。     

基于酵母双杂交文库鉴定鸡PGCs形成过程中的关键泛素化修饰酶

试验拟筛选与C2EIP互作的蛋白,构建调节PGCs形成过程的泛素化E3连接酶复合体。通过逆转录和同源重组等方法构建鸡PGCs酵母文库;将C2EIP连入诱饵空载体pGBKT7中,并转化酵母感受态细胞进行诱饵载体(C2EIP-pGBKT7)的毒性和自激活检测;将酵母文库与诱饵载体菌液共培养后,通过涂板筛选阳性克隆并进行测序和生物信息学分析筛选互作蛋白。结果显示：成功构建了鸡PGCs酵母文库,其滴度为3.0×10⁶ cfu/mL,总库容为1.5×10⁷ cfu,且重组率为100%,符合筛库要求。成功构建无毒性和不能自激活的C2EIP-pGBKT7诱饵载体,能够用于后续的文库筛选。C2EIP-pGBKT7诱饵载体菌液与酵母文库共培养后,通过PCR测序与蛋白序列分析后共筛选了36个C2EIP的互作蛋白,其中RCJMBM04和CCDC174蛋白功能域分析发现分别具有典型的RING功能域和PPXY基序,进行的生物信息学分析发现WWP1和WWP2具有典型的WW功能域,能够与CCDC174结合。研究表明,试验成功鉴定了C2EIP/RCJMB04/CCDC174...     

猪小肠上皮细胞酵母双杂交cDNA文库的构建及鉴定

为了更系统的研究病毒在猪肠道内侵入及致病的分子机制,本试验以猪小肠上皮细胞(intestinal epithelial cells,IEC)为模型,应用RNeasy Min Kit从猪IEC中提取细胞总RNA,反转录后,利用SMART技术合成双链cDNA(ds-cDNA),通过同源重组的方法构建猪IEC酵母双杂交cDNA文库。结果显示,文库的滴度为8.4×10⁸ CFU/mL,插入的ds-cDNA片段大小为0.5~2.0 kb,平均长度约为1.1 kb,文库重组率为100%。此文库为筛选与猪腹泻病毒相互作用的宿主蛋白及进一步阐明病毒的致病机制奠定了基础,为研制有效的药物或疫苗提供了依据。     

绵羊卵巢组织细胞酵母双杂交cDNA文库的构建及鉴定

试验旨在构建绵羊卵巢组织细胞的cDNA文库,为进一步研究绵羊卵巢中蛋白互作机制提供工具。本研究以不同发情周期的绵羊卵巢组织为材料,利用TRIzol试剂提取绵羊卵巢组织细胞总RNA,应用SMART技术经过长链PCR(LD-PCR)合成双链cDNA(ds cDNA),通过CHROMA SPIN~(TM)+TE-400柱纯化得到ds cDNA,并与线性pGADT7-Rec共转化酵母Y187感受态细胞。用同源重组的方式,在酵母细胞内构建绵羊卵巢组织细胞酵母双杂交cDNA表达文库。结果构建了含有3×10~8个重组子的绵羊卵巢组织cDNA文库,插入片段长度多数为500～2 000 bp,重组率达96%,重组子中平均插入的片段长度为1 000 bp,文库滴度为2×10~7cfu/mL,符合建库标准。     

Vero E6细胞酵母双杂交cDNA文库的构建及鉴定

To seek out proteins which interact with structural proteins of porcine epidemic diarrhea virus （PEDV） in Vero E6 cells and study the mechanisms of viral infection.We created a Vero E6 cDNA yeast hybrid library. The total RNA of Vero E6 was extracted using Trizol method, and double strands cDNA was synthesized by SMART technique. We created a Vero E6 cDNA library by using homologous recombination in yeast. The results showed that the titer of cDNA library was 9.7×10⁸ CFU with the average of inserted fragments about 1.6 kb, and the recombination rate was 87%. These data indicated that the yeast two-hybrid cDNA library of Vero E6 was successfully constructed and might be useful for screening the host proteins interacting with structure protein of PEDV.