IFN-γ对羊驼皮肤黑色素细胞增殖和黑色素合成的影响

旨在研究IFN-γ对黑色素细胞增殖及黑色素合成的影响。不同浓度IFN-γ(0.0、0.5、2.0、8.0、16.0、32.0、64.0ng·mL-1)分别处理羊驼皮肤黑色素细胞24、48和72h。MTT法检测黑色素细胞活力,紫外分光光度法检测黑色素含量,qRT-PCR检测MC1R、TYR、TYRP1、MITF、DCT及NOS2mRNA水平的变化。结果显示,24h黑色素细胞活力受到抑制,72h细胞活力恢复且黑色素合成增强;IFN-γ可促进黑色素含量的增加,以32.0ng·mL-1 IFN-γ增加极显著。TYRP1、MITF、DCT、NOS2mRNA相对表达量显著增加(P0.05),MC1R、TYR mRNA相对表达量增加不显著(P0.05)。IFN-γ可促进黑色素细胞树突增长,可能有助于黑色素的转运;IFN-γ诱导黑色素的合成,可能与黑色素细胞中NOS2和MITF的高表达有关,可能通过NO/cGMP/PKG介导的信号通路合成黑色素。     

内皮素-1(ET-1)对羊驼皮肤黑素细胞增殖和黑素生成的影响

旨在研究内皮素-1 (Endothelin-1,ET-1)对羊驼皮肤黑素细胞(Melanocyte,MC)增殖和黑素合成的影响.本研究中,体外培养正常羊驼皮肤黑素细胞,观察不同浓度ET-1(0、0.1、1、10、100 nmol·L-1)对羊驼皮肤黑素细胞增殖、黑素含量、内皮素受体B(Endothelin recepter B,EDNRB)基因、酪氨酸酶(Tyrosinase,TYR)基因、酪氨酸相关蛋白-1(Tyrosinase related protein 1,TRP-1)基因和表皮黑皮素1受体(Melanocortin 1 receptor,MC1R)基因表达量的影响.结果表明,ET-1处理羊驼皮肤黑素细胞3d后,羊驼皮肤黑素细胞增多,黑素含量、EDNRB、TRP-1和TYR基因表达量都明显增加(P＜0.05),以10 nmol·L-1组最为显著.ET-1能诱导羊驼皮肤黑素细胞增殖、树突增长,诱导EDNRB、TYR和TRP-1基因表达量增高,使黑素合成增加；同时诱导MC1R基因表达量增高,从而通过α-MSH信号通路对羊驼黑色素的生成产生影响.     

CDK5对羊驼皮肤黑色素细胞TYR和MITF mRNA表达的调节

为了证实CDK5是否参与羊驼毛色的形成,本研究主要对CDK5在羊驼黑色素细胞中调节TYR和MI TF的表达进行了研究.本研究首先采用免疫组织化学方法检测CDK5在羊驼皮肤黑色素细胞中的定位,再通过脂质体将CDK5转染于羊驼皮肤黑色素细胞,之后通过Western blot和qRT-PCR的方法检测转染后黑色素细胞中CDK5蛋白、TYR和MITF mRNA的表达.免疫组化结果显示CDK5位于黑色素细胞的胞质和细胞核内;Western blot结果显示转染组黑色素细胞中CDK5蛋白表达量明显高于对照组;qRT-PCR结果显示CDK5可下调MITF的表达,同时上调TYR的表达,转染组黑色素细胞中MITF和TYR mRNA的表达水平分别是对照组细胞的0.264 9和3.931 3倍.结果揭示CDK5可能通过调节黑色素细胞核中TYR和MITF mRNA的表达,从而参与调控羊驼毛色形成.     

酪氨酸酶转运对黑色素生成影响研究进展

哺乳动物毛色的形成依赖于黑色素细胞中黑色素数量及分布比例,酪氨酸酶类(TYR/TYRP1)的转运及其活性是黑色素合成的关键。衔接蛋白(AP-1/3)和溶酶体相关细胞器生物合成复合物(BLOC-1,2,3)将TYR/TYRP1从早期核内体转运至黑素小体,若TYR/TYRP1无法转运至黑素小体中,黑色素合成则会受到抑制。ATP7A将铜离子转移到TYR/TYRP1,从而激活TYR/TYRP1活性,ATP7A的减少同样会使黑色素细胞中黑色素合成量减少。关注这些复合物在转运TYR/TYRP1的作用及影响其活性的因素,可以从不同的角度解析黑色素合成机理,以此为基础探索哺乳动物毛色的淡化机制,以期为阐明人类黑色素合成障碍的相关疾病提供理论依据。     

内皮素3对小鼠黑色素沉着相关基因表达的影响

试验旨在探究内皮素3(endothelin 3,EDN3)在不同毛囊时期小鼠皮肤中是否存在差异表达及其对黑色素细胞黑色素沉着相关基因表达的影响。通过RT-PCR技术对EDN3、EDNRB在不同毛囊时期小鼠皮肤的表达情况进行定量分析发现,EDN3和EDNRB在小鼠不同毛囊时期皮肤样品中均有表达,在毛囊生长初期和中期小鼠皮肤中EDN3 mRNA表达量是末期的2.18倍(P0.05)和1.15倍(P0.05),毛囊生长初期和中期EDNRB mRNA表达量是末期的16.8倍(P0.01)和9.9倍(P0.01)。为了进一步揭示EDN3在黑色素细胞色素沉着中的重要作用,通过细胞转染技术使小鼠黑色素细胞过表达EDN3并测定其黑色素含量及色素沉着相关基因的表达水平发现,与空载组相比,体外转染EDN3的黑色素细胞黑色素含量明显增加。此外,MITF mRNA显著降低(P0.05);TYR、TYRP2、EDNRB、c-Kit和EDN1 mRNA显著升高2.04倍(P0.05)、1.44倍(P0.05)、1.41倍(P0.05)、5.21倍(P0.01)和3.27倍(P0.01)。MITF蛋白水平显著降低(P0.05),TYR、TYRP2、EDNRB和c-Kit蛋白水平显著升高1.48倍(P0.01)、4.61倍(P0.01)、1.27倍(P0.05)和2.64倍(P0.01)。综上所述,EDN3在不同毛囊时期小鼠皮肤中均可有效表达,且表达量存在显著差异。黑色素细胞中过量表达EDN3,使色素沉着相关基因的表达量及黑色素含量增加。     

小鼠黑色素细胞沉默及过表达色素上皮衍生因子对黑色素合成的影响

旨在研究色素上皮衍生因子(pigment epithelium-derived factor, PEDF)与黑色素合成调控因子之间的互作关系，探索PEDF对黑色素细胞活力和黑色素合成的调控作用，为研究动物毛色形成机制提供基础。本研究将PEDF siRNA及PEDF过表达载体分别转染小鼠黑色素细胞，对黑色素细胞活力、黑色素含量进行检测，采用qRT-PCR、Western blotting及细胞免疫荧光对PEDF、Wnt1、Wnt3α、MITF和β-catenin的表达和定位进行检测。黑色素细胞PEDF沉默后，黑色素细胞的细胞活力增强，黑色素含量增加，Wnt1、Wnt3α、MITF和β-catenin的mRNA和蛋白表达量升高；黑色素细胞PEDF过表达后，黑色素细胞活力减弱，黑色素含量减少，Wnt1、Wnt3α、MITF和β-catenin的mRNA和蛋白表达量降低。细胞免疫荧光结果显示：PEDF、Wnt1、MITF、β-catenin表达于黑色素细胞的细胞质；Wnt3α表达于黑色素细胞的细胞质和细胞膜。本研究证实：PEDF使黑色素细胞活力减弱，可通过下调促黑色素生成相关的因子Wnt1、W...     

过表达miR-193b对黑色素细胞中MITF和TYR表达的影响

旨在探讨miR-193b对黑色素生成关键基因MITF和TYR表达的影响,进而说明miR-193b对黑色素形成的影响。本研究通过细胞转染技术,在绵羊黑色素细胞中过表达miR-193b,检测黑色素细胞中黑色素含量的变化,采用实时荧光定量PCR和Western blot分别对转染细胞中MITF和TYR mRNA和蛋白表达水平进行测定。结果显示:过表达miR-193b的黑色素细胞,黑色素含量明显减少;MITF mRNA和TYR mRNA表达均显著降低(P0.01),分别降低0.233倍和0.198倍;MITF和TYR蛋白表达量也显著降低(P0.01),分别降低0.232倍和0.321倍。本研究表明,过表达miR-193b使黑色素细胞中MITF和TYR表达量降低而间接影响黑色素生成。     

α-黑素细胞刺激素对泰和乌骨鸡皮肤黑色素细胞增殖及黑色素合成的影响

旨在研究α-黑色素细胞刺激素(α-melanocyte stimulating hormone,α-MSH)对泰和乌骨鸡皮肤黑色素细胞增殖和黑色素生成的影响,初步探讨α-MSH调控泰和乌骨鸡黑色素合成的机制。利用体外培养的乌骨鸡皮肤黑色素细胞,观察不同质量浓度α-MSH(0、2.5、5、10 mg/L)及其拮抗剂([D-Trp7,Ala8,D-Phe10]α-MSH(6-11)-amide,D-AD-MSH)处理后黑色素细胞增殖、黑素皮质素受体1(melanocortin 1receptor,MC1R)基因表达、酪氨酸酶(tyrosinase,TYR)活性、环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)含量和黑色素含量的变化。结果表明,不同质量浓度的α-MSH对细胞有促增殖的作用,2.5mg/Lα-MSH处理组细胞的增殖率极显著高于不添加α-MSH的对照组(P0.01)。α-MSH剂量依赖性地提高MC1R基因表达。2.5mg/Lα-MSH处理组细胞cAMP的含量显著高于对照组(P0.05),其他处理组之间差异不显著(P0.05)。不同浓度的α-MSH处理均极显著提高细胞TYR活性(P0.01或P0.05)。与对照组相比,2.5mg/Lα-MSH极显著提高皮肤黑色素细胞的黑色素含量(P0.01),5、10.0mg/Lα-MSH具有提高黑色素细胞黑色素含量的趋势(P0.05)。α-MSH拮抗剂D-A-D-MSH预处理乌骨鸡皮肤黑色素细胞显著抑制α-MSH对黑色素细胞MC1R基因表达、cAMP含量、TYR活性和黑色素含量的上调作用(P0.05)。α-MSH能促进泰和乌骨鸡皮肤黑色素细胞增殖,提高MC1R基因表达、cAMP含量以及TYR活性并进而促进黑色素合成。     

miR-186-5p与α-MSH互作对绵羊黑素细胞黑色素生成的影响

黑色素合成受多种基因和miRNAs的调控,为了研究miR-186-5p与α-MSH协同作用对绵羊黑素细胞黑色素生成的影响。本研究在绵羊黑素细胞中转染miR-186-5p表达载体,同时添加α-MSH,通过实时荧光PCR (quantitative real time polymerase chain reaction, qRT-PCR)和蛋白质免疫印迹(Western blotting)检测MITF、TYR、TYRP1和TYRP2 4种可能与之相关的基因表达情况;利用免疫组化检测MITF蛋白在黑素细胞中的表达和亚细胞定位;通过分光光度法测定黑色素含量变化;利用划痕试验测定细胞迁移情况,试验分为miR-186-5p转染组、miR-186-5p+α-MSH互作组和对照组,每组3个重复。结果显示,miR-186-5p能够抑制绵羊黑素细胞中MITF、TYR、TYRP1和TYRP2的表达,并最终抑制黑色素的生成。而添加α-MSH能缓解miR-186-5p对MITF、TYR、TYRP1和TYRP2表达的抑制作用,进而在一定程度上恢复黑色素的含量。另外,miR-186-5p还能抑制细胞分裂,并阻碍细胞的迁移,而α-MSH无法抵消miR-186-5p产生的这种负面影响。上述结果表明,在绵羊黑素细胞中,miR-186-5p和α-MSH均参与调控黑色素合成途径,其中,miR-186-5p主要起负调控作用,而α-MSH主要参与相关位点的正调控,并能部分恢复miR-186-5p导致的黑色素含量下降。值得注意的是,miR-186-5p还参与调控细胞的增殖和迁移,而α-MSH不参与相关调控。     

TYR基因及其与动物毛色关系的研究进展

毛色是毛皮动物重要的品种特征之一,是一种易于观察的表型性状。黑色素对动物毛色的形成起至关重要的作用。在动物体内酪氨酸在酪氨酸酶(TYR)的催化作用下,经由DOPA、多巴醌、吲哚醌等形式最后生成黑色素。动物毛色的形成主要与黑色素细胞中合成的两种色素(真黑色素、褐黑色素)比例有关。黑色素细胞中色素的合成受多个基因和信号通路调控。动物毛色之所以具有多样性,也是由于这些基因调控所致。在众多的调控基因中,其中目前研究较多的主要有黑素皮质素受体1(MC1R)、剌鼠信号蛋白基因(ASIP)、TYR家族(TYR、TYRP1、TYRP2)等,各基因间相互作用形成不同的毛色。文章简要介绍黑色素形成的机理及概况,重点对TYR基因结构和功能及其在多种动物毛色方面的研究现状进行综述,以便为动物毛色选育提供理论依据。     

羊驼酪氨酸酶基因家族在不同毛色个体中的基因表达水平

黑色素对动物毛色的形成起重要作用,酪氨酸酶基因家族成员参与了黑色素的合成。为了探索羊驼酪氨酸酶基因家族的基因表达与其毛色之间的相关性,本研究利用实时荧光定量PCR技术分析了不同毛色羊驼酪氨酸酶基因家族成员TYR、TRP1和TRP2的相对基因表达量。研究结果显示：棕色羊驼中的TYR、TRP1和TRP2的mRNA相对表达量经内参基因校正后分别是白色羊驼中的13.669倍、3.417倍和8.593倍。结论表明棕色羊驼中酪氨酸酶基因家族3种成员的基因表达水平均高于白色羊驼,揭示了羊驼TYR基因家族成员的基因表达量与其毛色表型具有相关性。     

Nkx2-5基因的克隆及其与黑色素细胞黑色素生成相关性的研究

本实验旨在探究Nkx2-5基因在小鼠黑色素细胞中是否表达,同时通过生物信息学的方法预测其是否与调控黑色素生成的基因有相互作用。结果表明:转录因子Nkx2-5在小鼠黑色素细胞中表达,其编码的蛋白作为转录因子与下游基因作用的主要位点在144~196位氨基酸残基处,且其在黑色素生成中的关键基因MITF、TYR、TYRP1、TYRP2的启动子中都有作用位点,同时Nkx2-5蛋白与对神经嵴分化有重要影响的Hand1、Hand2存在相互作用,故可以推测转录因子Nkx2-5在黑色素细胞的黑色素生成中发挥着重要的作用,进而为从分子水平解释动物被毛白化的发病机理提供新的思路。     

microRNA-146a通过靶向MAPK4和Myosin Va基因调控羊驼黑色素细胞增殖、迁移

旨在研究microRNA-146a(miR-146a)对羊驼黑色素细胞增殖和迁移的调控及其分子机制。本研究使用双荧光素酶试验验证MAPK4和Myosin Va是miR-146a的靶基因;利用荧光定量PCR和蛋白质免疫印迹试验检测在羊驼黑色素细胞中过表达miR-146a对相关下游基因表达的影响;利用CCK8和Transwell检测miR-146a过表达对羊驼黑色素细胞增殖和迁移的影响。结果显示,与对照组相比,将miR-146a和MAPK4或Myosin Va共转染293T细胞,双荧光素酶活性分别极显著下降36%和30%(P<0.001);MAPK4和Myosin Va基因转录水平分别极显著下调67%和47%(P<0.001,P<0.01);蛋白质水平的表达量分别显著或极显著下调38%和69%(P<0.05,P<0.01);增殖和迁移相关的基因CREB、MITF、MLPH和Rab27a在转录水平和蛋白水平的表达均极显著下调(P<0.01,P<0.001);CCK8和Transwell结果显示,过表达miR-146a使羊驼黑色素细胞的增殖和迁移能力极显著下调(P<0.01)。综上所述,miR-146a通过靶向调控MAPK4和Myosin Va,使增殖和迁移相关的基因MEK1、CREB、MITF、MLPH和Rab27a的表达下调,从而对羊驼黑色素细胞的增殖和迁移起抑制作用。     

内皮素3对小鼠黑色素沉着相关基因表达的影响

试验旨在探究内皮素3（endothelin 3，EDN3）在不同毛囊时期小鼠皮肤中是否存在差异表达及其对黑色素细胞黑色素沉着相关基因表达的影响。通过RT-PCR技术对EDN3、EDNRB在不同毛囊时期小鼠皮肤的表达情况进行定量分析发现，EDN3和EDNRB在小鼠不同毛囊时期皮肤样品中均有表达，在毛囊生长初期和中期小鼠皮肤中EDN3 mRNA表达量是末期的2.18倍（P < 0.05）和1.15倍（P > 0.05），毛囊生长初期和中期EDNRB mRNA表达量是末期的16.8倍（P < 0.01）和9.9倍（P < 0.01）。为了进一步揭示EDN3在黑色素细胞色素沉着中的重要作用，通过细胞转染技术使小鼠黑色素细胞过表达EDN3并测定其黑色素含量及色素沉着相关基因的表达水平发现，与空载组相比，体外转染EDN3的黑色素细胞黑色素含量明显增加。此外，MITF mRNA显著降低（P < 0.05）；TYR、TYRP2、EDNRB、c-Kit和EDN1 mRNA显著升高2.04倍（P < 0.05）、1.44倍（P < 0.05）、1.41倍（P < 0.05）、5.21倍（P < 0.01）和3.27倍（P < 0.01）。MITF蛋白水平显著降低（P < 0.05），TYR、TYRP2、EDNRB和c-Kit蛋白水平显著升高1.48倍（P < 0.01）、4.61倍（P < 0.01）、1.27倍（P < 0.05）和2.64倍（P < 0.01）。综上所述，EDN3在不同毛囊时期小鼠皮肤中均可有效表达，且表达量存在显著差异。黑色素细胞中过量表达EDN3，使色素沉着相关基因的表达量及黑色素含量增加。     

黑色素细胞中过量表达lpa-miR-nov-66对TYRP2的影响

本研究旨在探讨lpa-miR-nov-66对黑色素生成相关基因TYRP2的影响。采用细胞转染技术,在羊驼黑色素细胞中过表达lpa-miR-nov-66,运用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)、实时荧光定量聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)技术和免疫印迹法(western blotting)技术分别检测转染lpa-miR-nov-66后黑色素细胞内TYRP2在mRNA和蛋白水平的表达差异。RT-PCR结果显示:TYRP2的部分片段扩增,扩增片段长度为151 bp。qRT-PCR和免疫印迹(western blotting)结果显示:与对照组相比,实验组TYRP2在mRNA表达水平显著降低,降低0.44倍;蛋白表达水平也显著降低,降低0.78倍。结果表明,lpa-miR-nov-66可以影响TYRP2的表达,可能参与了动物毛色的形成过程。     

黑色素形成调控机理及乌骨绵羊黑色素沉积候选基因研究进展

黑色素(melanin)产生于黑色素细胞,是由酚类或吲哚类物质氧化聚合而成的不易溶于水的聚合体,广泛存在于微生物和动植物机体,具有消除自由基、抗氧化、抑制病毒感染、激活免疫系统、提高机体免疫力、延缓衰老等生理功能。酪氨酸在酪氨酸酶作用下生成多巴,多巴经过系列复杂的生物学反应形成黑色素。现有研究发现,多种信号通路(α-MSH/MC1R/cAMP信号通路、Wnt/β-catenin信号通路、PI3K/Akt/GSK3β信号通路、MAPK信号通路等)及相关调控因子(MITF、MC1R、TYR等)参与了黑色素的形成过程。一般认为,哺乳动物黑色素细胞主要分布于皮肤和毛囊组织,而乌骨绵羊的内脏组织也能存在大量黑色素细胞,其形成机制尚不明确。乌骨绵羊的乌质性状是重要的经济性状,与其营养和药用价值密切相关,受机体组织黑色素沉积程度的影响。文章简述了黑色素的理化性质、生物功能及其合成路径,回顾了近年来发现的调控动物机体黑色素合成的信号通路及其作用机理,总结了影响乌骨绵羊黑色素沉积和分布规律相关候选功能基因的研究现状,以期为深入研究黑色素沉积调控机理及候选功能基因应用于生产实践提供参考。