弓形虫Tgcsp2基因敲除株的表型和毒力

为研究弓形虫冷休克蛋白2(cold shock domain protein 2 of T.gondii,Tgcsp2)在弓形虫感染宿主过程中的作用,本研究利用CRISPR/Cas9技术构建了弓形虫Tgcsp2基因缺失株(ΔTgcsp2)。通过空斑试验和细胞裂解试验探究ΔTgcsp2虫株在体外的生长能力,结果表明ΔTgcsp2虫株的空斑形成能力和细胞裂解能力相对于RH野生株较弱;弓形虫感染细胞要经过入侵、复制和逸出3个过程。为探究Tgcsp2影响体外感染的具体过程,本研究对ΔTgcsp2虫株和RH野生株进行入侵试验、复制试验和逸出试验,结果表明ΔTgcsp2虫株的入侵能力、复制能力和逸出能力都有不同程度的减弱;将ΔTgcsp2虫株和RH野生株感染BALB/c小鼠进行了体内毒力试验;结果表明,与RH野生株相比,ΔTgcsp2虫株对小鼠的毒力减弱。综上所述,Tgcsp2基因对弓形虫体外生长和体内毒力具有重要的作用。     

OppA对副猪格拉菌突破猪呼吸道上皮屏障的影响

为了探究寡肽结合蛋白OppA在副猪格拉菌(Glaesserella parasuis, GPS)突破猪呼吸道上皮屏障过程中的作用，采用自然转化法构建副猪格拉菌HPS5-SQ的oppA缺失株ΔoppA,并通过测定ΔoppA在不同培养基中的生长曲线、黏附猪气管上皮细胞(swine tracheal epithelial cells, STEC)、穿透猪呼吸道上皮屏障、损伤紧密连接蛋白等能力来判定OppA对GPS定殖和突破猪呼吸道上皮屏障的影响。结果显示：通过PCR和Western blot验证，试验成功构建了ΔoppA,表达的重组OppA具有结合血红素功能；ΔoppA和HPS5-SQ野生株在TSB培养基中生长速度相当，黏附STEC能力没有差异；在加入血红素DMEM中，野生株的生长速度比ΔoppA快，对猪呼吸道上皮屏障破坏和紧密连接蛋白损伤能力比ΔoppA强。结果表明：OppA摄取血红素促进GPS生长，进而加速猪呼吸道上皮屏障损伤。     

phoP/Q双组分系统对禽致病性大肠杆菌的毒力调控作用

phoP/Q作为一种外在环境感受器,参与调节细菌对外部环境的适应性。本研究拟探讨phoP/Q双组分系统对禽致病性大肠杆菌(APEC)的生长、定植、毒力等生物学特性的影响。利用Red重组系统构建APEC AE 17株的phoP/Q双组分调控系统缺失株,并构建phoP/Q双组分调控系统回复质粒,转化缺失株,构建回复株。通过生长运动性试验、黏附入侵CEF细胞试验、毒力基因转录水平检测以及半数致死量(LD50)等试验比较野生株、缺失株、回复株的生物特性。与野生株相比,phoP-phoQ缺失不改变其生长特性;运动性较野生株下降63%;黏附与入侵CEF细胞能力分别降低69.83%(P0.01)和62.17%(P0.05);LD50显示毒力减弱13.3倍;polA、tsh基因转录水平分别上调41%、54%;sodA、iss分别下调64%和98%。phoP/Q双组分系统参与对APEC致病性的调控,该系统的缺失会降低APEC的致病性。     

肠炎沙门菌SPI-19编码的Hcp基因缺失株的毒力相关功能研究

为研究肠炎沙门菌SPI-19编码的Hcp基因在肠炎沙门菌感染中的毒力作用,利用Red同源重组系统对2株肠炎沙门菌(国内标准株50336和国际参考株SD-2)SPI-19的Hcp基因进行敲除,成功构建了50336ΔHcp和SD-2ΔHcp基因缺失株,并构建了回补株50336ΔHcp/pHcp和SD-2ΔHcp/pHcp。分析比较缺失株与野生株对人肠上皮细胞系Caco-2黏附和侵袭能力,以及在鸡巨噬细胞HD11的存活能力。结果显示:缺失Hcp基因后,肠炎沙门菌50336对Caco-2细胞黏附和侵袭数量分别下降39.1%和47.9%;SD-2对Caco-2细胞黏附和侵袭数量分别下降46.5%和58.9%。吞噬作用2h后,50336ΔHcp和SD-2ΔHcp与野生株相比在HD11的存活量下降了35.7%和37.2%,差异显著。通过Real Time-PCR试验分析,与野生株相比,Hcp基因缺失后fliC、sefA、ompA,ompC这4个重要粘附因子编码基因的表达量显著下降。试验表明,肠炎沙门菌SPI-19编码的Hcp基因对肠炎沙门菌的毒力具有增强作用。     

副猪嗜血杆菌potD基因缺失株的构建及其部分生物学特性

potD基因编码的蛋白质作为转运体蛋白,负责多胺的结合和转运,为细胞的正常生长提供必需因子,已在多种病原菌中鉴定为毒力相关因子,但在副猪嗜血杆菌中的作用还不清楚。利用自然转化法构建potD缺失株SC1401ΔpotD::kan,再比较亲本株和缺失株的生长特性、自凝集活性、生物被膜形成能力、抗血清杀菌能力以及对小鼠的致病力。结果显示potD基因的缺失不影响副猪嗜血杆菌的生长、自凝集活性和生物被膜形成能力,但导致该菌的抗血清杀菌能力和对小鼠的致病力显著降低。以上结果表明potD基因可能与副猪嗜血杆菌的毒力相关。     

分子伴侣prsA2基因缺失对单增李斯特菌致病性的影响

【目的】构建单增李斯特菌分子伴侣prsA2基因缺失株与回补株，探究其对单增李斯特菌内化素B(InlB)锚定能力以及致病性的影响。【方法】利用穿梭质粒pKSV7和回补质粒pIMK2分别构建prsA2基因缺失株与回补株；通过生长曲线分析亲本株10403S、缺失株ΔprsA2和回补株CΔprsA2生长能力；利用Western blotting检测prsA2基因缺失对单增李斯特菌InlB锚定的影响；通过肠上皮细胞(Caco-2)黏附侵袭试验与免疫荧光试验、小鼠毒力试验分析prsA2基因缺失对单增李斯特菌黏附侵袭能力、在宿主细胞间迁移能力及小鼠致病性的影响。【结果】PCR扩增结果显示，试验成功构建了缺失株ΔprsA2和回补株CΔprsA2。生长曲线结果显示，prsA2基因缺失不影响单增李斯特菌在BHI培养基中的生长能力(P>0.05)。Western blotting结果显示，缺失株ΔprsA2细菌表面的InlB锚定量极显著低于10403S和CΔprsA2(P<0.01),细菌培养上清中InlB锚定量极显著高于10403S和CΔprsA2(P<0.01)。细胞试验结果显示，缺失...     

肠炎沙门菌双组份系统qseC基因缺失株的构建及其生物学特性分析

为研究肠炎沙门菌qseC基因功能,构建qseC缺失株C50041ΔqseC以及回复株C50041ΔqseC::qseC,分析qseC基因缺失对肠炎沙门菌生化特性、生长曲线、运动性、黏附侵袭等方面的影响,探究该基因在肠炎沙门菌感染致病中的作用。结果显示:利用框内缺失突变技术成功获得肠炎沙门菌C50041ΔqseC缺失株,以野生株C50041、回复株C50041ΔqseC::qseC为对照,发现C50041ΔqseC缺失株的生化特性、生长曲线与C50041野生株一致,但其运动性(P=0.001 9)以及对巨噬细胞J774A.1的黏附率(P=0.032 5)、侵袭率(P=0.005 3)相比野生株显著下降。研究提示:qseC基因的缺失对肠炎沙门菌的生化特性和生长曲线没有影响,但会显著降低肠炎沙门菌的运动能力及对宿主细胞的黏附和侵袭。研究初步探究了肠炎沙门菌qseC基因的功能,为后续深入研究奠定基础。     

禽致病性大肠杆菌tonB基因缺失株的构建及其生物学特性研究

为了研究摄铁蛋白TonB对于禽致病性大肠杆菌(Avian pathogenic Escherichia coli,APEC)铁摄取能力及致病性的影响，试验采用同源重组技术构建了APEC tonB基因缺失及回复株，通过测定在正常和贫铁环境下的生长曲线、铁摄取能力等研究tonB对APEC生物学特性的影响，并通过鸡攻毒模型评价了其与APEC毒力之间的关联性。结果显示：APEC TZ18ΔtonB缺失株在正常环境中的生长速度与野生株相比没有差异，但其在贫铁环境中的生长速度显著下降(P<0.05);TZ18ΔtonB缺失株菌体内摄入的铁含量明显低于野生株；TZ18ΔtonB缺失株感染1日龄雏鸡的半数致死量(104.236)高于野生株(10^3.328)，显示其毒力下降了8.1倍(P<0.05)；此外，TZ18ΔtonB缺失株在21日龄SPF鸡体内心血、肝脏和肺脏中的载菌量显著低于野生株感染水平(P<0.01)，而tonB基因回复株的感染水平接近野生株。结果表明：tonB参与APEC铁摄取进程并影响其毒力。     

禽源空肠弯曲杆菌LOS基因簇多态性及其cstⅡ基因功能

对277株禽源空肠弯曲杆菌进行LOS生物合成位点的基因簇进行分类,并以野生菌株CJ018(LOS classB)和CJ050(LOS classA)为模板构建cstⅡ基因突变株,进而用野生菌株及其突变株CJ018△cstⅡ和CJ050△cstⅡ对犬肾上皮细胞(MDCK)、非洲绿猴肾细胞(Vero)和人子宫颈癌细胞(Hela)进行黏附入侵试验。结果显示:89.17%试验菌株的LOS基因簇属于常见的6大类,其中Class A占2.17%、Class B占50.90%、Class C占6.14%、Class D占1.44%、Class E占14.44%、Class F占14.08%。成功运用电击法分别构建cstⅡ基因突变株,而且野生株和突变株CJ对细胞的黏附能力差异不显著(P≥0.062 0),而入侵能力差异显著(P=0.0000)。结果表明:含唾液酸化LOS的C.jejuni入侵细胞的能力显著强于含非唾液酸化LOS的C.jejuni。     

利用CRISPR/Cas9技术构建PRVGD株gI和gE缺失毒株及其生物学特性研究

本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对本实验室分离得到的PRV GD株的gI和gE基因进行基因敲除,经蚀斑纯化结合PCR鉴定的方法获得gI和gE基因缺失毒株,命名为PRV GD-delgI/gE。试验测定了该基因缺失病毒在PK-15细胞中培养的一步生长曲线及其对小鼠的致病力。试验结果表明,与亲本毒株PRV GD株相比,PRV GD-delgI/gE在PK-15细胞中的繁殖能力有轻微降低,对小鼠的毒力明显降低,且该基因缺失病毒遗传稳定,可作为新型PRV疫苗的候选毒株,并为针对变异毒株的控制和新型疫苗的研制奠定了一定的基础。     

单增李斯特菌inlK基因缺失株的构建及其生物学特性分析

为了分析内化素InlK对单增李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)生物学特性及致病性的影响,利用自杀性质粒进行同源重组构建LM标准菌株10403s的inlK基因缺失株,然后比较分析野生株、inlK基因缺失株的生长特性、生物被膜形成能力、细胞侵袭能力、动物致病力等差异。结果显示,inlK基因缺失不影响LM的生长速度,但可导致LM的生物被膜形成能力下降。细胞感染试验表明基因缺失株ΔinlK对RAW264.7细胞的侵袭及胞内存活能力分别下降了18%和31%。动物感染试验显示野生株和基因缺失株ΔinlK对小鼠的致死率分别为80%(4/5)和40%(2/5),且基因缺失株ΔinlK的体内定殖能力显著低于野生株。本研究表明内化素InlK在LM感染过程中发挥着重要作用,为了解LM的致病作用提供参考。     

猪链球菌2型SstF蛋白对杆菌肽耐药性及毒力的影响

为了探究猪链球菌2型ZY05719中ATP结合蛋白SstF对杆菌肽耐药性及毒力的作用,利用同源重组方法构建了基因缺失株ΔSstF,并检测其生物学特性、杆菌肽耐药性及致病性。结果显示:通过荧光定量PCR发现,在添加杆菌肽的培养基中sstF基因出现高转录水平,是无杆菌肽培养时的37倍(P=0.000 5);最小抑菌浓度试验显示,与野生株相比,ΔSstF对杆菌肽的耐药性下降了4倍;动物试验发现ΔSstF对BALB/c小鼠和斑马鱼的毒力明显降低,LD50分别是野生株的2.67倍和10倍;细胞黏附试验表明ΔSstF对HEp-2细胞的黏附水平为野生株的65%(P=0.0021)。结果表明:SstF蛋白介导猪链球菌对杆菌肽的耐受,且为猪链球菌的毒力因子,促进细菌对宿主的致病性。     

副猪嗜血杆菌qseC基因缺失突变对生物被膜形成的影响

通过构建副猪嗜血杆菌qseC突变体,探讨qseC基因的缺失对副猪嗜血杆菌生长和生物被膜形成的影响。利用自然转化方法构建副猪嗜血杆菌qseC基因的突变体,测定副猪嗜血杆菌野生株SC096与缺失株ΔqseC的生长情况并绘制生长曲线。结晶紫染色法定性检测野生株和突变体生物被膜的差异;通过96微孔板定量方法检测突变体生物被膜的量;电镜观察二者生物被膜的变化。结果如下:成功构建qseC基因突变体。生长曲线显示副猪嗜血杆菌野生株SC096与缺失株ΔqseC生长速度基本一致。缺失株ΔqseC较之野生株SC096生物被膜的形成能力有所减弱。研究表明,qseC基因对副猪嗜血杆菌生物被膜的形成有重要的调控作用。     

流产布鲁菌LysR家族转录调控子LTTR8缺失株的构建及其生物学特性分析

布鲁菌是一种重要的人畜共患病病原,兼性胞内寄生,无典型毒力因子,毒力相关基因的研究对阐明布鲁菌持续感染的机制具有重要意义。本研究以流产布鲁菌S2308为亲本株,通过同源重组的方法,构建流产布鲁菌LysR家族转录调控子基因bab＿RS24670缺失株ΔlttR8,基于广宿主质粒pBBR1MCS构建成互补株ΔlttR8-Com。免疫印迹试验表明：ΔlttR8为光滑型菌株;体外培养分析发现lttR8缺失不影响布鲁菌的生长;细胞感染试验发现lttR8缺失不影响布鲁菌黏附、入侵细胞和胞内存活的能力。耐受性试验分析发现：lttR8缺失不影响布鲁菌对过氧化氢（H2O2）和多粘菌素B(polymyxin B)的敏感性。小鼠感染试验分析发现lttR8缺失显著减弱流产布鲁菌的毒力。综上所述,本研究发现一个新的与流产布鲁菌致病性相关的转录调控子,为布鲁菌致病机制研究提供参考。     

Enolase在鸭疫里默氏杆菌侵袭鸭脑微血管内皮细胞中的作用

旨在明确鸭疫里默氏杆菌烯醇化酶(Enolase)在其侵袭鸭脑微血管内皮细胞(DBMEC)以及血脑屏障(BBB)中的作用。本研究以鸭疫里默氏杆菌RA-LZ01株为亲本株，利用同源重组和结合转移的方法构建enolase基因缺失株ΔEnolase和回复株cΔEnolase，并测定RA-LZ01、ΔEnolase和cΔEnolase对DBMEC黏附和侵袭能力的差异；用上述菌株感染雏鸭，测定雏鸭血液和脑组织中的载菌量。结果表明，与亲本株RA-LZ01相比，缺失株ΔEnolase对DBMEC的黏附率和入侵率均极显著降低；回复株cΔEnolase恢复了对DBMEC的黏附和入侵能力。感染RA-LZ01、ΔEnolase和cΔEnolase菌株的雏鸭的血液载菌量无显著差异；与感染RA-LZ01和cΔEnolase菌株的雏鸭相比，感染ΔEnolase菌株的雏鸭脑组织中的载菌量极显著降低。以上结果说明，Enolase与鸭疫里默氏杆菌黏附和入侵DBMEC以及入侵雏鸭脑组织显著相关，可能为介导鸭疫里默氏杆菌突破鸭血脑屏障的毒力因子。     

肠炎沙门菌sef14基因缺失株生物学功能

构建了肠炎沙门菌参考株SE50336的SefA主要亚单位编码基因sefA的缺失株SE50336ΔsefA,进一步探究野生株及SEF14菌毛缺失株的生物学功能。以SE50336为模板,利用λ-red同源重组技术构建sefA缺失株,通过绘制生长曲线、生物被膜测定试验、刚果红-考马斯亮蓝无盐培养基菌落表型试验、RT-qPCR(real-time quantitative polymerase chain reaction)、人结肠腺癌上皮细胞(Caco-2)的体外黏附测定来检测和比较2种菌株的生物学特性,并利用野生株和缺失株分别攻毒小鼠,探究SEF14菌毛对肠炎沙门菌致病力的影响。结果显示,野生株及缺失株生长情况无明显差异。与野生株相比,ΔsefA缺失株的生物被膜形成能力有所下降;菌落表型试验中野生株表现出典型的rdar(red, dry and rough)表型,而ΔsefA缺失株表现出saw(smooth and white)表型;RT-qPCR试验中,野生株的生物被膜形成主要关联基因csgA、bcsA、pgaC、fimA的转录量均显著高于ΔsefA缺失株。但缺失株与野生株对于Caco-...     

LIPI-4 EⅡC调控单增李斯特菌关键毒力因子转录的研究

【目的】探究单增李斯特菌(LM)毒力岛4(LIPI-4)中膜透性酶ⅡC(EⅡC)对LM关键毒力基因表达的影响。【方法】构建分离株LM928 EⅡC基因缺失株LM928ΔEⅡC和回补菌株CLM928ΔEⅡC,测定各菌株的生长曲线和对不同糖的发酵情况,测定侵染人脑微血管内皮细胞(HCMEC/D3)后的黏附、侵袭和胞内增殖能力,利用实时荧光定量PCR方法检测在脑心浸液(BHI)培养条件下和侵染HCMEC/D3后各菌株毒力基因的转录水平。【结果】成功构建LM928 EⅡC基因缺失株LM928ΔEⅡC和回补菌株CLM928ΔEⅡC。EⅡC基因的缺失不影响LM928的生长和对葡萄糖、纤维二糖、果糖、鼠李糖、七叶苷和水杨苷的发酵。EⅡC基因缺失后,LM928对HCMEC/D3的侵袭率极显著下降(P<0.01),黏附能力无显著变化(P>0.05)。LM928ΔEⅡC胞内增殖菌量在2～4 h时显著低于LM928和CLM928ΔEⅡC(P<0.05),但在8～12 h时均显著高于LM928和CLM928ΔEⅡC(P<0.05)。在BHI培养条件下,LM928ΔEⅡC毒力基因hly、...     

rfaE基因在副猪嗜血杆菌LOS刺激猪肺泡巨噬细胞炎性因子mRNA转录中的作用

为研究rfaE基因在副猪嗜血杆菌(HPS)脂寡糖(LOS)刺激猪肺泡巨噬细胞(PAMs)炎性因子(IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α)mRNA转录中的作用,提取HPS SC096株及其rfaE基因缺失株(ΔrfaE)和互补株(cΔrfaE)的LOS,分别用5和10μg HPS-LOS、ΔrfaE-LOS、cΔrfaE-LOS和E.coli-LPS刺激PAMs,分别在2、4、6、12和24h后收集细胞,提取RNA并反转录成cDNA,运用RT-PCR检测IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-αmRNA的转录水平。结果表明用5μg HPS-LOS刺激细胞时,2、4、6、12和24h后IL-1αmRNA的转录水平均升高,显著高于ΔrfaE-LOS刺激细胞后的IL-1αmRNA转录水平(P0.05),12和24h后IL-1β、IL-6和IL-8mRNA的转录水平均升高,显著高于ΔrfaE-LOS刺激细胞后的mRNA转录水平(P0.05),24h后TNF-αmRNA的转录水平升高,显著高于ΔrfaE-LOS刺激细胞后的mRNA转录水平(P0.05);10μg HPS-LOS刺激细胞后IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-αmRNA的转录水平均升高,显著高于ΔrfaE-LOS刺激细胞后的mRNA转录水平(P0.05)。同时cΔrfaE-LOS刺激PAMs后IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-αmRNA的转录水平能够恢复到HPSLPS水平。首次证实rfaE基因在HPS LOS刺激PAMs炎性因子mRNA转录水平中起着重要的作用。     

粪肠球菌ace基因缺失突变株的构建

本研究旨在构建粪肠球菌胶原蛋白黏附素基因(ace)缺失突变株,为进一步探讨该基因编码的毒力因子Ace的功能奠定基础。利用pK18mobSacB质粒作为基因敲除载体,构建粪肠球菌ace基因重组自杀质粒pK001,通过体内同源重组筛选成功敲除ace基因的突变株,然后对突变株细菌黏附体外培养猪肠上皮细胞IPEC-J2及其细菌生物被膜形成的情况进行了检测。结果显示,同源重组后,经过卡那霉素抗性筛选、PCR及Southern blot鉴定,成功获得了ace基因缺失突变株肠球菌△ace。细菌生长曲线测定试验表明,ace基因敲除对细菌的生长繁殖并无明显影响,但体外生物被膜测定试验显示基因缺失突变株肠球菌△ace的生物被膜形成能力有所降低。本研究证实了毒力因子Ace对猪源粪肠球菌与宿主黏附的重要作用,该基因缺失突变株的构建为进一步的理论研究和疫苗研发奠定基础。     

牛种布鲁氏菌A19 VirB启动子缺失株的构建及其生物学特性研究

为探究VirB基因对牛种布鲁氏菌A19株毒力的影响,深入了解布鲁氏菌胞内存活的机制,本研究以牛种布鲁氏菌A19株为模板,利用VirB基因的上下游同源臂融合kana抗性基因构建自杀质粒。以瞬间电击的方式,将自杀质粒电转进菌体,利用同源重组将VirB启动子用kana基因替换,构建A19ΔVirB缺失株。通过实时荧光定量PCR检测缺失株VirB相关蛋白的转录水平,并对缺失株的生长曲线、体外应激、黏附侵袭及胞内生存进行分析。结果显示,试验成功构建A19ΔVirB缺失株。实时荧光定量PCR结果显示,缺失株VirB相关蛋白的表达量极显著低于A19株(P0.01),其生长曲线虽然不同于亲本株,但生长趋势相同。体外应激结果显示,A19株和A19ΔVirB株热休克应激没有明显变化,但在强酸、强碱、高盐的刺激下,A19株的存活率显著高于A19ΔVirB株(P0.05)。黏附侵袭结果显示,缺失株对巨噬细胞的黏附侵袭能力近似于亲本株。胞内生存结果显示,随着时间的延长,A19株的胞内存活趋势逐渐上升,而缺失株A19ΔVirB总体趋势逐渐下降并且与A19的差距越来越大。综上所述,本研究成功构建了VirB启动子缺失株,极显著降低了相关蛋白的表达,为后续相关缺失株的构建及布鲁氏菌毒力的研究奠定基础。