猫传染性腹膜炎病毒N蛋白在昆虫细胞-杆状病毒系统中的表达与鉴定

本研究旨在利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统表达猫传染性腹膜炎病毒（Feline infectious peritonitis virus,FIPV）N蛋白,并制备抗该蛋白的多克隆抗体,用于FIPV临床抗原/抗体诊断及N蛋白功能研究。参考GenBank中FIPV的N基因序列,选择FIPV毒株N基因（登录号：KC461235.1）,并对该N基因进行密码子优化、基因合成,酶切后将N基因连接至pFastBac1载体,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,经氨苄西林抗性筛选阳性克隆,提取质粒经酶切及测序鉴定正确后,转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,经蓝白斑筛选及PCR鉴定后,最终成功构建重组杆状病毒质粒Bacmid-N,转染Sf9细胞包装杆状病毒,于28 ℃温箱培养4 d后收集感染Sf9细胞上清,并通过镍离子亲和层析纯化获得重组N蛋白。经SDS-PAGE及Western blotting鉴定结果表明,本研究成功利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统表达出大小约为51 ku的FIPV重组N蛋白。将该蛋白与弗氏佐剂按一定比例混合后,免疫6周龄BALB/c小鼠。用间接ELISA方法检测小鼠血清抗体效价可达1：102 400;利用Western blotting和间接免疫荧光试验对N蛋白多克隆抗体进行检测分析,结果表明,真核表达的重组蛋白免疫原性良好,多克隆抗体具有良好的反应原性,可特异识别FIPV感染细胞。本研究为FIPV抗原/抗体诊断试剂盒的研发奠定了基础。     

猫传染性腹膜炎病毒N蛋白在昆虫细胞-杆状病毒系统中的表达与鉴定

本研究旨在利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统表达猫传染性腹膜炎病毒(Feline infectious peritonitis virus,FIPV)N蛋白,并制备抗该蛋白的多克隆抗体,用于FIPV临床抗原/抗体诊断及N蛋白功能研究。参考GenBank中FIPV的N基因序列,选择FIPV毒株N基因(登录号:KC461235.1),并对该N基因进行密码子优化、基因合成,酶切后将N基因连接至pFastBac1载体,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,经氨苄西林抗性筛选阳性克隆,提取质粒经酶切及测序鉴定正确后,转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,经蓝白斑筛选及PCR鉴定后,最终成功构建重组杆状病毒质粒Bacmid-N,转染Sf9细胞包装杆状病毒,于28℃温箱培养4 d后收集感染Sf9细胞上清,并通过镍离子亲和层析纯化获得重组N蛋白。经SDS-PAGE及Western blotting鉴定结果表明,本研究成功利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统表达出大小约为51 ku的FIPV重组N蛋白。将该蛋白与弗氏佐剂按一定比例混合后,免疫6周龄BALB/c小鼠。用间接ELISA方法检测小鼠血清抗体效价可达1∶102400;利用Western blotting和间接免疫荧光试验对N蛋白多克隆抗体进行检测分析,结果表明,真核表达的重组蛋白免疫原性良好,多克隆抗体具有良好的反应原性,可特异识别FIPV感染细胞。本研究为FIPV抗原/抗体诊断试剂盒的研发奠定了基础。     

p15在杆状病毒-昆虫细胞表达系统中的表达

为探讨鸡p15蛋白的特性及其在细胞周期抑制通路中与其他蛋白的作用,本研究选用昆虫细胞表达系统来表达有活性的p15蛋白.为后期纯化的需要,对pFAST供体质粒的多克隆位点进行了重新改造,并成功构建带有TAP纯化标签的供体质粒pFAST-NMCS-N-TAP-p15和pFAST-NMCS-C-TAP-p15.将2个供体质粒转化到DH10Bac感受态菌中,对阳性转化子Bacmid-N-TAP-p15和Bacmid-C-TAP-p15进行反复涂板的去阴性单克隆纯化,提取大质粒Bacmid-N-TAP-p15和Bacmid-C-TAP-p15并进行转座鉴定.将纯化的大质粒Bacmid-N-TAP-p15和Bacmid-C-TAP-p15转染入sf9昆虫细胞中,72 h后收集培养上清中的杆状病毒,并进行病毒的扩增和滴度测定,结果所获2株重组杆状病毒N-TAP-p15和C-TAP-p15的滴度分别为3.6×107,5.4×107pfu/mL.将2株高滴度的重组杆状病毒再感染新培养的sf9昆虫细胞进行重组p15蛋白的表达,结果与对照组相比,重组p15融合蛋白得到了有效的表达,表达量分别为4.32%和4.7%.Western blotting结果表明,所表达的重组p15融合蛋白只特异地与p15单克隆抗体和兔的IgG反应而未与其他细胞蛋白反应;明带有TAP标签的重组p15融合蛋白在昆虫细胞表达系统中得到了有效表达.     

蜂王浆主蛋白2在昆虫细胞-杆状病毒系统中的表达与鉴定

本研究旨在利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统表达蜂王浆主蛋白2（MRJP2）,为后续MRJP2功能的深入研究提供材料。根据GenBank中意大利蜜蜂（Apis mellifera L.）MRJP2基因序列,经PCR扩增、克隆至真核表达载体pFastBac1,构建重组杆状病毒质粒MRJP2-Bacmid并转染至Sf9昆虫细胞,以P2代杆状病毒感染Sf9细胞进行诱导表达,利用层析柱和离子交换柱对表达产物进行纯化,并通过SDS-PAGE、Western blotting及四极杆静电场轨道阱高分辨质谱仪（Q Exactive）对目的蛋白进行分析验证。结果显示,本试验成功构建杆状病毒质粒MRJP2-Bacmid,转染至Sf9昆虫细胞并获得表达产物。SDS-PAGE和Western blotting验证结果表明,本研究成功利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统表达出大小约为52 ku的MRJP2重组蛋白,且纯度较高;质谱分析结果显示,该重组蛋白匹配到蜜蜂蛋白质数据库中MRJP2的特异性肽段为39个,序列覆盖率为61%,且与MRJP2的匹配得分最高,进一步确认该重组蛋白为MRJP2。本研究利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统成功表达出MRJP2,为后续该蛋白生物学功能的深入研究奠定了基础。     

狂犬病病毒糖蛋白在Bac-to-bac杆状病毒系统中的表达及应用

为表达狂犬病病毒(RV)糖蛋白(G),本研究通过RT-PCR方法克隆RV Flury LEP病毒株G基因,将其克隆至质粒pFastBacHTα中,重组质粒pFastBac-RV-G转化DH10Bac感受态细胞,经同源重组获得重组杆状病毒穿梭质粒Bacmid-RV-G,将其转染昆虫细胞sf21获得含有G基因的重组杆状病毒.采用SDS-PAGE和western blot对重组蛋白进行鉴定及抗原性分析,以重组G蛋白作为包被抗原的ELISA检测36份犬血清样品.结果表明,在Bac-to-bac杆状病毒系统中表达的RV G蛋白能与his-tag单克隆抗体及RV阳性血清发生特异性反应,其相对分子量为60 ku;与以RV为包被抗原的商品化ELISA试剂盒相比,以重组RV G蛋白为抗原建立的间接ELISA的敏感性、特异性和符合率分别为80%、81.8%和80.6%,表明杆状病毒系统表达的RV G蛋白是检测RV抗体的理想抗原蛋白,作为一种亚单位疫苗具有潜在的应用前景.     

TGEV-RBD基因在昆虫杆状病毒中的表达及鉴定

旨在获得具有天然结构且有反应原性的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)受体结合域(RBD)蛋白.受体结合域是决定病毒宿主和嗜性的关键因素.根据猪传染性胃肠炎病毒纤突蛋白(S)序列(GenBank:ABC72414.1),设计、优化并合成其受体结合域(RBD)部分,亚克隆至杆状病毒pFastBacTM Dual上,获得重组质粒...     

犬瘟热病毒OP株囊膜糖蛋白H基因的克隆与表达

根据发表的犬瘟热病毒OP－CDV毒株序列设计两对引物，以犬瘟热病毒OP－CDV株感染Vero细胞收获病毒提取的RNA为模板，做RT－PCR扩增出H基因的5'端和3' 端大小为945bp、904bp的两个片段，两片段部分重叠，覆盖了H基因的全部编码序列。将PCR产物按正确的阅读框架定向克隆进pGEX-6P-1载体中谷胱甘肽－S－转移酶（GST）基因的下游，将重组质粒转化进宿主菌BL21中，在37℃ 1.0mM IRTG诱导下，H基因分段获得了良好的表达，表达产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定，确定其表达的融合蛋白质大小分别为59kDa、58kDa，将表达产物回收后混合免疫小鼠。IFA显示免疫小鼠血清能与病毒感染细胞呈现特异反应，表明体外表达H基因保留了天然蛋白部分抗原性。     

犬瘟热病毒OP株囊膜糖蛋白F基因片段表达产物的免疫原性

根据已发表的犬瘟热病毒OP株核酸序列设计2对引物，以犬瘟热病毒OP株感染Vero细胞收获病毒提取的RNA为模板，应用RT—PCR扩增出F基因的769、832bp片段。将PCR产物按正确的阅读框架定向克隆进pGKX—6p—1载体中谷胱甘肽—S—转移酶(GST)基因的下游，再将重组质粒转化入宿主菌BL21中，在37℃ 1．0mmo1/L IPTG诱导下，F基因2个片段获得了良好的表达。表达产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定，确定所表达的融合多肽大小分别为54000、56000。将表达产物回收后混合免疫小鼠，IFA显示，免疫小鼠血清能与病毒感染细胞呈现特异反应，并表现出1：16的中和抗体活性，表明体外表达的F多肽保留了天然蛋白的部分抗原性。     

犬瘟热病毒OP株囊膜糖蛋白F基因片段表达产物的免疫原性

根据已发表的犬瘟热病毒OP株核酸序列设计2对引物,以犬瘟热病毒OP株感染Vero细胞收获病毒提取的RNA为模板,应用RT-PCR扩增出F基因的769、832 bp片段.将PCR产物按正确的阅读框架定向克隆进pGEX-6p-1载体中谷胱甘肽-S-转移酶(GST)基因的下游,再将重组质粒转化入宿主菌BL21中,在37℃1.0 mmol/LPTG诱导下,F基因2个片段获得了良好的表达.表达产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定,确定所表达的融合多肽大小分别为54 000、56 000.将表达产物回收后混合免疫小鼠,IFA显示,免疫小鼠血清能与病毒感染细胞呈现特异反应,并表现出116的中和抗体活性,表明体外表达的F多肽保留了天然蛋白的部分抗原性.     

狂犬病病毒磷蛋白在杆状病毒中的表达及鉴定

采用RT-PCR方法扩增出狂犬病病毒BD06株的磷蛋白(P)基因片段,将其插入杆状病毒穿梭载体pFastBac 1获得的pFastBac 1-P重组质粒,转化E.coli DH10Bac成功构建出杆状病毒表达质粒Bacmid-P,用脂质体介导Bacmid-P转染Sf9细胞获得重组杆状病毒(AcMNPV-P)。经SDS-PAGE、Western blot和直接免疫荧光分析鉴定,BD06-P蛋白在杆状病毒中成功表达,且具有良好的反应原性,为进一步研究狂犬病病毒磷蛋白的结构和功能奠定了基础。     

PCV-2和PCV-3 Cap蛋白在昆虫细胞-杆状病毒系统中的表达和鉴定

为了实现猪圆环病毒2型(PCV-2)和3型(PCV-3)Cap蛋白在昆虫细胞-杆状病毒系统中表达,本试验利用刚性连接肽连接PCV-2和PCV-3 Cap基因,构建杆状病毒转移载体pFastBac-PCV-2-3-Cap,双酶切验证正确后,将其转化至大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,经蓝白斑筛选和PCR鉴定,获得重组杆粒。将重组杆粒转染SF9细胞(昆虫卵巢细胞),盲传3代,获得重组病毒。将重组病毒接种SF9细胞96 h后,通过细胞免疫荧光检测、Western blot和电镜观察对其进行验证,并利用噬斑法检测其效价。结果显示：成功构建重组质粒pFastBac-PCV-2-3-Cap,获得了重组杆粒rAcBacmid-PCV-2-3-Cap,并制备出重组杆状病毒rvAc-PCV-2-3-Cap。重组病毒感染SF9细胞后,目的蛋白成功表达,并可以形成病毒样颗粒,病毒效价为3.41×10⁶ PFU/mL。本试验成功在昆虫细胞-杆状病毒系统中共表达了PCV-2-3-Cap,为防治PCV-2和PCV-3混合感染的二联疫苗研究提供了数据支持。     

狂犬病病毒磷蛋白在杆状病毒系统的表达及鉴定

为了建立狂犬病毒磷蛋白(phosphoprotein,P)的体外表达系统,本研究将RT-PCR扩增的狂犬病病毒ERA株P蛋白基因克隆于杆状病毒转移载体pFastBacHTA,构建重组质粒pFastBacHTA-P,并转染昆虫细胞Sf9包装形成重组杆状病毒。SDS-PAGE分析显示重组质粒pFastBacHTA-P转染的Sf9细胞中出现了分子量约为42 kDa的蛋白条带,Western blot证实分子量约为42 kDa的蛋白能与抗His的单克隆抗体发生特异性反应,间接免疫荧光(indirect immunofluorescence assay,IFA)分析进一步显示Sf9细胞表达的P蛋白与抗P蛋白单克隆抗体能特异性结合。这些实验证明,狂犬病病毒P蛋白不仅在Sf9细胞中获得表达,而且具有良好的免疫反应性。狂犬病病毒P蛋白杆状病毒表达体系的建立,为蛋白结构的解析和诊断试剂的研制奠定了基础。     

犬瘟热病毒血凝蛋白在昆虫细胞中的表达与抗原性分析

为获得具有天然构象及良好抗原性的犬瘟热病毒（CDV）血凝蛋白（H）,本研究以HLJ2-07毒株为模板,利用RT-PCR方法扩增出H基因,将其克隆到pFastBac^TMHTA载体中,利用大肠杆菌DH10Bac^TM同源重组构建穿梭质粒reBACmid-rH,将重组穿梭质粒转染Sf9昆虫细胞,进行杆状病毒表达。利用Western blotting对获得的重组蛋白进行鉴定及抗原性分析。同时,利用在线网站与软件对CDV H蛋白进行B细胞表位分析预测。结果显示,在杆状病毒系统中表达的H蛋白能与His-tag单克隆抗体及CDV阳性血清发生特异性反应,表明该蛋白成功表达,且具有良好的反应原性;用Swiss-model同源建模软件及B细胞表位预测软件,预测H蛋白可能具有的B细胞表位有5处,分别是175-195、240-250、365-380、480-508及526-555。本研究获得了具有天然构象及良好抗原性的CDV重组H蛋白,可为诊断试剂开发、单克隆抗体制备及表位筛选等工作奠定基础。     

呼吸道合胞病毒黏附蛋白G在昆虫杆状病毒表达系统中的表达

呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus,RSV)是在世界范围内引起婴幼儿下呼吸道感染的重要病毒之一,首次感染多发生于1岁以内的婴儿,2月龄婴儿的发病率最高.感染该病毒后不能产生持久的免疫力,可以反复感染,是造成婴幼儿住院的主要原因,也是青少年、老年人以及免疫缺陷人群呼吸道感染的重要病原,因此世界卫生组织要求对其严加监控.呼吸道合胞病毒在我国不但有散发流行,而且还曾引起数次大规模的流行.在南方,呼吸道合胞病毒流行高峰主要在炎热的夏秋季,而北方则发生在寒冷的冬春季.用单克隆抗体对我国部分地区呼吸道合胞病毒分离株亚型监测的结果表明,目前我国流行的呼吸道合胞病毒主要为A亚型.     

鹅细小病毒VP3基因在昆虫杆状病毒表达系统中的表达

为真核表达鹅细小病毒（GPV）融合蛋白VP3基因,本研究通过PCR扩增GPV FY89株VP3基因,并将其克隆至杆状病毒转移载体pFastBac/HBM-TOPO中,经双酶切、PCR及测序鉴定正确后,转化感受态细胞DH10Bac,提取重组杆状病毒穿梭质粒rBacmid-VP3,将经PCR鉴定正确的rBacmid-VP3转染Sf9昆虫细胞,连续传代后,细胞病变明显。SDS-PAGE分析结果表明成功表达了分子质量约为61 ku的VP3蛋白;Western blotting分析结果表明重组VP3蛋白具有良好的抗原性。     

水貂肠炎病毒VP2基因在昆虫杆状病毒表达系统中的表达

利用昆虫杆状病毒表达系统表达水貂肠炎病毒(mink enteritis virus,MEV) VP2 基因,表达的蛋白能够形成病毒样粒子,具有反应原性,为研究MEV新型疫苗奠定基础。采用PCR方法扩增MEV VP2 基因,将PCR产物连接到pMD18-T载体,目的基因定向克隆到pFast-BacⅠ载体中,构建重组转座载体后转化DH10 Bac感受态细胞,获得重组Bacmid 质粒后转染Sf9昆虫细胞,传毒3代,对表达蛋白进行 Western blotting鉴定。结果成功克隆MEV VP2基因。Western blotting结果证实,表达蛋白能够被MEV单克隆抗体识别。在 Bac-To-Bac 杆状病毒表达系统中成功的表达了MEV VP2蛋白,目的蛋白具有较好的反应原性。     

抗牛传染性鼻气管炎病毒囊膜gD糖蛋白的单链抗体在昆虫细胞中表达及活性检测

为了获得具有生物学活性的牛传染性鼻气管炎病毒（infectious bovine rhinotracheitis virus,IBRV） gD蛋白特异性单链抗体,试验采用PCR方法扩增杂交瘤细胞的cDNA单链抗体重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）基因,通过重叠延伸PCR及Linker序列获得完整的单链抗体基因,将单链抗体基因克隆至杆状病毒载体pFB-LIC-Bse中,构建重组转移载体pFB-VH-VL,将其转化至大肠杆菌DH10Bac感受态细胞中制备重组杆粒rBacmid-VH-VL,将重组杆粒rBacmid-VH-VL转染至Sf9细胞中获得携带单链抗体基因的重组杆状病毒。该重组杆状病毒在Sf9细胞中表达了分子质量约为30 ku的单链抗体蛋白。Western blotting结果显示,重组单链抗体蛋白能被His标签抗体特异性结合,也能特异性结合gD蛋白。间接免疫荧光试验结果显示,该单链抗体蛋白能够识别感染牛肾细胞MDBK中的IBRV。本研究在昆虫细胞中成功表达了具有识别IBRV的gD蛋白特异性单链抗体,为牛传染性鼻气管炎的诊断与治疗奠定了基础。     

非洲猪瘟病毒EP364R蛋白在杆状病毒表达系统中的表达及鉴定

非洲猪瘟病毒（ASFV）EP364R蛋白是ASFV的ERCC4核酸酶结构域。为了获得具有免疫原性的EP364R蛋白,本研究将ASFV EP364R基因构建到杆状病毒表达载体上,将重组质粒转座DH10Bac感受态中,经过3次蓝白斑筛选,获得重组BacmidEP364R质粒,将Bacmid-EP364R质粒转染至细胞中,收获上清,在正常细胞中传三代,以获得重组杆状病毒rBac-EP364R。使用Western blot和间接免疫荧光（IFA）实验鉴定重组蛋白得到表达及其免疫原性。本研究结果显示,在感染的细胞可检测到EP364R蛋白的表达,并可被His单克隆抗体特异性识别。结果表明杆状病毒系统成功表达EP364R蛋白并具有良好的反应活性,为后续开展ASFV血清学诊断和亚单位疫苗的研究奠定基础。     

蓝舌病病毒血清8型NS3蛋白在昆虫杆状病毒系统中的表达与鉴定

为表达蓝舌病病毒NS3蛋白,将蓝舌病病毒血清8型NS3序列克隆至pFastBac-HTA载体上,经转座、转染后获得重组杆状病毒rBac-NS3;用间接免疫荧光(IFA)检测NS3蛋白的表达情况,并采用亲和层析进行纯化;以Western Blot和间接ELISA方法鉴定NS3蛋白的反应原性。IFA结果显示,重组杆状病毒rBac-NS3感染的Sf9细胞可以大量表达NS3蛋白。Western Blot结果显示,纯化后的NS3蛋白与抗His单抗和绵羊蓝舌病阳性血清能够发生特异性反应;以纯化的NS3蛋白为包被抗原建立的间接ELISA方法可以区分蓝舌病阳性血清和阴性血清,进一步验证本试验利用杆状病毒表达系统成功表达并纯化出蓝舌病病毒NS3蛋白,表明纯化后的NS3蛋白具有良好的反应原性,可作为开发鉴别诊断试剂盒的备选蛋白及NS3蛋白的结构和生物学功能研究。