绵羊Nanog启动子克隆及其表达活性的检测

通过比对人、鼠、兔和牛的Nanog启动子保守区设计引物,PCR扩增绵羊Nanog基因启动子序列并分析其调控位点。将其连接到去掉自身CMV启动子的pAcGFP1-N1载体上,构建一个由Nanog启动子带动的真核表达载体(SNanog-pAcGFP1-N1),即构建一个能由该启动子序列带动并产生绿色荧光蛋白(GFP)的真核表达载体,并用脂质体法转染入终末分化细胞(小鼠成纤维细胞和绵羊成纤维细胞)、胚胎干细胞和小鼠胚胎,检测其表达活性。结果显示:成功克隆出1 836bp Nanog启动子序列,通过分析发现该序列含有SP1结合位点、CAAT框、TATA框等功能区;当转染SNanog-pAcGFP1-N1重组质粒后,小鼠胚胎和小鼠胚胎干细胞中能检测到绿色荧光,且在转染72h后达到最大荧光强度,而在小鼠成纤维细胞和绵羊成纤维细胞中不能观察到GFP。结果表明:本试验成功克隆获得绵羊Nanog启动子,所构建的真核表达载体具有在多能干细胞中特异性表达活性。     

绵羊CCL19基因启动子活性分析及其转录调控元件筛选

【目的】 鉴定绵羊趋化因子C-C基序配体19(C-C motif chemokine ligand 19,CCL19)基因启动子的核心启动子区域和关键转录因子,探究该基因在转录调控方面的作用机制。【方法】 选取绵羊CCL19基因5'-侧翼序列1 000 bp,PCR扩增启动子的7个不同长度的截短片段,并连接至pGL3-Basic质粒;将重组质粒与pRL-TK质粒共转染到293T细胞中,结合双荧光素酶报告基因检测系统分析不同截短片段的相对荧光活性。利用在线预测软件分析和筛选CCL19基因核心启动子区域内的转录因子结合位点。采用定点突变技术构建转录因子结合位点缺失的荧光素酶报告载体,与pRL-TK质粒共转染到293T细胞,分析转录因子结合位点缺失质粒的相对荧光活性。【结果】 成功构建了7个不同长度(pGL3-P、pGL3-P1、pGL3-P2、pGL3-P3、pGL3-P4、pGL3-P5及pGL3-P6)的CCL19基因启动子片段的荧光素酶报告载体;采用双荧光素酶报告基因检测系统鉴定出转录起始位点上游－256/－186 bp为CCL19基因启动子核心启动子区域,表明该区域对CCL19基因转录调控有重要作用。生物信息学分析预测到该区域存在POU5F1(-201/-189 bp)、ZBTB26(-228/-217 bp)、FOXI1(-239/-228 bp)、GLI2(-255/-243 bp)和SP2(-219/-211 bp) 5个转录因子的结合位点,并成功构建了转录因子结合位点缺失的荧光素酶报告载体。双荧光素酶报告基因检测系统分析显示,POU5F1转录因子的结合位点缺失后绵羊CCL19基因转录活性极显著降低(P<0.01),FOXI1、ZBTB26、SP2转录因子结合位点缺失后绵羊CCL19基因转录活性均极显著升高(P<0.01)。【结论】 试验成功构建CCL19基因启动子荧光素酶报告载体,确定CCL19基因启动子的核心启动子区域为转录起始位点上游－256/－186 bp,并鉴定出转录因子POU5F1结合位点可能是CCL19基因转录的重要调控位点,为下一步研究绵羊CCL19基因在先天性免疫、适应性免疫和淋巴细胞迁移等方面的功能提供理论基础。     

绵羊Oct4基因启动子的表达活性分析

Oct4(POU5f1)是诱导重编程的关键性因子,为检测克隆获得的绵羊Oct4基因启动子的表达活性,本研究将前期工作中克隆获得的绵羊Oct4基因启动子与携带有报告基因绿色荧光蛋白(GFP)的p Ac GFP1-N1载体相连接,构建由Oct4启动子驱动的真核表达载体(SPOct4-p Ac GFP1-N1),并采用脂质体转染法,分别转染小鼠和绵羊成纤维细胞、小鼠胚胎干细胞和小鼠胚胎,以检测其表达活性。结果表明:Oct4启动子序列含有Sp1结合位点和CAAT框等功能区;转染后,小鼠胚胎干细胞和小鼠胚胎中检测到绿色荧光,并且在转染72 h后达到最大荧光强度,而在小鼠成纤维细胞和绵羊成纤维细胞中未能观察到GFP的表达。说明由克隆获得的Oct4基因启动子驱动的真核表达载体具有在多能干细胞中特异的表达活性。     

绵羊高硫角蛋白启动子表达活性研究

角蛋白是羊毛主要结构蛋白,为了筛选在绵羊毛囊中具有高表达活性高硫角蛋白的内源启动子,本研究以绵羊基因组为模板,克隆得到高硫角蛋白基因启动子B2C,将B2C与去除CMV启动子的pAcGFP1-N1载体连接,构建了重组真核表达载体。采用阳离子脂质体法转染传代培养的绵羊成纤维细胞和去除透明带的小鼠4细胞期胚,分析其表达活性。结果表明,转染后48 h,在蓝光激发条件下可以检测到绵羊成纤维细胞核内及核周围绿色荧光蛋白的高表达,转染72 h后,在核内表达减弱,而细胞质内表达增加;此外,虽然利用病毒启动子构建的GFP表达载体能够在小鼠的早期胚胎细胞中表达,但由B2C启动子与GFP构建的表达载体转染小鼠早期胚胎后,未观察到绿色荧光,表明B2C启动子在绵羊成纤维细胞中具有表达活性,但不能在小鼠早期胚胎中表达。     

猪StAR基因启动子区克隆及其转录活性研究

旨在通过分析猪StAR基因启动子活性区域,探究猪StAR基因的转录调控机制,从育种学角度为提高猪繁殖力提供新思路。本研究根据Ensembl数据库已公布的猪StAR基因的5′侧翼区序列,利用在线预测软件对该基因启动子区序列信息进行分析,以大白猪基因组DNA为模板,利用特异性引物,进行PCR扩增、测序,进而构建启动子区不同缺失片段的pGL3-StAR双荧光素酶表达载体,转染293T细胞并进行活性检测。结果显示,StAR基因5′侧翼区不含有典型的TATA-box和CpG岛;成功克隆了10个含有不同长度的启动子片段,并构建了各片段与表达载体的重组质粒;转染293T细胞后经双荧光素酶活性检测发现,大白猪StAR基因5′侧翼区存在着核心启动子,其中-196~+127bp这一区域活性值最高,且显著高于其他缺失片段(P0.01),表明在+127~-196bp的区域内存在重要的正调控因素,外显子1对启动子活性起重要的调控作用。-41~-196bp为核心启动子区域,该区域存在着关键的正调控元件,包含GATA2、GATA4、SP1、ZNF263、Hoxa9、KLF16和ZNF740转录因子结合位点。本试验通过对StAR基因进行生物信息学分析,并结合不同长度启动子片段双报告基因活性检测,证实了StAR基因的5′侧翼区序列具有启动子转录活性。初步确定了该基因的启动子区域,找到了启动子的核心区域和主要调控区域,为进一步研究StAR基因转录调控机制提供理论依据。     

绵羊生殖道中ghrelin基因的克隆及其表达

从雌性绵羊输卵管、子宫体、子宫颈、阴道组织中提取总RNA,根据已获得的绵羊ghrelin基因cDNA序列设计特异性引物,采用RT—PCR方法扩增出了绵羊ghrelin基因;将扩增产物克隆于pMD19-T载体后进行测序。以β-肌动蛋白（β-actin）基因作为内参,采用半定量RT—PCR法扩增ghrelin基因,经琼脂糖凝胶电泳后,应用凝胶成像分析系统计算雌性绵羊不同生殖道组织中ghrelin基因的表达量。结果显示,从雌性绵羊生殖道各组织均扩增出了233bp的ghrelin基因片段;ghrelin基因在子宫体的表达量最高,输卵管内次之,子宫颈和阴道内最低。表明,ghrelin对雌性绵羊生殖系统的调节及生殖激素的分泌等具有重要作用。     

绵羊角蛋白Kap6.1启动子的克隆及活性检测

克隆绵羊角蛋白Kap6.1启动子,为下一步构建真核毛囊特异表达载体奠定基础。以绵羊基因组为模板,利用PCR方法克隆绵羊角蛋白结合蛋白Kap6.1启动子,并用此启动子置换真核表达载体pEGFP-N1的原始启动子CMV,构建pKap-EGFP质粒,通过转染内蒙古阿尔巴斯绒山羊胎儿皮肤成纤维细胞鉴定启动子活性。结果显示:克隆所获得的启动子序列与NCBI上发表序列匹配率为99.6%,启动子的特征序列CAAT框和TATA框完整,并且分别位于序列的921位和878位,pKap-EGFP质粒转染绒山羊成纤维细胞后Kap能启动GFP的表达,与对照组相比活性良好。本研究通过克隆获得了绵羊角蛋白结合蛋白Kap6.1启动子,并观测到其能启动GFP在山羊胎儿皮肤成纤维细胞中表达。     

绵羊CS-3基因的克隆及其在绵羊不同组织中的表达研究

试验首次克隆了绵羊CS-3基因序列,预测了CS-3蛋白的结构、功能及其特点,并分析了其在不同组织中的表达情况及CS-3基因与肉质性状的相关性。结果显示,CS-3基因cDNA全长838 bp,完整的开放阅读框(ORF)为70-804 bp,编码244个氨基酸。氨基酸序列中存在3个保守结构域,蛋白质二级结构以无规卷曲和α-螺旋为主,富含疏水区,存在多个磷酸化位点和1个蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)的磷酸化位点。通过实时荧光定量RT-PCR技术分析了CS-3基因在凉山半细毛羊部分组织中的表达情况。结果表明,CS-3基因主要在凉山半细毛羊的心脏和肌肉中表达,15 d时各组织中心脏的表达量最高,极显著高于其它各组织(P＜0.01);在心脏和肌肉组织中,CS-3基因的表达量随着年龄的增长而减少,其中在60 d时心脏中的表达量最高。     

猪DKK1基因启动子区的克隆及其活性分析

旨在初步探索DKK1基因转录调控机制,本研究利用启动子在线预测软件分析了该基因启动子区序列特征,根据Ensembl数据库已公布的猪DKK1基因的5′侧翼区序列,设计特异性PCR引物进行扩增、测序,进而构建启动子区不同缺失片段的pGL3-DKK1双荧光素酶表达载体,分别转染293T细胞和Hela细胞,并进行双荧光素酶报告基因检测。结果显示,DKK1基因启动子中含有1个TATA-box、多种转录因子和1个CpG岛;DKK1基因启动子对239T细胞具有偏好性,其中p-1 679/+292bp启动子片段活性最高,且显著高于其他缺失片段(P0.01)。-953~-1 679bp为核心启动子区域,-586~-953bp区域可能存在负调控元件,在-953~-1 679bp区域可能存在正调控元件。本试验通过对DKK1基因进行生物信息学分析并结合不同长度启动子片段双报告基因活性检测,证实了DKK1基因的5′侧翼区序列具有启动子转录活性,并初步确定了该基因的启动子区域,找到了启动子的核心区域和主要调控区域,为进一步研究DKK1基因转录调控机制奠定基础。     

鸡卵清蛋白基因启动子克隆及其活性的检测

为了获得鸡输卵管特异表达的卵清蛋白基因启动子,研究在采用PCR方法从鸡心基因组DNA中扩增卵清蛋白基因启动子(5OV)的基础上,将其与p Ac GFP1-N1载体连接构建真核表达载体p Ac GFP1-5OV,并采用脂质体法将p Ac GFP1-5OV分别转染鸡输卵管上皮细胞和鸡成纤维细胞后,观察其在两种细胞中的表达活性。结果表明:利用克隆获得的5OV构建的真核表达载体p Ac GFP1-5OV在转染鸡输卵管上皮细胞后第24小时,在荧光倒置显微镜下可见绿色荧光,而转染鸡成纤维细胞后未观察到GFP表达。说明所克隆的5OV具有在输卵管上皮细胞特异表达的活性。     

猪速激肽3基因启动子活性及其表达调控的初步研究

为了确定猪速激肽3基因(tachykinin3,TAC3)核心启动子区域,探索作用于该区域的转录因子对TAC3的调控作用,以猪耳组织DNA为模板,PCR扩增TAC3基因5'端不同长度缺失片段,并构建至p GL3-basic载体,转染猪卵巢颗粒细胞,通过双荧光素酶活性分析确定核心启动子区域,染色质免疫共沉淀技术(Ch IP)验证转录因子与基因启动子区的作用,构建转录因子超表达载体和小干扰RNA(siRNA)转染至猪卵巢颗粒细胞,qRT-PCR检测TAC3基因mRNA表达变化。结果显示:成功构建了TAC3基因5'端不同长度缺失片段,通过双荧光素酶报告系统分析发现,-1 310/-544区域为TAC3基因的核心启动子区,-2 486/-1 633区域可能存在负向调控元件,-1 310/-544区域可能存在正向调控元件。Ch IP检测发现转录因子C/EBPβ和YY1分别结合在TAC3基因的-653/-639和-873/-856区域;超表达C/EBPβ和YY1后,TAC3基因启动子活性显著升高(P0.05)、mRNA表达水平显著上调(P0.01);干扰C/EBPβ后,TAC3基因mRNA表达水平显著下调(P0.01);干扰YY1后,TAC3基因启动子活性显著降低(P0.05)。结果表明:转录因子C/EBPβ、YY1结合在TAC3基因的核心启动子区域,促进TAC3基因的转录活性。     

猪Nhlh2基因启动子活性及其表达调控的初步研究

旨在研究母猪Nhlh2基因启动子活性及其与转录因子之间的调控关系,为探索该基因的表达调控提供分子水平的依据,也为研究母猪繁殖机制提供一定的参考。本研究以猪卵巢组织DNA为模板,PCR扩增Nhlh2不同长度的启动子缺失片段,克隆到pGL3-basic载体构建启动子报告基因重组质粒,并将其转染到猪卵巢颗粒细胞,测定相对双荧光素酶活性值;通过染色质免疫共沉淀技术(ChIP),研究Nhlh2启动子与YY1、C/EBPβ蛋白之间的相互作用;随后构建转录因子超表达、突变载体和小干扰RNA(siRNA),利用双荧光素酶检测系统进行活性验证。经双荧光素酶报告系统检测发现,Nhlh2基因的P7(-238~+129)区域启动子转录活性最高,-654~-238片段范围可能存在负调控元件,-238~-20区域可能存在正调控元件;通过生物信息学分析和ChIP验证,Nhlh2启动子区-101~-85和-153~-140区域分别是转录因子YY1和C/EBPβ的结合位点;突变YY1和C/EBPβ的结合位点后,P7的双荧光活性显著上调;超表达YY1和C/EBPβ后,P7的双荧光活性显著下调;干扰YY1和C/EBPβ的表达后,P7的双荧光活性显著上调。本研究确定了猪Nhlh2基因的核心启动子区域为-238~+129,YY1和C/EBPβ分别结合在Nhlh2基因启动子区的-101~-85和-153~-140区域,抑制猪Nhlh2基因的转录活性。     

猫干扰素基因的克隆表达及其活性测定

根据已知人、马、牛、羊、兔、鹿等物种体内IFNω的基因序列分析,设计引物进行扩增。将扩增基因克隆于原核表达载体pET-His。将重组表达载体转入宿主菌进行诱导表达,表达产物以包涵体的形式存在,大小约为20kDa,表达量达到28%。将表达产物复性纯化处理后加入猫肾上皮细胞(CRFK),用水泡性口炎病毒(VSV)攻毒,测出重组IFNω的生物活性达到1.64×106U/mg,重组蛋白质的含量约为18mg/L。     

绵羊清道夫受体MARCO基因启动子克隆及生物信息学分析

为了分析绵羊清道夫受体MARCO基因的启动子序列特点,初步研究其功能及转录调控机理,以绵羊肺组织DNA为模板,通过PCR扩增绵羊MARCO基因启动子序列,对其序列进行生物信息学分析,并构建双荧光素酶报告基因载体。结果显示,成功克隆绵羊MARCO基因启动子,大小为1 002 bp;预测了其核心活性区域,发现有1个潜在的活性区域位于5′端-790～-741,同时发现了1个TATA-box元件和多个转录因子结合位点,未发现CpG岛。结果表明,位于绵羊MARCO基因启动子区域的TATA-box元件和Sp1、NF-1、NF-κB、C/EBPalp、c-Jun等转录因子,可能影响绵羊MARCO基因启动子的激活,为后续研究MARCO基因的转录调控机理提供了参考依据。     

家蚕escargot基因的克隆及启动子活性鉴定

果蝇escargot(esg)基因作为表皮成组织细胞标记基因,可以指示果蝇成虫表皮形成过程。果蝇成虫雌较雄多1个体节,家蚕成虫与果蝇体节数相反。利用同源检索和RACE克隆获得果蝇esg在家蚕中的同源基因Bmesg,发现其ORF为1 128 bp,共编码375 aa。进一步克隆该基因上游约2 000 bp的调控序列esgp2k,细胞转染证明esgp2k有驱动活性。通过启动子截短及荧光素酶活性分析,证明起始密码子上游-270～-190 bp为esgp2k活性关键区域,并成功克隆长270 bp的核心启动子esgp7。上述结果为寻找家蚕成组织细胞潜在分子标记,进而研究家蚕雌雄体节数量差异的分子机制奠定了基础。     

广西麻鸡CYP19A1基因的克隆、序列分析和组织表达谱研究

为了克隆和分析广西麻鸡CYP19A1基因的编码区序列和产蛋期CYP19A1在各组织中的表达谱,根据Gen Bank已公布的鸡CYP19A1基因序列,设计特异性引物,从广西麻鸡卵巢PCR扩增CYP19A1基因编码区序列,将其克隆至p MD-18T载体,测序获得CYP19A1基因全序并对其进行序列分析。设计定量引物,对卵巢、睾丸和子宫等16个组织CYP19A1的表达谱进行了分析。结果表明:广西麻鸡CYP19A1基因的编码区长度为1 509 bp,共编码502个氨基酸。与参考序列相比,存在两处同义突变,一处错义突变(天冬氨酸突变为谷氨酸);物种间的同源性分析显示,广西麻鸡CYP19A1基因与鸡(Gallus gallus)、牛(Bos taurus)、马(Equus caballus)、人(Homo sapiens)、猕猴(Macaca muiatta)、小鼠(Mus musculus)、猪(Sus scrofa)的序列同源性分别为99.8%、72.5%、84.3%、84.4%、97.4%、81.5%、80.3%;进化树分析显示,广西麻鸡与鸡亲缘关系最近,与猪的亲缘关系最远。产蛋期CYP19A1的表达谱显示,CYP19A1在产蛋期特异在卵巢中表达,在其他组织中的表达量极低或不表达。结果为进一步研究鸡CYP19A1基因对鸡产蛋性能的影响奠定了基础。     

绵羊卵巢PSP94基因的克隆及生物信息学分析

本研究克隆绵羊卵巢微精蛋白β(PSP94)基因,旨在预测其编码蛋白的结构与功能。以河北小尾寒羊作为试验动物,提取卵巢组织RNA,采用RT-PCR和pMD19-T载体,克隆测序得到PSP94基因序列,结合生物信息学方法分析其生物学特性。结果表明,绵羊发情期和间情期卵巢中均有PSP94基因表达,克隆得到的绵羊PSP94长度为462 bp,开放阅读框(ORF)长度为336 bp,编码111个氨基酸,系统聚类分析图分析表明绵羊与牛遗传距离较近;生物信息学预测显示,该蛋白属于稳定酸性亲水蛋白,有5个磷酸化位点和2个N-糖基化位点,亚细胞定位于胞外,属于分泌蛋白,N端有信号肽,没有跨膜结构域。蛋白质二级结构主要结构元件是α-螺旋、延伸链和不规则卷曲。     

牛MYOZ2基因启动子克隆及活性分析

旨在克隆测定牛肌原调节蛋白2基因(Myozenin2,MYOZ2)启动子的全长序列,进行活性区域分析,为牛MYOZ2基因功能和表达调控机理研究提供理论依据。通过5′RACE方法确定牛MYOZ2基因转录起始位点;采用PCR技术,以牛基因组为模板克隆MYOZ2基因启动子序列。利用在线软件分析启动子区域中可能包含的转录因子结合位点。依据分析结果重新设计引物,构建7个包含不同缺失片段的双荧光素酶报告基因载体,转染C2C12细胞系,利用双荧光素酶系统检测不同片段的启动子活性。结果表明,克隆得到牛MYOZ2基因启动子序列2 065bp,确定MYOZ2基因的转录起始位点;MYOZ2基因片段-84/+125荧光素酶相对活性极显著高于空载体pGL3-Basic(P0.01),MYOZ2基因片段-683/+125荧光素酶相对活性极显著高于基因片段-263/+125(P0.01)。MYOZ2基因启动子核心区域位于-84/+125bp,而且MEF2,SRF,MyoD,YY1等转录因子可能参与MYOZ2基因的转录调控。     

水牛NOBOX基因启动子克隆及转录活性检测

为了对广西本地水牛新生儿卵巢同源盒基因(NOBOX基因)5'侧翼序列进行克隆、生物信息学分析及其转录活性进行研究,试验采用Gen Bank上已公布的黄牛NOBOX基因5'侧翼序列设计引物,以广西本地水牛血液基因组为模板扩增NOBOX基因5'侧翼序列并进行生物信息学分析。结果表明:研究成功克隆得到广西本地沼泽型水牛NOBOX基因5'侧翼序列及部分CDS区序列,共2 906 bp。同源性分析结果表明,其与地中海水牛、黄牛、绵羊和山羊的相似性分别为99%、96%、91%、91%。试验对NOBOX基因5'侧翼序列2 000 bp进行启动子及转录因子结合位点预测,在其翻译起始位点上游-868/-853 bp处存在TATA box,启动子区存在GATAs、Foxo1、Foxo3、Nobox、Stat1、Stat3、Stat4、Stat5a、Stat5b、Stat6、YY1等反式作用元件结合位点,其中GATAs家族基因在NOBOX启动子区存在多个结合位点,且同一位点又存在多个GATA基因结合。水牛NOBOX启动子能够启动EGFP在HEK-293T细胞上表达,但表达非常微弱,也能够启动EGFP在CHO细胞上表达,且与CMV启动EGFP在CHO细胞中的表达强度相似,表明水牛NOBOX是个强启动子。