基于多拷贝基因的葡萄皮尔斯病菌PCR检测方法

正葡萄皮尔斯病是由木质部限制性γ变形菌纲细菌Xylella fastidiosa subsp.fastidiosa(Xff)引起的一种葡萄上的毁灭性病害,可通过葡萄繁殖材料和玻璃翅叶蝉Homalodisca coagulata等昆虫媒介进行传播。该病主要在美洲的美国、墨西哥、阿根廷、秘鲁等国家发生流行(Davis et al.,1978)。最近,Su et al.(2013)证实该病在台湾发生,这是在亚洲地区的首次报道。目前国外对Xff的分子检测主要是基于单拷贝基因的常规PCR和实时荧光定量PCR方法     

番茄溃疡病菌PCR快速检测技术

番茄溃疡病是一种严重危害番茄生产的细菌性病害，许多国家将其列为检疫性病害。利用ITS通用引物扩增了番茄溃疡病菌（Clavibacter michiganensis subsp．michiganensis）的ITS序列，并进行克隆测序。根据序列比较结果设计了引物BT1和BT2，该引物特异性好，能专一扩增出268bp电泳条带，而马铃薯环腐病菌等不同亚种、不同属的细菌及健康的番茄材料均无扩增条带。从接种但未显症番茄苗叶片及人工模拟染菌种子上提取总DNA，以此为模板均能稳定地扩增出特异性目的条带。该方法直接对种子或植株进行检测，不需进行病原菌分离培养，快速简便，适用于出入境检验检疫及种苗健康检测领域。     

双重PCR技术检测水稻白叶枯病菌和细菌性条斑病菌

本研究分别设计并合成了白叶枯病菌的专化性引物OSF1-OSR1和条斑病菌的专化性引物XoocF-XoocR。用这两对专化性引物分别对118个参试菌株进行PCR扩增,并且通过将这两对专化性引物配对以及不断优化PCR反应条件,成功建立了双重PCR技术,同时对水稻白叶枯病菌和细菌性条斑病菌实施快速精确的检测。     

玉米细菌性枯萎病菌PCR检测

 根据GenBank中玉米细菌性枯萎病菌及其近似种的16S序列差异,设计了一对玉米细菌性枯萎病菌特异性引物Ps2r/Ps3r,该引物能从供试的7株玉米细菌性枯萎病菌中特异性扩增出一条268 bp的预期条带,供试的32株近似种菌株都没有扩增产物;与国内外文献报道的其它5对特异性引物相比,除引物PSA/PSB外,引物DEP1/DEP2、ES16/ESIG2c、HRP1d/HRP3c和CPSL1/CPSR2c在不同程度上对部分近似种菌株出现了扩增。试验结果表明,引物Ps2r/Ps3r和PSA/PSB能特异性扩增玉米细菌性枯萎病菌,得到预期的扩增产物。对不同系列稀释度的DNA和玉米样品中病菌的检测结果表明,由引物Ps1/Ps4和Ps2r/Ps3r组合的巢式PCR方法的检测灵敏度高于引物ITSA/ITSB和PSA/PSB组合的巢式PCR方法,也高于Bio-PCR检测方法;前者可以检测到玉米种子中300 cfu/sample的目的细菌,该检测方法在进境玉米种子样品玉米细菌性枯萎病菌的检疫中具有比较理想的应有潜力和推广价值。     

应用PCR技术检测甘蔗各部位宿根矮化病病菌

甘蔗宿根矮化病(ratoon stunting disease,RSD)是中国甘蔗产区一种主要病害。为保证甘蔗健康种苗生产,应用实验室建立的甘蔗宿根矮化病菌PCR检测技术对甘蔗品种粤糖00-236、新台糖22宿根蔗和其健康种苗各部位进行检测。检测结果表明,两品种宿根蔗的老根、新根、老叶、新叶、叶脉、蔗汁都检测到RSD;茎尖和腋芽部位均未检测出RSD。因此,采取腋芽或茎尖部位进行甘蔗组培生产健康种苗,可有效地除去甘蔗RSD病菌。     

PCR技术快速检测玉米内州萎蔫病菌研究

玉米内州萎蔫病是北美玉米生产中的严重病害,为防止其传入我国,本研究采用Clavibacter michiganensis不同亚种的转录间隔区序列,设计了特异性的PCR引物,对C.michiganensis种下不同亚种的DNA进行了PCR扩增反应,结果表明,只有玉米内州萎蔫病菌的特异性扩增得到大小为170bp的目标片段,且仅有此一条明显的PCR扩增产物,C.michganensis种下其他亚种无扩增产物。PCR反应的灵敏度为4.36×105cfu/mL和1.56×102pg,可以满足检疫的要求。     

利用实时荧光定量PCR 技术检测油菜菌核病菌

 采用高通量实时荧光定量PCR 技术建立检测和监测油菜菌核病菌群体数量的方法。利用油菜菌核病菌(Sclerotiniasclerotiorum)的茁-微管蛋白基因内含子序列的特异性,设计引物对SclSF (5'-CTCAAATCTCCGAAAGTT -3') / SclAF (5'-TGCAGACGGGTAATATG -3'),建立和优化了SYBR Green 玉实时荧光定量PCR 检测体系。结果表明,该引物对能够从8种所测试的十字花科植物常见病原真菌中特异性扩增出油菜菌核病菌;所建立的实时定量PCR 技术可应用于油菜病叶和病茎中菌核病菌的早期检测及菌核病的预测预报。     

利用实时荧光PCR技术检测风信子黄腐病菌

风信子黄腐病菌是我国禁止入境的病原细菌之一,我国目前尚无该病的发病报道.本研究根据风信子黄腐病菌基因组16S-23S ribosomal RNA intergenic spacer保守序列,设计并合成了1对特异性引物和1条具有稳定点突变特异性探针进行实时荧光PCR检测,风信子黄腐病菌有很强的荧光信号,供试的其它7种病原细菌菌株均没有荧光产生.与常规PCR相比,实时荧光PCR检测特异性强,灵敏度高,适合病害的快速诊断和口岸检验检疫应用.经优化反应条件,建立了稳定的风信子黄腐病菌实时荧光PCR检测方法.     

利用PCR技术专化性检测水稻细菌性条斑病菌

 设计水稻细菌性条斑病菌的专化性引物,并建立相应的PCR检测体系,分别对31株水稻细菌性条斑病菌和15株水稻白叶枯病菌及其它相关菌株进行了测试。结果表明,建立的PCR检测体系可专化性检测水稻细菌性条斑病菌,而水稻白叶枯病菌和其它菌株均没有扩增信号。检测灵敏度可以达到20个细菌菌体,从自然发病和人工接种发病的水稻种子成功地检测出条斑病菌。实现了对水稻细菌性条斑病菌的快速和专化性检测。     

江西省大余县柑橘黄龙病菌PCR检测

采用PCR扩增和核苷酸序列测定技术,对分别采自江西省大余县青龙镇郭屋坝果园和丰顺果园的各5份疑似柑橘黄龙病样品进行病原检测。结果表明:2个青龙郭屋坝果园样品中检测到柑橘黄龙病菌,分别命名为DY-LAS01和DY-LAS02,其他8份样品中则未检测到该病菌。此结果表明大余县已有柑橘黄龙病发生,希望引起当地有关部门的高度重视。     

基于ITS与factor1-alpha序列桉树焦枯病菌的双重PCR快速检测

桉树焦枯病是威胁桉树生长的首要病害,建立准确、有效的桉树焦枯病的PCR快速检测技术是桉树焦枯病前期诊断的必要手段。试验以桉树焦枯病原菌(Calonectria morganii)DNA为模板,分别以ITS和factor 1-alpha序列为靶区域,针对Calonectria属和C.morganii设计了CYS1/CYS2和EF-S-1/EF-A-1两对特异性引物,建立了基于属和种的双重PCR快速检测技术。利用引物CYS1/CYS2可以从全部Calonectria属的供试菌株中扩增出一条351bp大小的条带,单独用特异性引物EF-S-1/EF-A-1进行PCR扩增,仅病原菌扩增出197bp的条带,同时使用2对引物时,病原菌可扩增出两条明亮条带。当体系退火温度为53℃时,DNA灵敏度检测限度达到450fg/μL。野外田间时效检测结果显示,该体系能准确检测出不同发病程度桉树组织上的病原菌,完全符合田间检测的要求。这是关于桉树焦枯病快速检测的首次报道。     

基于小麦白粉病菌rDNA ITS序列的PCR分子检测

 Wheat powdery mildew(Blumeria graminis f.sp.tritici) is the one of main wheat diseases in China.Based on the internal transcribed spacer(ITS) sequences of ribosome of B.graminis f.sp.tritici,three molecular primer pairs(F1/R,F2/R and F3/R) were designed to detect the fungal pathogen of wheat powdery mildew.The species specificity of these primers was confirmed.F1/R was demonstrated a higher sensitivity than the other two primer pairs,and could detect as low as 1 pg DNA of B.graminis f.sp.tritici.Furthermore,F1/R primer pair was used to detect the pathogen DNA extracted from wheat leaves showing chlorosis and typical symptoms of powdery mildew caused by artificial inoculation with B.graminis f.sp.tritici.The preliminary results demonstrated the usefulness of this primer pair and its potential applications in efficient detection of wheat powdery mildew pathogen from leaves with latent infections at early growth stages of wheat.     

甘蔗赤条病菌巢式PCR检测

甘蔗赤条病是由燕麦食酸菌燕麦亚种(Acidovorax avenae subsp.avenae,Aaa)引起的一种世界性甘蔗细菌病害。为建立Aaa快速、灵敏的检测技术,根据该病菌16S~23S核糖体基因及其转录间隔区ITS分别设计2对特异性引物,建立Aaa巢式PCR检测方法。结果表明,建立的巢式PCR方法对Aaa标准菌株、水稻食酸菌A.oryzae具有特异性,可扩增出454 bp目的条带,对近缘种德氏食酸菌A.delafieldii及其它科属的红色雷夫松氏菌Leifsonia rubra和甘蔗宿根矮化病菌L.xyli subsp.xyli未扩增出任何条带。以感染Aaa的甘蔗叶片总DNA、含ITS靶标片段的质粒DNA标准品及Aaa标准菌液为模板,巢式PCR灵敏度最低检测限分别为10 fg/μL、10拷贝/μL和36 CFU/mL,是常规PCR灵敏度的1 000倍。应用巢式PCR和常规PCR对14份有赤条病症状的田间甘蔗叶片样品进行平行检测,阳性检出率分别为100.0%和28.6%,表明巢式PCR比常规PCR检测方法具有更高的灵敏度。本研究建立的巢式PCR方法适合于田间甘蔗赤条病害的分子检测与鉴定。     

甘蔗宿根矮化病菌巢式PCR检测

为了探索甘蔗宿根矮化病快速检测技术,以细菌16S-23S rDNA内转录间隔区(ITS)通用引物ITS1/ITS2为第1轮引物,以甘蔗宿根矮化病菌特异引物Lxx1/Lxx2为第2轮引物,建立甘蔗宿根矮化病菌巢式PCR检测技术。巢式PCR能扩增出438 bp的目的条带,其核苷酸序列与巴西、澳大利亚及美国甘蔗宿根矮化病菌分离物核苷酸序列同源率为100%或99.8%;其检测灵敏度为10fg甘蔗宿根矮化病菌基因组DNA,较常规PCR提高100倍;样品检测结果也表明巢式PCR检测灵敏度明显优于常规PCR,可用于+1片嫩叶和心叶等微量病菌样品的检测。     

实时荧光PCR检测瓜炭疽病菌

采用实时荧光PCR技术建立了瓜炭疽病菌(Colletotrichum orbiculare)的检测方法。根据瓜炭疽病菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)基因和谷氨酰胺合成酶(GS)基因序列,设计了该病菌特异性引物和TaqMan探针,并对所设计的引物和探针的反应条件进行了优化。采用本试验建立的实时荧光PCR方法对瓜上的其他菌株及近似菌株进行检测,可将瓜炭疽病菌与其他病原菌区分开。灵敏度试验表明,25μL体系中只要有39.6pg的核酸量就可以被检测到,检测灵敏度达到1.584pg/μL,比普通PCR检测灵敏度高100倍。同时对田间采集的病株和未知样品进行的检测证明了引物和TaqMan探针的特异性。     

猕猴桃果腐病菌PCR和实时荧光PCR检测

为了快速、准确地鉴定猕猴桃果腐病菌(Neofabraea actinidiae),根据GenBank中N. actinidiae的β-tubulin序列设计特异引物NAC-F/R和探针NAC-P,建立了常规PCR和实时荧光PCR检测方法。利用引物NAC-F/R扩增供试的4株N. actinidiae能得到389 bp的预期目标条带,但扩增其他20个非N. actinidiae供试菌株不能得到预期产物,检测灵敏度为140 pg菌丝体DNA;探针NAC-P对供试4株N. actinidiae表现为阳性扩增,而对其他菌株和空白对照均表现为阴性扩增,检测灵敏度可达14 pg菌丝体DNA,比常规PCR高10倍。样品检测试验结果表明两种PCR方法可用于口岸植物检疫中快速、准确地检测猕猴桃果腐病菌。     

我国甜菜褐斑病菌的PCR快速检测

由甜菜尾孢菌Cercospora beticola引起的甜菜褐斑病(Cercospora leaf spot, CLS)是甜菜生产中危害较重的叶部真菌病害,导致甜菜产量和含糖量下降。由于CLS早期症状不易识别,传统病斑形态目测诊断法易错过最佳防治时期,因此分子检测方法对于CLS的准确监测十分重要。迄今为止,国外已报道的分子检测法主要有基于甜菜尾孢菌 rRNA-genes的actin gene编码区和ITS区结合限制性酶切的分子检测法、基于 rRNA-genes的ITS区结合测序的检测方法和基于大量尾孢属真菌RAPD多态性分析而设计的特异引物Cebe2检测法。目前,我国对甜菜尾孢菌的分子检测工作尚未见报道,为此,本试验对甜菜尾孢菌上述3种主要分子检测方法进行了比较,并进一步验证了特异引物Cebe2的可靠性,初步确立了我国甜菜尾孢菌的快速分子检测技术体系,为我国CLS的早期准确检测和有效控制提供技术支持。     

洋葱腐烂病菌PCR检测方法的建立

为了快速准确检测洋葱腐烂病菌（Burkholderia gladioli pv. alliicola,简称Bga）,根据GenBank中Bga与相关种的序列差异设计特异引物BG5/BG7和探针Bga-P,建立了Bga常规PCR和荧光PCR检测方法。测试结果表明,引物和探针对供试的11株Bga菌株表现为阳性反应,其他64株供试菌株和空白对照均为阴性。常规PCR和荧光PCR方法的检测灵敏度分别为24 pg和240 fg菌体DNA。美国、法国、意大利等国进境的80批次洋葱种子样品的检测结果显示,这两种方法的阳性检出率分别为7.5%和12.5%。选取阳性样品进行病菌分离,成功从2批次法国进境洋葱种子中分离到目的菌。本文建立的洋葱腐烂病菌PCR检测方法可为口岸检测部门提供更高效、灵敏和特异的检测手段。