进境阿根廷大豆中苹果壳色单隔孢溃疡病菌的检测与鉴定

从阿根廷进境的一批大豆中分离到一株疑似苹果壳色单隔孢溃疡病菌菌株。该菌株在燕麦琼脂培养基(OA)上产生大量的分生孢子器及分生孢子;分生孢子长椭圆形,单胞,无色,继续培养3 d后变褐色,产生1隔膜,个别2隔膜;采用真菌通用引物(ITS4/ITS5)扩增和测序,该菌株与GenBank中已登录的苹果壳色单隔孢溃疡病菌16个菌株的ITS序列同源性最高,均为99%;菌株接种梨、苹果和大豆幼苗不同部位后,均发病。经形态特征鉴定、分子生物学检测及致病性测定,该菌株鉴定为苹果壳色单隔孢溃疡病菌。     

苹果壳色单隔孢溃疡病菌在原木上的侵染及热处理技术研究

 本研究从欧洲进境水曲柳原木上分离获得了检疫性病原真菌苹果壳色单隔孢溃疡病菌(Botryosphaeria stevensii Shoemaker),分别测定了烘箱热处理和炭化烘房热处理对该病菌存活的影响。结果发现苹果壳色单隔孢溃疡病菌可以侵染至原木的木质部组织,原木中心处理温度达到60℃并持续6 h可杀灭原木中携带的病菌。研究结果对进境原木携带苹果壳色单隔孢溃疡病菌及其它重要病菌的检疫处理有较好的参考价值。     

进境美国苹果星裂壳孢果腐病菌的首次截获-病原真菌的鉴定及风险分析

 广东口岸从美国华盛顿输华苹果（Malus domestica）中截获可疑腐烂病果, 症状表现为果梗凹腐或萼凹腐,病部果皮暗褐色至黑色,病健交界处纹带褐色,分生孢子器黑色、颗粒状,直径0.3~0.8 mm,部分埋生或近表生, 显微镜检可见无色单胞的分生孢子。分离物生长温度-3~25℃, 最适为20℃, 经柯赫氏法则验证确认为截获病果的病原菌。Blast分析表明从分离物基因组中扩增到的ITS基因与GenBank中已知的Phacidiopycnis washingtonensis菌株ITS序列同源性达100%。经形态特征、培养性状及ITS系统发育分析, 将病原菌鉴定为苹果星裂壳孢果腐病菌（Ph. washingtonensis Xiao& J.D.Ro-gers,2005）,在分类上隶属于半知菌亚门球壳孢目星裂壳孢属(Phacidiopycnis),此截获鉴定属我国首次。迄今为止我国尚未有该病菌发生为害的报道,本文就此病菌对我国苹果和梨产业的潜在风险进行了评估分析。     

进境苹果中3种检疫性真菌三重PCR同步检测方法的建立

苹果壳色单隔孢溃疡病菌(Botryosphaeria stevensii)、美澳型核果褐腐病菌(Monilinia fructicola)和丁香疫霉病菌(Phytophthora syringae)是为害多种水果和其他植物的重要检疫性真菌,均能侵染苹果果实导致烂果,并造成严重的经济损失。本研究设计和筛选了3对特异性引物,建立了同步检测3种检疫性真菌的普通PCR和三重PCR方法。设计的引物Bs-368 F/R、M.cola 986F/R和Psy1/Psy2能分别特异性地扩增出B.stevensii、M.fructicola和P.syringae所有供试菌株的DNA,而对相应多个近似种的DNA则无扩增。灵敏度试验结果表明,上述3对引物分别检测B.stevensii、M.fructicola和P.syringae DNA的灵敏度是41.7 pg、47.4 pg和0.375 pg,三重PCR同时检测到3种病菌DNA的灵敏度是4.44 ng。该方法可以满足对进境苹果果实携带的苹果壳色单隔孢溃疡病菌、美澳型核果褐腐病菌和丁香疫霉病菌的快速初筛,加速进境新鲜水果的快检快放。     

进境苹果果实中苹果牛眼果腐病菌的检疫鉴定

对来自美国的苹果进行了病原菌分离,结果在果实中分离到1株疑似苹果牛眼果腐病菌的菌株Nk-2968。对其进行了病原菌形态学观察、致病性测定并结合分子生物学方法检测,实验结果表明,菌株Nk-2968在PDA培养基上生长良好,能产生大量的分生孢子;经真菌通用引物(ITS4/ITS5)及β-tubulin引物(Bt-T2m-Up/Bt-LVL-Lo)分别扩增和测序,菌株Nk-2968与Gen Bank中登录号AF281462.1、HG793110.1和HG793112.1的菌株序列同源性达到100%;病菌接种苹果8 d后开始发病。根据上述实验结果,将分离获得的菌株Nk-2968鉴定为苹果牛眼果腐病菌(Neofabraea kienholzii)。这是我国口岸首次在进境的苹果果实上截获该危险性有害生物。     

苹果壳色单隔孢溃疡病菌的适生区预测

苹果壳色单隔孢溃疡病菌(Botryosphaeria stevensii)是一种寄主十分广泛的进境植物检疫性真菌,在我国尚无分布。近年来,我国口岸多次截获该病菌。为更好地实现对该病菌的针对性检疫防控,本研究采用DIVA-GIS软件对该病菌在我国的潜在适生区进行了预测,并对其适生区内寄主情况进行了深入分析。研究结果表明,苹果壳色单隔孢溃疡病菌在我国的适生区域较为广泛,主要分布在我国华东、华北和华中地区;该病菌在其适生区域内存在大量寄主,尤其是水果类作物,林木寄主也有较多分布。因此,该病菌一旦传入我国,极可能造成十分严重的经济损失,值得高度警惕。本文最后提出了针对苹果壳色单隔孢溃疡病菌的风险防控建议。     

应用实时荧光PCR检测苹果果实球壳孢腐烂病菌

根据苹果果实球壳孢腐烂病菌(Sphaeropsis pyriputrescens Xiao&J.D.Rogers)ITS区序列设计特异性引物和TaqMan荧光探针,建立了苹果果实球壳孢腐烂病菌的实时荧光PCR检测方法。该方法能够特异性检测苹果果实球壳孢腐烂病菌,供试的目标菌株检测结果为阳性,而苹果轮纹病菌、苹果炭疽病菌、苹果干腐病菌和苹果褐腐病菌、苹果腐烂病菌等5种对照菌株检测结果为阴性。该方法具有快速、简便、准确的优点,适合于该病害的快速诊断和口岸检验检疫运用。     

桑里白粉病菌重寄生真菌的分离与鉴定

为了解桑里白粉病菌的重寄生真菌种类,通过分离和寄生性验证,获得2个桑里白粉病菌重寄生真菌菌株HP8和HP9,这两个菌株寄生闭囊壳后,子囊及子囊孢子溃解.菌株HP8菌落绿色,菌丝体无色至褐色,菌丝有隔膜,分生孢子梗结节状膨大,分生孢子椭圆形、单胞、褐色或无色,ITS序列(MT463536)与尖孢枝孢Cladosporiu...     

瓜拟多隔孢引起的砂田西瓜叶疫病

 近年来,甘肃省白银市靖远县的一些砂田西瓜中出现了严重的叶疫病,严重田块病株率超过70%。2018年7月,从靖远县高湾乡罹病西瓜叶片上分离得到拟多隔孢属Stagonosporopsis真菌,病叶检出率达100%。采用离体叶片和植株接种法评价单孢分离菌株XG-3对西瓜和甜瓜的致病性,所有接种处理在24 h内均发病显症而对照未发病,其中发病叶片原接种菌的检出率为100%。菌株XG-3在PDA和OA平板培养基上20和25 ℃培养20 d,未见产孢。在自然感病的西瓜叶片上观察到少量分生孢子器,在人工接种发病的西瓜和甜瓜茎、叶上产生大量分生孢子器和分生孢子:分生孢子器球形至亚球形,大小为(82.4~243.3) μm×(82.4~188.4)μm,分生孢子器具1~2个孔口,孔口直径15.7~27.5 μm;分生孢子无色,0~3个隔膜,杆状、柱状、长椭圆形、花生形及不规则形,直或稍弯曲,分隔处不缢缩或缢缩,大小为(5.2~28.3)μm×(2.2~6.0)μm,分生孢子形态和大小依基质和环境条件的不同而有较大差异。BLASTn分析结果显示,菌株XG-3(GenBank登录号:MW282128)的rDNA-ITS序列与瓜拟多隔孢Sta. cucurbitacearum分离物287ITS(GenBank登录号:AY293804.1)的序列相似性达99.80%。在基于rDNA-ITS构建的系统发育树中,菌株XG-3与Sta. cucurbitacearum聚为一组,与西瓜拟多隔孢Sta. citrulli和木瓜拟多隔孢Sta. caricae区分开来。依据病菌形态学和分子生物学特征,将菌株XG-3鉴定为瓜拟多隔孢Sta. cucurbitacearum [Basionym: Sphaeria cucurbitacearum]。     

杨树角斑病病原菌分离及其培养特性研究

对杨树角斑病菌进行分离和鉴定,并研究不同培养条件对其培养特性的影响,以获得病原菌的纯培养并筛选出最佳培养条件,为杨树角斑病防治提供理论参考。分别采用组织和单孢分离法分离病原菌,根据子实体形态和病菌rDNA ITS序列对其进行鉴定。观察不同培养基、温度、光照、pH对病原菌生长的影响。结果表明,自然条件下,用杨树角斑病菌的分生孢子分离较病组织分离易成功。根据病菌的形态特征和rDNA ITS序列分析,将病菌鉴定为柳假尾孢[Pseudocercospora salicina(Ell.&Ev.)Deighton]。培养基、温度、光照、pH等因素影响病菌在培养基上的生长。燕麦培养基、pH6～7、25℃、黑暗条件是适合的培养条件。     

进境澳大利亚大麦夹杂油菜茎基溃疡病菌的检疫鉴定

采用常规平板分离法, 从进境澳大利亚大麦中夹杂的油菜籽上获得1株疑似油菜茎基溃疡病菌的菌株01829?通过致病性测定?形态学观察?特异性引物扩增?ITS序列比对分析, 对01829进行了种类鉴定?结果表明:菌株01829在PDA培养基上生长较慢, 菌落边缘不整齐, 产生大量分生孢子器和分生孢子; 采用特异性引物对LMR1-D和Lmb分别进行PCR检测, 结果均有预期扩增片段产生; 基于ITS序列构建的系统发育树中, 菌株01829和GenBank中其他油菜茎基溃疡病菌相关序列聚在同一分支; 菌株01829接种油菜子叶和茎基部, 在子叶和茎基部接种部位分别引起叶斑和凹陷溃疡斑?根据上述试验结果, 将菌株01829鉴定为油菜茎基溃疡病菌, 这是我国口岸首次从进境澳大利亚大麦中截获油菜茎基溃疡病菌?     

茶一新病害——茶萎芽病研究

茶萎芽病害是茶场中严重病害之一。据3年来的研究结果认为,每年7～8月高温季节,引起茶树芽梢枯萎,主要是由茶萎芽病菌所致。此病原菌在适温28～30℃时,人工接种2～4天后茶芽出现症状,4～6天茶芽枯萎,14天左右能产生分生孢子器,分生孢子器洋梨形或球形、炭质黑色、直径159.6～292.6微米。分生孢子椭圆形或卵形,初期无色单胞,后为淡橄榄色,中间具一隔膜无收缩,表面平滑无纹,大小为19.2～25.6×9.6～12.8微米。通过对病原菌的分离、培养、接种并对分生孢子器和分生孢子大小、形态特性、生理及寄主范围等的测定,认为此病原菌是壳色单隔孢属(Diplodia Fr.)中的一个种。经查阅国内外文献资料,目前在茶上此病尚未见报道,因此暂定此病原菌为 Diplodia sp.,由此病原菌引起的茶树病害定名为茶萎芽病。此外,根据本病的特性和诱病因子,在防治上还提出了建议。     

马尾松梢枯病的研究

由松壳色单隔孢(Diplodia pinea(Desm.)Kickx)引起的马尾松梢枯病在我国广东省首次发现。马尾松梢枯病的主要症状有梢枯、嫩梢弯曲、溃疡、流脂、叶枯,甚至全株死亡。病原菌的特征是分生孢子双孢,褐色,大小为28.5～39.9×14～17微米。松壳色单隔孢能侵染马尾松(Pinus massoniana)、湿地松(P.elliotii)、加勒比松(P.caribaea)和火炬松(P.taeda)。病原菌在受病的针叶、枝条和球果上越冬。每年3～5月第一次发病,7～8月第二次发病。当年生嫩梢未老化之前,病原菌能从伤口侵入或从嫩叶、嫩梢直接侵入。嫩梢老化以后,只能从伤口侵入。在自然条件下,病害主要发生在嫩梢伸长的后期,很少发生在嫩梢伸长的前期。在病树枯枝、枯叶上,松壳色单隔孢和多毛孢菌(Pestalotia sp.)之间存在生存竞争的关系,经接种试验证明后者对马尾松没有侵染能力,可利用它进行生物防治的研究。     

矮化核桃枝枯病病原菌的形态与分子鉴定

为了明确河南省洛阳地区核桃枝条一种新病害的病原种类,对采自田间的典型症状枝条进行了常规组织分离,对单孢菌株进行了形态鉴定、rDNA ITS序列分析及致病性测定。结果表明,病原菌在PDA培养基上菌落初为白色,随着色素的积累,由中心向边缘变为灰绿色,再变成墨绿色,最终全部变成黑色;气生菌丝棉絮毛状,菌落边缘不整齐,近圆形或不规则形。分生孢子器散生或聚生,呈黑色小粒状,分生孢子器球形或近球形,深褐色,具孔口;分生孢子梗短缺,无色,杆状,末端产生分生孢子;分生孢子梭形、纺锤形,无色,无隔,基部钝圆,顶部稍尖,单孢(24.5～29.0)μm×(4.8～7.5)μm。离体枝条接种结果表明,该菌能侵染核桃枝条引起与田间相同的症状。据此将分离物鉴定为葡萄座腔菌Botryosphaeria dothidea。     

进境新西兰猕猴桃中猕猴桃果腐病菌的检测与鉴定

对来自新西兰的猕猴桃进行了病原菌的分离培养,结果在果实中分离到2株疑似猕猴桃果腐病菌的菌株Na-3419和Na-4756。对其进行了病原菌形态学观察、致病性测定并结合分子生物学方法检测,实验结果表明,菌株Na-3419和Na-4756在PDA培养基上生长良好,能产生大量的分生孢子;经真菌通用引物(ITS4/ITS5)扩增和测序,菌株Na-3419与Gen Bank中登录号EU482221.1和EU482220.1的菌株序列同源性达到100%,菌株Na-4756与Gen Bank中登录号AY359230.1、AY359226.1和KR859079.1的菌株序列同源性达到100%;病菌接种猕猴桃3 d后开始发病。根据上述试验结果,将分离获得的菌株Na-3419和Na-4756鉴定为猕猴桃果腐病菌(Neofabraea actinidiae)。这是上海口岸首次在进境的猕猴桃果实上截获该有害生物。     

美国甜豆中2种壳二孢综合症病菌的检疫鉴定

从进境邮件截获的美国甜豆中分离到两株可疑菌株,通过菌落特征、分生孢子形态比较、ITS和G3PD基因扩增、核酸序列比对、系统发育分析及致病性测定,确定截获的两株菌分别为豌豆脚腐病菌(Phoma pinodella)和豌豆球腔病菌(Ascochyta pinodes),这是我国首次从同一样品中同时检出两种壳二孢属真菌。     

台湾省苹果上牛眼果腐病菌的截获鉴定

为明确从宁波空港口岸入境旅客携带苹果上截获的1株明孢盘菌属菌株60017的分类地位,通过形态学特征观察、内转录间隔区(ITS)和β-微管蛋白基因(β-tubulin)序列比对分析以及致病性测定,对该菌株进行了种类鉴定。结果表明:菌株60017在PDA培养基上的菌落为圆形,边缘整齐,呈乳白色,气生菌丝较少,可产生大量分生孢子;基于ITS和β-tubulin序列构建的系统发育树中,菌株60017和苹果牛眼果腐病菌Neofabraea kienholzii处于同一分支;菌株60017接种苹果后,在接种部位能引起褐腐症状,与原发病症状一致。结合形态学特征、致病性测定结果以及分子鉴定结果,最终将该菌株鉴定为苹果牛眼果腐病菌N. kienholzii。     

进境哈萨克斯坦向日葵种子中向日葵黑茎病菌的鉴定

自进境哈萨克斯坦向日葵种子中,采用常规平板分离法获得1株疑似向日葵黑茎病菌Plenodomus lindquistii菌株LL4,通过生物学性状、ITS序列测定和比对分析及致病性测定等方法对其进行了鉴定。结果表明,该病菌在PDA平板上培养初期菌丝无色,分隔分枝多,后期菌丝褐色或深褐色,常膨大;分生孢子器暗褐色,分散或聚集,球形、近球形或不规则形,大小为71.2~361.8μm;分生孢子形态变化较大,无色,单孢,肾形至椭圆形,大小为3.6~8.2μm×2.2~3.7μm,常含有2个油球;培养期间未见有性阶段。基于ITS序列分析比对发现,菌株LL4与Gen Bank中多个向日葵黑茎病菌分离物序列同源性达99%以上,系统进化树显示其与其它向日葵黑茎病菌分离物聚在同一个分支。菌株LL4可侵染向日葵根茎部,造成典型黑茎病症状。表明分离获得的菌株LL4为向日葵黑茎病菌P.lindquistii。     

温度、湿度和光照对苹果炭疽叶枯病菌(Glomerella cingulata)产孢的影响

苹果炭疽叶枯病(Glomerella cingulata)是我国苹果上新发现的一种病害,为了了解病原菌的产孢条件和产孢动态,为病害的预测预报与防控提供依据。本研究在人工控制条件下,测试了温度、湿度和光照对苹果炭疽叶枯病菌产生分生孢子和子囊孢子的影响。结果表明,苹果炭疽叶枯病新形成的病叶润湿后,在15℃~30℃下保湿培养2~6 d后可产生大量橘黄色的分生孢子堆,其中30℃下产孢量最大,产孢速度最快,仅需2 d时间。炭疽叶枯病菌在新形成的病叶上于15℃~30℃下培养20~30 d可形成子囊孢子,最适温度为25℃,子囊孢子的形成需要高湿环境或叶片润湿。炭疽叶枯病菌的单孢分离菌株于15℃~25℃下,在马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)上培养20~30 d也可形成子囊孢子,最适产孢温度25℃。紫外光、黑光和日光都能促进子囊孢子的形成。     

进境美国苜蓿草中值得关注的真菌帚状刺壳霉

从进境美国苜蓿干草中发现带有褐色至黑色斑点的苜蓿草茎杆,经保湿培养,在病部表面形成分生孢子器,球形或近球形,褐色至黑色,孔口边缘着生刚毛。分生孢子透明,光滑,单细胞,近圆柱形至卵圆形。在PDA上,菌落初为黄褐色,后转为橄榄绿色,气生菌丝体稀疏,边缘不规则,表面呈绒状,有褶皱,背面呈橄榄绿色。培养5 d后开始产生分生孢子器。培养过程中有厚垣孢子产生和微循环产孢现象,菌丝束浅棕色。Blast分析表明,从分离物基因组中扩增到的ITS基因与Gen Bank中已知的帚状刺壳霉(Chaetopyrena penicillata(Fuckel)Hhn.1918)菌株的ITS序列同源性达99%~100%,基于ITS基因序列的系统发育分析显示分离物与帚状刺壳霉(C.penicillata)聚在同一簇。综合形态学特征、培养性状及ITS序列分析,将分离物鉴定为帚状刺壳霉(Chaetopyrena penicillata(Fuckel)Hhn.1918),此为我国口岸首次截获。迄今为止,除伊朗和南非外,世界其他国家和地区尚未有该病菌在苜蓿草上发生为害的报道。