利用绒山羊原始生殖细胞培养胚胎干细胞的研究

[目的]建立绒山羊胚胎干细胞体系。[方法]采用与其胎儿成纤维细胞共培养的方式从20 mm绒山羊胎儿生殖嵴及其周围组织分离克隆出大量原始生殖细胞(PGCS)集落。[结果]这些集落的细胞经过多次传代具有胚胎干细胞(ES)的诸多特征,如鸟巢状结构、AKP染色阳性、具有连续传代能力等。[结论]该细胞具有多能性,类似ES细胞。     

原始生殖细胞的人类胚胎干细胞克隆

取材于妊娠终止胚胎生殖腺或生殖嵴及其周围组织,用ＤＭＥＭ＋ＮＣＳ培养液体外培养,分离由人ＰＧＣｓ转化成的类ＥＳ细胞,并将其与同源胚胎成纤维细胞一起用胰蛋白酶＋ＥＤＴＡ的无钙镁ＰＢＳ液消化传代。在原代培养１２ｈ观察到胞体较大、边缘不整、贴壁分裂增殖的ＰＧＣｓ样细胞,４８ｈ后观察到２６处紧密排列呈鸟巢状的类ＥＳ细胞集落及集落团。第６ｄ传代成功,第１６ｄ传至第４代。结果表明,体外培养附植后胚胎能够建成人的类ＥＳ细胞系。     

Mmu-miR-34c慢病毒表达载体构建及在奶山羊雄性生殖干细胞的表达

【目的】用两种方法构建miR-34c的慢病毒表达载体,并包装成慢病毒颗粒,为经济、高效的进行miR-34c超表达提供方案,为进一步研究miR-34c的作用奠定基础。【方法】 从小鼠基因组中扩增miR-34c前体,分别插入pLL3.7的CMV启动子起始的GFP之后或U6启动子后,构建成载体pLL3.7-CMV-34c及pLL3.7-U6-34c。将重组慢病毒载体和包装质粒混合物转染包装细胞293T细胞,包装产生慢病毒颗粒,测定病毒滴度。感染293T细胞与关中奶山羊雄性生殖干细胞,用293T细胞与奶山羊雄性生殖干细胞的GFP表达程度测定转染效率,用定量PCR方法测定miR-34c的表达效率。【结果】重组质粒酶切及PCR分析及转化菌液测序,证明插入序列正确,qPCR检测显示：miR-34c的表达在慢病毒载体感染的293T细胞与关中奶山羊雄性生殖干细胞均显著上调。【结论】用 pLL3.7慢病毒载体中的CMV和U6两种启动子均可经济高效地进行miR-34c超表达,且由U6启动子启动的miR-34c慢病毒表达载体可以成功高效感染关中奶山羊雄性生殖干细胞。     

牛原始生殖细胞的分离与培养

从4～15周龄的牛胎儿生殖嵴中分离得到牛原始生殖细胞,以STO(一种建系的小鼠胎儿成纤维细胞)及MEF(小鼠胎儿成纤维细胞)为饲养层抑制分化培养,其中1个细胞系传至4代。研究发现,STO较MEF更有利于牛类EG细胞的分离与培养,体长小于5cm的胎儿适合牛EG细胞分离与克隆。同时观察到这些细胞在体外进行自发性分化,可形成上皮样细胞、神经样细胞和成纤维样细胞。     

山羊原始生殖细胞的分离与培养

从46例山羊胎儿中分离培养原始生殖细胞,发现胎龄在25～38d的胎儿原代培养时都可获得大量的细胞集落,适合做胚胎生殖细胞的分离培养,最高传至6代。以小鼠胎儿成纤维细胞(MEF)、山羊胎儿成纤维细胞(GEF)、牛胎儿成纤维细胞(BEF)为饲养层,在不添加细胞因子情况下,都可以培养出原代山羊的胚胎生殖细胞。传代结果表明,MEF的培养效果较好,但与GEF组差异不显著(P>0.05),BEF组培养效果较差(P<0.05)。以3个不同质量浓度LIF的培养液培养山羊原始生殖细胞(PGC)结果表明,在原代培养时,效果差异不显著(P>0.05);而在传代过程中,以含LIF10ng/mL组培养效果最好,但与含LIF5ng/mL组差异不显著(P>0.05),LIF1ng/mL组培养效果较差(P<0.05)。     

猪类胚胎生殖细胞体外诱导分化为神经细胞的研究

【目的】探讨猪类胚胎生殖细胞向神经细胞分化的潜能。【方法】采用性腺-中肾区基质细胞与猪原始生殖细胞共培养的方法得到猪类胚胎生殖细胞,通过直接分化的方法进行神经细胞定向诱导。【结果】（1）与小鼠成纤维细胞作为饲养层相比,性腺-中肾区基质细胞作为饲养层同样能够支持猪类胚胎生殖细胞生长,二者对猪类胚胎生殖细胞的增殖能力不存在显著影响;（2）猪类胚胎生殖细胞有较强的碱性磷酸酶活性,Q-PCR结果显示多能性基因Oct4、Sox2及Nanog表达,增殖能力呈现“S”型,即生长的潜伏期、对数期及平台期,猪类胚胎生殖细胞经体外悬浮培养能够形成拟胚体;（3）经过诱导猪类胚胎生殖细胞能够分化形成表达神经干细胞、神经元及神经胶质细胞标记物的多种神经细胞类型。【结论】从早期性腺中成功分离培养得到了猪类胚胎生殖细胞,通过简单、快速的神经细胞分化的诱导体系证实了猪类胚胎生殖细胞具有体外定向分化为多种神经谱系细胞的能力。     

山羊胚胎原始生殖细胞的分离与培养

选择受精后30～50d的关中奶山羊胎儿为材料,参照小鼠原始生殖细胞(PGCs)分离得到了山羊的PGCs,将其分别培养在STO饲养层上,或与同源山羊成纤维细胞(GEF)及山羊睾丸支持细胞(GSCs)共培养。结果表明,3种方法均能获得类EG细胞。分离得到的类EG细胞在STO饲养层上仅传4代;培养在GEF上的效果最差,传至第3代时丢失;而在GSCs上培养的效果最好,可传6代。     

山羊2-细胞胚胎的电融合试验

对山羊2-细胞胚胎的电融合参数进行了研究。结果表明,从融合率、卵裂率、胚胎死亡率三个指标综合衡量,电场强度1.2kV/cm,脉冲时程40μs是适宜的参数。     

禽原始生殖细胞的分离·培养及应用

原始生殖细胞(PGCs)是生殖细胞的前体细胞,不同物种的PGCs的特性、分离培养方法及其在生产中的应用也不同.家禽因其生殖生理的特殊性,常被用作研究发育生物学的良好模型.近年来,干细胞研究进展迅速,原始生殖细胞作为干细胞研究的一种材料来源,凭借其自身特性将对研究体外胚胎发育、基因组学研究以及药理研究起到重要作用.对禽原始生殖细胞的特性、分离培养以及应用进行了综述.     

第28期鸡胚原始生殖细胞的分离培养

[目的]进一步优化生殖细胞（PGCs）细胞体外培养条件。[方法]从第28期（5．5d）鸡胚生殖嵴分离PGCs,将PGCs与性腺基质细胞共培养进行原代培养,比较2种培养温度和3种培养浓度对PGCs原代培养的影响,以及2种饲养层细胞对PGCs传代培养的影响,并通过倒置显微镜下形态学观察、碱性磷酸酶（AKP）和过碘酸希夫反应（PAS）染色方法鉴定PGCs。[结果]培养浓度为2．5×10^5个／ml和培养温度为37℃时PGCs增殖较多,不易分化,存活能力较强,以第2代鸡胚成纤维细胞作饲养层时传代培养效果较好,获得了PGCs增殖的未分化集落,为后期的细胞标记及移植研究提供了较多数量和较高活力的PGCs。[结论]获得了PGCs原代与传代培养较好的培芥体系,为禽类EG细胞系的建立和转基因研究奠定了基础。     

波尔山羊与关中奶山羊级进杂交后代的生长发育研究

对波尔山羊与关中奶山羊级山羊级进杂交后代的生长发育性状进行了初步研究。结果表明：杂交一代（F1）羊与波尔山羊的初生重差异不显著（P〉0.05）,1，2，3月龄F1代羊的体重比同龄波尔山羊高，且差异达显著水平（P〈0.05）。F1代羊的体尺指标明显大于同龄波尔山羊，其中胸围差异显著（P〈0.05）。杂交二代（F2）羊与纯种波尔山羊相比，各项指标差异不显著（P〉0.05），与同龄F1代羊相比，1、2、3月龄的体重，体尺指标差异显著（P〈0.05），杂交三代（F3）羊的体重体尺均大于同龄波尔山羊，趋同于同龄F1代羊。波尔山羊与关中奶山羊的F1代羊日增重均高于同龄波尔山羊，F2代羊的日增重比同龄波尔山羊稍高，与同龄F1代羊相比，其日增重速度明显低于同龄F1代羊。F3代羊的日增重基本与同龄波尔山羊一致，说明波尔山羊与关中奶山羊杂交，其后代羊在生长发育性能方面具有明显的杂交优势，F1代羊生长发育速度快，而F2、F3代羊生长发育速度减慢，在F1代进行横交固定，是培育高生产性能的肉用山羊新品种（系）的重要方法。     

山羊胎儿肌肉干细胞的分离培养与成肌诱导分化

【目的】通过体外建立安淮山羊胎儿肌肉干细胞分离培养及成肌诱导分化的方法,为进一步研究调控山羊肌肉干细胞增殖与分化的分子机制提供实验材料。【方法】本试验选取山羊胎儿背最长肌肌肉组织,用眼科剪剪成肉糜后,用0.1%的Ⅰ型胶原酶消化40 min,然后利用0.25%的胰酶消化15 min。分离得到的细胞用生长培养基（20%FBS+80%DMEM/F12+青链霉素）培养于37℃、5% CO2培养箱内。培养2h后采用差速贴壁技术对细胞进行纯化,又2h后,重复纯化一次。待细胞生长至70%左右密度时可进行传代培养。每次传代培养均采用差速贴壁30min的方法进一步纯化肌肉干细胞,共纯化至第6代。利用免疫荧光技术检测第6代细胞中肌肉干细胞标记基因Pax7、MyoD1的蛋白表达情况,从而对分离得到的细胞进行鉴定。当肌肉干细胞生长至70%左右密度时,将生长培养基更换为分化培养基（2%FBS+98%DMEM/F12+青链霉素）,诱导细胞向成肌方向分化并观察细胞的形态学变化。细胞诱导分化1d后,采用免疫荧光技术检测肌肉干细胞的分化标记基因Myog的蛋白表达情况。另外,分别提取诱导0、1、3、5、7d后的细胞的总RNA,通过反转录试剂盒反转成cDNA后,利用qPCR测定MyoD1和Myog的相对表达量。【结果】 分离得到的细胞呈贴壁生长,其形态趋于稳定后主要呈长梭形或纺锤形。免疫荧光技术检测的第6代细胞中Pax7和MyoD1蛋白均为阳性表达。采用分化培养基诱导细胞分化后,在显微镜下可观察到随着诱导天数的增加,细胞开始分化、相互融合成肌管且具有一定的方向性。免疫荧光检测结果表明Myog蛋白呈明显的阳性表达。另外,qPCR结果显示,标志基因MyoD1和Myog均有表达,且MyoD1的相对表达量在分化的第1天相比于0天显著升高并维持到第3天,第5、7天开始显著下降但仍显著高于增殖期。Myog在分化不同天数的细胞中的相对表达量具有类似的趋向。【结论】分离得到了纯度较高的安淮山羊胎儿肌肉干细胞,且诱导后展现出较好的成肌潜力。研究结果可为进一步开展肌肉干细胞成肌分化的分子机制研究提供材料来源。     

利用绒山羊原始生殖细胞培养胚胎干细胞的研究(英文)

[目的]建立绒山羊胚胎干细胞体系。[方法]采用与其胎儿成纤维细胞共培养的方式从20mm绒山羊胎儿生殖嵴及其周围组织分离克隆出大量原始生殖细胞(PGCS)集落。[结果]这些集落的细胞经过多次传代具有胚胎干细胞(ES)的诸多特征,如鸟巢状结构、AKP染色阳性、具有连续传代能力等。[结论]该细胞具有多能性,类似ES细胞。     

山羊核移植胚胎干细胞的分离培养

比较了不同发育阶段山羊核移植胚胎分离培养胚胎干细胞（NT-ESCs）的情况。结果表明,各阶段山羊核移植胚胎均可分离出NT-ESCs,其中孵化胚的NT-ESCs克隆形成率最高（38%）,与囊胚（26%）差异显著,与桑葚胚（18%）差异极显著。所分离的NT-ESCs细胞形态与正常ESCs相似,均具有碱性磷酸酶活性,可表达多能性基因Oct-4和表面标志抗原SSEA-1。     

奶牛乳房炎病原菌的分离鉴定

本实验从八五一一农场患临床型乳房炎的10头病牛的乳样中进行病原菌分离,共分离出11个菌株,经培养特性,菌落形态,生化特性等初步鉴定,其中,2株为大肠杆菌,2株为葡萄球菌,3株为沙门氏菌,4株为链球菌。结果说明,由于区域不同、时间不同或饲养环境不同等原因,奶牛感染的病原菌不近相同。所以,应当根据不同地区的实际情况进行检查检验,为奶牛乳房炎的防治提供可靠的依据.减少不必要的损失。     

不同培养系统和传代方法对昆明白小鼠原始生殖细胞分离培养的影响

[目的]寻求适合昆明白小鼠EG细胞的培养系统和传代方法。[方法]常规方法从昆明白小鼠原始生殖细胞中分离EG细胞,用不同培养系统(EG细胞基础培养液,RH-CM,EG细胞基础培养液+MEF)及不同传代方法(机械法,酶消化法,连同饲养层消化法),研究对昆明白小鼠EG细胞分离克隆的影响。[结果]以RH-CM作为培养基效果最好,RH-CM能够更好地促进EG细胞贴壁增殖和集落的形成,有效地维持EG细胞未分化状态;酶消化法和连同饲养层消化法均能获得较高的克隆形成率。[结论]RH-CM和连同饲养层消化法可分别作为昆明白小鼠EG细胞的培养系统和传代方法。     

自原始生殖细胞分离克隆小鼠ES细胞研究初报

自交配后 9.5～ 13.5 d小鼠胎儿生殖嵴 /腺或其类似物及周围组织 ,采用与其同源胎儿成纤维细胞共培养的方式分离克隆到具小鼠 ES细胞诸多特征的胚胎生殖细胞 ( EG细胞 )系。即具有连续传代的能力 ( 1例来自交配后 11.5 d胎儿类 ES细胞传至 10代 ) ,部分细胞集落呈典型鸟巢状结构 ,AP染色呈阳性 ,体外分化或延迟传代、堆叠培养具有分化形成类胚体、上皮细胞、成纤维细胞或神经细胞等的能力。同样培养交配后 7.5～ 8.5 d和14.5～ 15 .5 d的小鼠胎儿 ,原代观察到类 ES细胞集落 ,继代培养未观察到类 ES细胞集落 ,16 .5～ 18.5 d小鼠胎儿原代培养未观察到 ES样细胞集落     

人类原始生殖细胞的体外培养

为了探讨人原始生殖细胞(primordial germ cells,PGCs)的体外分离培养条件及相关影响因素,以小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts,MEF)作为饲养层,室温下用1．25 g／L胰蛋白酶+0．2 g／L EDTA消化人胚胎组织5～9 min,或用1 g／L胶原酶(IV型)消化20～40 min,分离得到PGCs,然后用不同培养液培养,从培养液角度较为系统的研究原代培养人原始生殖细胞的条件。结果表明,在KSR培养液(体积分数15％ Knockout serum replacement+高糖DMEM+10 ng／mL人重组白血病抑制因子(LIF)+4 ng／mL人重组碱性成纤维细胞生长因子+10 ng／mL Forskolin)和STO(建系的小鼠胚胎成纤维细胞)条件培养液中培养的原代人原始生殖细胞,有较高的克隆形成率;培养液中添加不同质量浓度的LIF对克隆形成率影响差异不大。     

苹果树叶对关中奶山羊产奶性能和生化指标的影响

为了评估苹果树叶对关中奶山羊产奶性能和健康状况的影响,本试验选用28只关中奶山羊,按配对试验设计原则,根据试验羊只的体质量、产奶量、产羔胎次和产奶日期将其分为4个处理,每处理7只。分别用0、300、500和700 g/kg的苹果树叶替代苜蓿干草添加在4个处理,分别测定各处理奶山羊的产奶量、乳成分和血液生化指标。结果表明,添加300和500 g/kg的苹果树叶处理分别与其他处理相比,关中奶山羊的产奶量显著提高(P0.05);添加苹果树叶对关中奶山羊乳成分中乳干物质、乳脂肪和乳糖含量影响不显著(P0.05),但添加700 g/kg的苹果树叶处理乳蛋白含量显著低于其他各处理(P0.05);各处理血液中尿素氮、乳酸脱氢酶、碱性磷酸酶以及谷草转氨酶的含量差异不显著(P0.05)。因此,在本试验条件下,添加300和500 g/kg苹果树叶能提高关中奶山羊的产奶量(P0.05),但对乳成分和血液生化指标影响不显著(P0.05)。