巴西橡胶树HbHEX1基因的克隆及表达分析

根据一个巴西橡树胶乳cDNA文库中的EST片段的序列信息设计引物,通过RACE的方法获得了橡胶树编码homeobox蛋白的cDNA(命名为HbHEX1)。序列分析结果表明,HbHEX1长为1612bp,含有873bp的阅读框,292bp的5'-UTR和447bp的3'-UTR,编码290个氨基酸,分子量为33.02KD,等电点为6.35,含有保守的homomeodomain,属于HD-ZIP类。该氨基酸序列与蓖麻、马铃薯、胡萝卜的同源异型盒蛋白的同源性分别为92%、77%和72%。半定量RT-PCR分析结果表明HbHEX1基因在花和愈伤组织中基本上没有表达,在体细胞胚、芽、叶、胶乳和树皮中有表达,其中在胶乳中表达量最高。     

巴西橡胶树HbHDT1基因的克隆及表达分析

根据一个已获得的在巴西橡胶树幼态无性系与老态无性系之间差异表达的SSH片段的序列信息设计引物,通过RACE的方法获得橡胶树编码组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase)的cDNA(命名为HbHDT1)。序列分析结果表明,HbHDT1长为1197bp,含有917bp的阅读框,86bp的5'-UTR和196bp的3'-UTR,编码304个氨基酸。该氨基酸序列与蓖麻、毛果杨、马铃薯、红花苜蓿、大豆、小麦的HDACs家族成员的同源性分别为65%、59%、50%、45%、43%和40%。半定量RT-PCR分析结果表明HbHDT1在巴西橡胶树的花、愈伤组织、胚、叶、芽、胶乳中均有表达。在体细胞胚发生过程中HbHDT1表达出现明显的差异,在培养12d的体细胞胚中表达量最低,在培养53d的体细胞胚中表达量最高。茉莉酸和乙烯处理对胶乳中HbHDT1的表达无影响。     

巴西橡胶树SUMO活化酶基因HbSAE1的克隆及表达

根据一个从巴西橡胶树胶乳cDNA文库中获得的EST片段的序列设计引物,通过RACE的方法获得了橡胶树编码SUMO活化酶(SUMO-activating enzyme,SAE)的cDNA,命名为HbSAE1。序列分析结果表明HbSAE1长为2 411 bp,含有1917 bp的阅读框,214 bp的5'-UTR和280 bp的3'-UTR,编码638个氨基酸,分子量为70.79 ku,等电点为5.41。半定量RT-PCR分析结果表明HbSAE1基因在花、树皮、叶、胶乳中均有表达,其中在胶乳中表达量最高。     

巴西橡胶树HbHMAD1的克隆及表达

根据已获得的在橡胶树自根幼态无性系与老态无性系胶乳中一个差异表达的片段序列设计引物,通过RACE法获得了橡胶树编码含有重金属相关结构域蛋白的cDNA,命名为HbHMADl.序列分析结果表明,HbHMA D1长为814bp,含有453 bp的阅读框,78bp的5’-UTR和283 bp的Y-UTR,编码150个氨基酸,分子量为16.9 ku,等电点为10.4.HbHMAD1含有重金属相关结构域,与蓖麻(Ricinus communis)、拟南芥(Arabodopsis thesis)(3个)和玉米(Zea mays)中的含有重金属相关结构域蛋白的同源性分别为85％、64％、63％、60％和55％.半定量RT-PCR分析表明HbHMA D1基因在胶乳和树皮中表达,在叶中微量表达,在花中基本不表达.     

巴西橡胶树HbGRF基因的克隆、物理定位及表达分析

生长调控因子（growth-regulating factors,GRF）是植物特有的一类转录因子,该转录因子家族成员数目较多,在植物生长发育过程中发挥着重要作用。以巴西橡胶树优良品种‘热研7-33-97’为材料,通过RT-PCR方法进行HbGRF基因的克隆;利用生物信息学的方法对其蛋白序列、理化性质、基因结构、进化关系进行分析;利用IS-PCR技术和FISH技术对其进行物理定位分析;采用qRT-PCR对橡胶树中HbGRF基因的表达模式进行研究。结果表明：在橡胶树雌花中克隆到3个GRF基因,分别命名为HbGRF1、HbGRF2和HbGRF3,分子量分别为65.663、41.188、52.858 kDa,其编码的蛋白长度分别为609、384、494 aa,均为不稳定蛋白;3个基因均具有GRF完整的特征结构域WRC和QLQ,分别属于3个不同亚族。基因物理定位结果表明,HbGRF1、HbGRF2和HbGRF3基因分别位于橡胶树染色体的第11号长臂、第5号短臂和第9号长臂上,基因到着丝粒的平均百分距离是77.65、42.66和65.27。表达结果显示,橡胶树3个HbGRF基因在茎尖、雌花等生长旺盛的组织中表达量较高,用外源赤霉素和脱落酸处理后,发现表达量呈上升趋势,经过48 h后表达量和初始值基本持平,3个基因在茎尖、雌花中有明显的表达特异性,可能在橡胶树花芽分化及雌花的发育过程中起到了重要作用。该结果为研究橡胶树HbGRF基因的功能及作用机制奠定了理论基础,为橡胶树精准育种提供了分子细胞学依据。     

巴西橡胶树ADF6基因的克隆与表达分析

肌动蛋白解聚因子(Actin Depolymerizing Factor,ADF)是一种重要的肌动蛋白结合蛋白。ADF通过参与调控肌动蛋白的装配和解聚在多种生理过程中发挥重要作用。本研究通过RT-PCR技术从橡胶树胶乳中获得HbADF6基因的cDNA和基因组序列,序列分析显示HbADF6基因的开放阅读框为441 bp,共编码146个氨基酸,基因组序列由2个内含子和3个外显子组成。实时荧光定量PCR结果表明,HbADF6基因在所有检测组织中均表达,其中树皮中表达量最高,叶片中表达量最低。HbADF6基因的表达受乙烯利(ET)和碘化钾(KI)调控,并与排胶时间和死皮有关。此结果表明HbADF6基因可能在橡胶树乙烯响应、死皮和排胶过程中发挥重要作用。      

巴西橡胶树CBF1基因的克隆和序列分析

通过RT-PCR技术从橡胶树中克隆了CBF基因家族的保守区,并通过5＇端RACE和3＇端RACE技术克隆了全长为1121 bp的cDNA序列,通过BLAST工具搜索Genbank数据库.结果表明,该cDNA序列同其他植物中的CBF家族基因高度同源,认为该cDNA序列就是橡胶树中的CBF基因.利用genescan和ClastalX工具对该序列进行分析,推测其编码区为693bp,编码231 Aa,并包含一个AP2 DNA结合域.氨基酸同源性分析结果表明,来自橡胶树的CBF基因氨基酸序列与热带起源的作物同源性较高,而与北方种植作物相似性较低.     

巴西橡胶树钙调蛋白基因的克隆和表达分析

以拟南芥和杨树的钙调蛋白氨基酸序列为探针,对橡胶树转录组数据库进行搜索,并设计引物进行PCR扩增,得到7个橡胶树钙调蛋白基因的cDNA序列,命名为HbCaM1-7。序列分析结果发现,HbCaM1-7的CDS序列均为450 bp,编码149个氨基酸,分子量为16.8 ku,等电点为3.95。其中,HbCaM1-6间氨基酸同源性为100%,HbCaM7与其他成员之间的氨基酸同源性为98%。在基因结构组织方面,HbCaM1-7均为一个内含子,且内含子的插入位置相同,但内含子的长度明显不同。从氨基酸序列同源性和进化关系分析结果可看出,钙调蛋白基因家族在进化上非常保守。在表达方面,HbCaM1-6在各组织中均有表达,除了HbCaM3在根中表达丰度相对较高,其他成员均在胶乳中表达丰度相对较高,而HbCaM7在各组织中的表达均比较低;乙烯利处理后,HbCaM2-7的表达均有一定的上升趋势,而在叶片发育过程中HbCaM1-5圴呈明显下调表达。由此可见,橡胶树钙调蛋白与橡胶树叶片发育、胶乳乙烯信号通路具有一定的相关性。     

巴西橡胶树HbMYC1基因的克隆及序列分析

从GenBank中搜索到1条来自橡胶树的MYC(Myelocytomatosis)家族基因EST序列,以该序列为保守区,通过RACE技术获得了该基因全长cDNA序列,共1817bp。通过BLAST工具搜索GenBank数据库,结果表明,该cDNA序列同其他植物的MYC家族基因高度同源,认为该cDNA序列为橡胶树MYC家族成员。利用GenScan和Clastal X对该序列进行分析,推测其编码区长度为1428bp,编码476个氨基酸。生物信息学分析结果表明,巴西橡胶树的MYC基因编码的氨基酸序列与其他物种的相似性很高,同时推导的蛋白质序列中还存在着1个螺旋-环-螺旋的DNA结合区域和1个核定位信号,表明克隆到的基因是1个MYC家族成员的转录因子。     

巴西橡胶树FERONIA类受体激酶基因(HbFER)的克隆及表达分析

植物受体类激酶在植物的生长发育和抗逆等生理过程中起着重要作用。在橡胶树转录组测序的基础上,通过RACE技术和RT-PCR方法,扩增得到橡胶树的一个类受体激酶基因的全长,命名为HbFER。该片段包含1个2 679 bp的开放阅读框,可编码892个氨基酸。生物信息学分析结果表明:该氨基酸序列与拟南芥、番茄、甘蓝和杨树的FER蛋白高度同源,其同源性分别为74.5%、74.7%、73.4%、82.9%。HbFER蛋白除了含有Malectin_like和PTKc结构域外,还含有1个信号肽(含22个氨基酸)和2个跨膜结构域。半定量分析结果表明,HbFER基因在不同组织中的表达水平存在差异,叶片和花中的表达丰度最高,胶乳中的表达丰度最低,且该基因在叶片中的表达受植物激素水杨酸的诱导。     

巴西橡胶树类甜味蛋白基因HbTLP1的克隆及表达分析

根据模式植物拟南芥中同类蛋白的氨基酸序列在橡胶树转录组数据库中进行同源搜索并设计引物,通过RT-PCR方法扩增巴西橡胶树TLP同源基因的cDNA片段,命名为Hb TLP1.该片段包含一个984 bp的开放阅读框,编码327个氨基酸的多肽.生物信息学分析结果表明,该氨基酸序列含有一个超级THAUMATIN-Like结构域,与杨树、大豆、葡萄和拟南芥的TPL蛋白有较高的同源性.半定量分析结果表明,该基因的表达受水杨酸(SA)和鞭毛蛋白(flg22)的诱导,但不受茉莉酸(JA)的影响.以上结果揭示该基因为橡胶树的TPL同源基因,参与SA介导的抗病信号途径和植物的先天免疫反应.     

橡胶树磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因HbPPC1的克隆和表达分析

根据橡胶树磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)基因的部分序列设计引物,运用RT-PCR和RACE方法获得其家族成员的1个全长cDNA,命名为HbPPC1,长度3 025 bp,包含5′-UTR 34 bp,3′-UTR 93 bp,开放阅读框2 898 bp,编码965个氨基酸。预测HbPPC1分子量为110.34 ku,理论等电点为6.09。HbPPC1具有C3型PEPC的结构特征,其N端第9~17位残基是可逆磷酸化的不变序列-X-X-SIDAQLR,C端倒数第4位残基为谷氨酰胺(Q),第774位残基为丙氨酸(A)。HbPPC1与5条大戟科植物的PEPC序列(其中木薯2条、蓖麻2条、麻风树1条)的同源性达到95％。系统进化分析表明,HbPPC1与这5条序列聚在同一个进化支中。HbPPC1包含2个酶活性位点和7种类型的Motifs,二级结构以由α-螺旋和无规则卷曲为主。Real-time RT-PCR结果表明,HbPPC1在橡胶树胶乳、叶片、树皮和花中均表达,在胶乳中的表达量最高;胶乳HbPPC1的表达受乙烯利刺激影响,在乙烯利刺激4~72 h后胶乳HbPPC1表达明显下调,表明HbPPC1在胶乳pH值调控中起重要作用。本研究结果为HbPPC1的功能研究提供理论依据。     

巴西橡胶树HbMET的克隆与表达分析

通过同源克隆和RACE方法获得了巴西橡胶树DNA甲基转移酶(DNA Methyltransferase,MET)基因(Hb MET)。Hb MET长4 896 bp,含有4 635 bp的阅读框架,编码1 545个氨基酸。蛋白分子量174.36 ku,等电点为6.36。氨基酸序列与可可、毛果杨、黄瓜、拟南芥、碧桃、葡萄和烟草等物种的MET家族成员的同源性分别为73%、77%、74%、56%、72%和68%。进化树分析表明,Hb MET氨基酸序列与毛果杨的MET亲缘关系最近。Hb MET在巴西橡胶树的根、树皮、叶、胶乳中均有表达,其中在胶乳中表达量最低;Hb MET在橡胶树自根幼态无性系的胶乳中表达比老态无性系胶乳中的表达低。     

橡胶树体细胞胚胎发生相关类受体蛋白激酶基因（HbSERK1）的克隆及表达分析

从橡胶树体细胞胚中克隆了一个与体细胞胚胎发生相关的类受体蛋白激酶基因,命名为HbSERK1。HbSERK1长2 159 bp,含有一个1 482 bp的阅读框,编码493个氨基酸。HbSERK1序列与毛果杨、葡萄、胡萝卜、马铃薯、拟南芥和燕麦的体细胞胚胎发生相关类受体蛋白激酶同源性分别为91%、90%、88%、88%、87%、86%。生物信息学分析表明,HbSERK1含有一个高度保守的蛋白激酶家族结构域,同时含有ATP结合区、蛋白激酶活化位点和Ser/Thr活性位点。RT-PCR半定量分析表明,HbSERK1在叶、胶乳、雄花、生长在愈伤诱导培养基上30 d和50 d的愈伤组织及生长在胚状体诱导培养基上12 d的胚性愈伤组织中均未表达,而生长在胚状体诱导培养基上21 d和40 d的胚性愈伤组织及成熟体细胞胚中表达。橡胶树HbSERK1基因主要在体细胞胚发生的早期表达,表明其可能参与橡胶树的体细胞胚早期发生过程。     

巴西橡胶树14-3-3蛋白基因的克隆及表达分析

根据在巴西橡胶树幼态无性系与老态无性系胶乳之间差异表达的一个SSH片段序列信息设计引物,通过RACE技术获得了2个编码14-3-3蛋白的cDNA,命名为Hb14-3-3a和Hb14-3-3b。序列分析表明,Hb14-3-3a和Hb14-3-3b基因长度分别为1 154、1 050 bp,分别编码252、263个氨基酸,分子量为61.7 Ku和64.7 Ku,等电点为5.51和5.14。Hb14-3-3a/b基因在所检测的组织中均有表达,但Hb14-3-3a和Hb14-3-3b的表达模式不一样,Hb14-3-3a在树皮中表达量最高,而Hb14-3-3b在叶中表达量最高。     

巴西橡胶树磷酸蔗糖磷酸化酶基因的克隆和表达模式分析

蔗糖是橡胶生物合成的主要碳源,而磷酸蔗糖磷酸化酶(SPP)是蔗糖合成最后步骤的关键酶,克隆橡胶树SPP家族基因并研究其表达特性,将有助于揭示橡胶树中蔗糖合成代谢的分子调控.本研究利用拟南芥和杨树的SPP氨基酸序列为探针,搜索橡胶树EST和基因组数据库,并设计引物进行PCR扩增,得到1个橡胶树SPP基因的cDNA和基因组序列,命名为HbSPP1.序列分析显示,HbSPP1基因组含有8个外显子、7个内含子,其cDNA序列的编码区(CDS)为1278 bp,编码424个氨基酸,蛋白分子量为48.1 ku,等电点为6.02.进化上,HbSPP1基因与杨树SPP基因的亲源关系比拟南芥要近.组织特异性表达分析发现,HbSPP1在叶片中的表达丰度最高.另外,在叶片不同发育阶段中,HbSPP1在稳定期叶片中的表达明显低于幼期叶片.     

巴西橡胶树HbSAP1基因克隆及表达分析

胁迫相关蛋白(Stress associated proteins,SAPs)在植物免疫应答和胁迫反应中发挥着重要作用。采用电子克隆和RT-PCR相结合的方法,从巴西橡胶树中分离胁迫相关蛋白基因Hb SAP1。结果表明:Hb SAP1基因的开放阅读框为537 bp,编码178个氨基酸。Hb SAP1蛋白预测分子量为18.87 ku,等电点为7.98,具有典型的A20和AN1锌指结构域。实时荧光定量PCR分析结果表明,Hb SAP1基因在巴西橡胶树各组织中均有表达,以茎尖中的表达量最高。同健康橡胶树相比,Hb SAP1基因在死皮橡胶树胶乳和树皮中的表达量显著升高。伤害、H2O2、乙烯利及茉莉酸甲酯处理均能使胶乳中Hb SAP1基因的表达上调。低温及PEG诱导的干旱胁迫下,Hb SAP1基因在叶片中的表达显著增强。上述结果表明,Hb SAP1基因可能在橡胶树死皮发生、非生物胁迫应答、乙烯及茉莉酸信号转导中发挥重要调控作用。