绵羊胚胎成纤维细胞的体外培养

用组织块法对绵羊胚胎成纤维细胞进行原代和传代培养,探讨绵羊胚胎成纤维细胞适宜的培养模式.成功获得较均一稳定的细胞群体,并成功地对细胞进行了冷冻保存和复苏.对于进行大规模的动物细胞培养具有重要的指导意义.     

供体细胞对猪体细胞克隆胚胎早期发育的影响

以中国农业大学实验用小型猪香猪胎儿成纤维细胞、成年耳成纤维细胞和颗粒细胞3种细胞系为供体细胞进行核移植。比较了血清饥饿法和接触抑制法处理胎儿成纤维细胞诱导进入G0／G1期的效率，发现二者差异不显著（P〉0．05），血清饥饿2d和4d差异不明显，同样接触抑制2d和4d差异也不显著（P〉0．05）。系统研究了影响克隆胚胎发育的供体因素：血清饥饿与否、细胞形态、细胞类型及个体差异等，结果表明：血清饥饿处理对克隆胚的早期发育没有明显的促进作用；圆形光滑细胞有利于细胞融合，对早期发育无显著影响（P〉0．05）；不同个体、不同类型的供体细胞对克隆胚囊胚发育率有一定的影响。     

山羊胚胎肝脏组织发生的形态学观察

运用常规光镜技术对关中奶山羊胚胎期肝脏的发育进行了组织学研究，结果表明：早在50日胚龄的肝组织中，就已经形成血管、窦状隙、幼稚型血细胞和成熟的红细胞。随着胎龄的增长，窦状隙先增大，然后减小。小叶间胆管在大约60日胚龄形成。小叶间动脉在大约66日胚龄形成，并且此时造血灶的数量最多。肝板在105日胚龄形成。     

PGI2对缺少内源性PGs的绵羊早期胚胎体外发育的影响

试验旨在探讨添加外源Iloprost（PGI₂的稳定类似物）对缺少内源性前列腺素（PGs）的绵羊早期胚胎体外发育的影响。常规体外受精,通过在体外培养液中单独或联合添加前列腺素合成限速酶COX-1和COX-2的特异性抑制剂SC560和NS398,观察COX-1和COX-2对绵羊早期受精胚胎体外发育的影响。添加抑制剂NS398后,再协同添加不同浓度Iloprost,观察PGI₂对绵羊早期体外胚胎发育的具体作用,并对孵化囊胚的细胞数进行分析。结果显示,在卵裂率和囊胚率方面,单独添加NS398与同时添加SC560和NS398组间差异不显著（P>0.05）,而与对照组间差异显著（P<0.05）。添加NS398后,再添加不同浓度的外源性Iloprost可代替胚胎内源性PGI₂的作用,基本消除COX-2抑制剂对绵羊早期胚胎体外发育的不利影响。Iloprost的浓度以1×10^-6 mol/L为宜,H33342染色结果差异不显著（P>0.05）。本试验结果表明,胚胎内源性COX-2对绵羊早期胚胎中PGI₂的合成起主要调控作用。外源添加Iloprost可补偿胚胎内源性PGI₂的缺失作用,解除NS398对COX-2的特异性抑制作用,最终促进绵羊早期胚胎的体外发育。     

绵羊胚胎成纤维细胞饲养层用于培养人诱导性多能干细胞的效果研究

试验在体外分离培养1月龄绵羊胚胎成纤维细胞（sheep embryonic fibroblast，SEF），经丝裂霉素C处理后探讨其作为诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSC）体外培养饲养层的可行性。试验以SNL饲养层细胞为对照，人iPSC（hiPSC）为培养对象，通过形态学观察、碱性磷酸酶（AP）染色、以及实时荧光定量PCR和免疫细胞化学对hiPSC标志基因mRNA和蛋白表达的检测，比较了SEF细胞和SNL细胞作为干细胞饲养层的效果。结果表明，在试验期内，与SNL饲养层体外培养的hiPSC相似，SEF饲养层体外培养的hiPSC在形态上呈集落样生长，增殖速度快；AP染色呈蓝紫色，能够维持未分化状态；能正常表达多能性标志基因。两种饲养层细胞培养的hiPSC多能性标志基因c-Myc、Klf4、OCT4和SOX2 mRNA的表达以及OCT4、SOX2、SSEA4和TRA-1-60蛋白的表达并无显著差异（P>0.05）。本研究结果初步表明SEF可作为体外培养iPSC的饲养层细胞，为进一步建立可表达促生长因子的基因修饰SEF细胞系奠定了基础。     

牛卵母细胞质内注射体细胞核移植胚的早期发育

研究牛皮肤成纤维细胞的处理方式对卵质内直接注射法构建的核移植胚胎发育的影响，同时比较了MⅡ期与TⅡ期卵母细胞作为受体的效果。结果表明：在细胞核注射前对供体细胞作低渗处理可明显提高胚胎构建的成功率和早期发育能力。牛皮肤成纤维细胞是否作G1／G0期同期化处理，对核移植胚胎的发育没有明显的影响。发现供核细胞在悬浮情况下作休眠处理，所得核移植胚胎的发育能力与贴附休眠的细胞基本相同，且悬浮休眠3d后的细胞无需再作低渗处理便可用作细胞核注射。MⅡ期或TⅡ期卵母细胞作为胞质内核注射受体，对牛体细胞核移植胚胎的早期发育没有明显影响。