温度和盐度对菲律宾蛤仔稚贝生长及发育的影响

本文叙述了，在室内控制条件下，温度和盐度对菲律宾蛤仔稚贝生长及发育的影响。蛤仔稚贝生长的适宜水温为15—30℃，其中以25℃为最好。在此温度范围内，稚贝生长迅速，成活率高达80％以上。稚贝对10℃以下的低温有强的忍耐性，也能忍耐35℃的高温，其死亡的临界温度在40℃左右。稚贝生长的适宜盐度为14．0—33．5‰，最适盐度是20．5‰左右。在此盐度范围内，稚贝发育整齐，成活率高达85％以上。生长的盐度下限和上限分别为7．5‰和40．0‰左右。幼虫变态的适宜盐度在20．5～33．5‰之间，在此盐度范围内，幼虫成活率为65％以上。盐度在27‰时幼体的成活率最高，达到92．5％。幼虫变态的盐度下限为7．5‰左右，而上限则在于40．0—46．5‰之间。     

两种弧菌对菲律宾蛤仔代谢途径影响的比较研究

采用基于核磁共振波谱技术的代谢组学技术,探索菲律宾蛤仔在受到鳗弧菌和灿烂弧菌感染的代谢物变化特征,构建菲律宾蛤仔对弧菌感染后的代谢网络调控图谱,并比较两种弧菌毒性效应的差异。试验结果表明,3种代谢物葡萄糖、谷氨酸、苏氨酸在两种弧菌感染时均发生了变化,表征鳗弧菌感染的代谢物为牛磺酸、精氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸;而表征灿烂弧菌污染的代谢物为甜菜碱、二甲基甘氨酸、胆碱、谷氨酸、亚牛磺酸。     

菲律宾蛤仔二种I型溶菌酶的重组表达和抑菌活性

为研究病原微生物刺激后,菲律宾蛤仔I型溶菌酶的免疫应答反应,实验采用重组表达技术,从菲律宾蛤仔中得到2种I型溶菌酶的重组蛋白rVpILYZ-1和rVpILYZ-2,发现其均具有较为广谱的抑菌活性;其中,rVpILYZ-1对副溶血弧菌、灿烂弧菌和藤黄微球菌等具较强的抑菌活性,而rVpILYZ-2对副溶血弧菌抑菌活性较强,且二者均通过非酶抑菌活性和胞壁酸酶活性来发挥抑菌作用。结果显示,rVpILYZ-1最适pH和温度分别为6.5和20 ℃,而rVpILYZ-2最适pH和温度则分别为4.5和10 ℃。此外,rVpILYZ-1和rVpILYZ-2均具免疫调理活性,能够促进血细胞对病原菌的吞噬作用。研究表明,VpILYZ-1和VpILYZ-2在菲律宾蛤仔清除病原微生物的免疫应答反应中发挥重要作用。     

温度、盐度变化及鳗弧菌刺激对菲律宾蛤仔Ⅰ型溶菌酶基因表达的影响

为研究在环境因素变化后,菲律宾蛤仔I型溶菌酶参与免疫应答反应的变化模式,实验采用c DNA末端快速扩增技术,从菲律宾蛤仔体内克隆获得了一种I型溶菌酶基因的全长c DNA序列(命名为Rpi LYZ-2),该序列开放阅读框(ORF)为471 bp,编码156个氨基酸。Rpi LYZ-2基因在所检测组织中均有表达,其中在外套膜中表达量最高,在肌肉组织中表达量最低。采用荧光定量PCR法,研究了不同温度[(29±1)、(21±1)和(13±1)°C]、盐度(32、22和12)及鳗弧菌刺激对菲律宾蛤仔I型溶菌酶基因表达的影响。结果显示,在温度21°C和盐度22胁迫处理后,Rpi LYZ-1基因的表达量呈现先上升后下降的趋势,而Rpi LYZ-2基因的表达量则呈现先下降后上升的趋势。在高温29°C和低盐12胁迫条件下,Rpi LYZ-1基因表达量总体呈下降趋势,而Rpi LYZ-2基因表达量总体呈上升趋势;经鳗弧菌刺激后,Rpi LYZ-1基因的表达量得到显著诱导,而Rpi LYZ-2基因表达量则表现为先降低后上升的趋势。研究表明,环境因子变化和病原菌刺激能够显著影响菲律宾蛤仔两种I型溶菌酶基因的表达量,且Rpi LYZ-1和Rpi LYZ-2可能存在着功能分化。     

盐度对菲律宾蛤仔浮游幼体存活和生长的影响

研究结果表明:菲律宾蛤仔受精卵在26℃水温下的最适孵化盐度为23 8～34 8,孵化率平均在80%以上;盐度38 3和21 2组,对受精卵的孵化有一定负面影响,孵化率为30%～60%;盐度低于15 9,受精卵基本上不能孵化;盐度29 5为幼体生长的最适盐度,8d可生长成下潜幼体,平均日生长16μm,成活率90%,盐度高于或低于29 5,其幼体的存活和生长都受到很大影响。     

菲律宾蛤 仔生理生态学研究：Ⅱ.温度,饵料对同化率的影响

在室内试验条件下,研究了温度、饵料的种类、密度和质量对菲律宾蛤仔同化率的影响。试验结果显示,随水温的升高,菲律宾蛤仔滤水率、摄食率、同化率以及净生长率均有明显的增加,经方差分析（ＡＮＯＶＡ）显示,温度对它们的影响极显著。菲律宾蛤仔对新月菱形藻、球等鞭金藻和亚心形扁藻的同化率基本相同。饵料的丰度和质量是影响菲律宾蛤仔同化率的重要因素,随食物中有机物含量（ＰＯＭ/ＴＰＭ）的增加,同化率也增加;且随饵料     

温度对菲律宾蛤仔滤食率、清滤率和吸收率的影响

于1997年12月,1998年3月、7月,1999年8月在中国科学院海洋研究所实验室采用静水方法对9土0.1℃,16土0.5℃,22土0.2℃,26±0.6℃下菲律宾蛤仔的滤食率FR、清滤率CR、吸收率AE进行了测定。结果表明,在9～22℃温度范围内蛤仔滤食率、清滤率、吸收率均随温度的升高而增大,在22℃达到最大值,并且各温度间差异显著(ANOVA,P＜0.05)。当温度达到26℃时,滤食率、清滤率、吸收率均有所下降,但和22℃值比较差异并不显著(ANOVA,P＞0.2)。说明蛤仔对温度有很强的适应能力,其生长最适温度为22℃左右。     

大连群体两种壳型菲律宾蛤仔的双列杂交

为探讨不同壳型菲律宾蛤仔的杂种优势,于2007年6月开展了壳宽型（W）和壳扁型（P）两种壳型菲律宾蛤仔的双列杂交。实验由2个杂交组PW（P♀×W♂）、WP(W♀×P♂)和2个自交组WW(W♀×W♂)、PP(P♀×P♂)组成。结果表明,杂交子代壳宽与壳长的比值、放射肋数介于两个自交子代之间,表现为中间型。浮游期间,幼虫未表现出生长优势,但表现出一定的存活优势,幼虫大小存在显著的母本效应。PW和WP子代的存活优势分别为（3.43±0.54）和（4.21±0.55）。室内培育阶段,杂交子代稚贝表现出明显的生长、存活优势,但母本效应逐渐减弱,PW和WP子代的生长优势分别为（10.76±2.25）和（8.28±1.88）,存活优势分别为（5.52±0.62）和（11.10±2.41）。养成期间,杂交子代的生长、存活优势更加明显,母本效应消失,PW和WP子代的生长优势分别为（16.22±0.23）和（14.80±1.50）,体重的杂种优势分别为（50.29±1.13）和（35.27±2.43）,存活优势分别为（12.30±1.37）和（17.45±0.75）。以上结果说明两种不同壳型蛤仔杂交可以产生杂交优势,随着个体发育杂交优势越来越明显。     

菲律宾蛤仔稚贝最适生长环境条件的响应面法分析

为考察温度(T)、盐度(S)、pH及三者交互作用对菲律宾蛤仔稚贝期壳长生长的影响,使用Design-Expert 7.0软件采用BBD(Box-Behnken Design)实验设计方案,进行响应面分析,寻找最适生长条件组合,并构造蛤仔稚贝壳长生长模型。实验进行30 d对蛤仔稚贝壳长(L)进行测量。实验条件梯度设计为温度(30℃、25℃、20℃)、盐度(15、20、25)、pH[(7.00±0.09)、(8.00±0.09)、(9.00±0.09)]。结果显示:(1)温度在实验区间内与蛤仔稚贝壳长生长呈一定的正相关,在30℃附近达到壳长极值,盐度在实验区间内也与壳长生长呈一定正相关,但在接近25时达到壳长极值,pH在8～9时出现壳长极值,略偏碱性水体有利于蛤仔稚贝生长。(2)温度、盐度及pH三者间对蛤仔稚贝生长无显著交互作用(P>0.05)。通过Design-Expert 7.0软件对数据进行二次多元回归拟合,得到蛤仔稚贝壳长Y对编码自变量A、B和C的二次多元回归方程:Y=4.08+0.10A+0.18B+0.11C-0.055A2-0.13B2-0.12C2(R2=0.977 4),软件模拟最适蛤仔稚贝生长的条件组合为[T=29.65℃,S=23.35,pH=(8.46±0.09)]。     

菲律宾蛤仔GST基因家族的全基因组鉴定及急性盐度胁迫下的表达特征

为阐明菲律宾蛤仔(Ruditapesphilippinarum)谷胱甘肽转移酶(glutathioneS-transferase,GST)基因(RpGST)家族特征及其在应对急性盐度变化中所起的作用,本研究通过生物信息学方法对RpGST基因家族进行了全基因组水平的鉴定、染色体定位、结构特征分析、进化分析和表达特征分析,共鉴定出7个RpGST基因家族成员,分别命名为RpGSTA1、RpGSTA2、RpGSTA3、RpGSTA4、RpGST＿C＿3a、RpGST＿N＿M1、RpGST＿N＿M2。RpGSTs不均匀地定位在5条染色体上,其编码蛋白的理化性质呈现出不同程度的亲水性。RpGST蛋白均定位于细胞质中,该基因家族成员都具有谷胱甘肽转移酶结构域(PF00043、PF02798),表明RpGSTs蛋白参与抗氧化和解毒过程;系统发育分析显示, RpGSTs分为3个亚家族且在进化上保守。实时荧光定量分析显示,急性盐度胁迫菲律宾蛤仔0 h、12 h和24 h后,急性高盐(40)胁迫下肝胰腺中RpGSTA和RpGST＿N＿M亚家族的基因整体表达水平随时间逐步升高,RpGST＿C＿3亚家族的基因表...     

魁蚶各组织溶菌酶活性对鳗弧菌侵染的响应

为了有效防治细菌及其他病原微生物对魁蚶等贝类的危害,本实验研究了魁蚶各组织中溶菌酶活性对鳗弧菌侵染的响应过程,以期探讨魁蚶体内溶菌酶的免疫功能。本实验采用注射活菌的方法侵染20月龄魁蚶个体,随机选取16只个体,在每只个体的斧足处注射1 mL(约1×10~9个)鳗弧菌菌悬液作为感染组;随机选取16只个体不注射鳗弧菌作为对照组。两组魁蚶分别于洁净海水中暂养4、12、24和48 h后,每组随机取4只魁蚶个体的血液、外套膜、鳃、斧足、肝胰腺和闭壳肌等组织,采用ELISA试剂盒测定其溶菌酶含量变化。结果显示,对于鳗弧菌的侵入,魁蚶血液中溶菌酶含量由正常低值迅速增高并一直维持较高的含量,说明血液是魁蚶机体防御病原菌的主要免疫组织之一;魁蚶外套膜在无感染的情况下,对外界水环境的干扰始终保持较高的溶菌酶含量;鳃、斧足的溶菌酶含量均在注射细菌24 h之后明显高于正常值,说明外套膜、鳃、斧足作为魁蚶机体与外界接触的第一道屏障也能应对病原菌入侵,但反应较血液延迟;肝胰腺和闭壳肌的溶菌酶含量变化不明显,推测肝胰腺和闭壳肌不是魁蚶的重要免疫组织或器官。本实验结果可为魁蚶抗病选育及免疫机理方面的研究提供相关的参数。     

菲律宾蛤仔寡肽抗前列腺癌DU-145细胞的机制研究

为研究人工合成的菲律宾蛤仔寡肽体外抗前列腺癌细胞DU-145的活性及作用机制,实验采用流式细胞仪、激光共聚焦显微镜、Western blot等方法检测人工合成菲律宾蛤仔寡肽作用于DU-145细胞后细胞凋亡率、线粒体膜电位改变、细胞色素C表达、caspase3、caspase9的变化,并用电子显微镜观察细胞超微结构的改变。结果显示,随着药物浓度的增加和作用时间的延长,DU-145细胞的抑制率逐步增高,当药物浓度为2.5 mg/m L时,24 h抑制率为49.9%±4.1%,72 h抑制率为97.2%±7.34%;Hoechst33258染色和电子显微镜下观察发现,加药组细胞出现细胞核固缩、染色质凝集和细胞核碎片化等细胞凋亡的典型特征,随着药物浓度的增加,凋亡的细胞逐渐增多;线粒体膜电位逐步下降;Western blot检测显示药物作用后细胞内Bax表达增加,Bcl-2表达减少,Bax/Bcl-2比值增加,Cyt-C、caspase-3、caspase-9表达增加,且与药物浓度成正相关。研究表明,人工合成菲律宾蛤仔寡肽能诱导人前列腺癌细胞DU-145凋亡,可能机制为上调Bax表达、下调Bcl-2表达、增加Bax/Bcl-2比值,诱导线粒体膜电位下降,促使Cyt-C转移并激活caspase家族发生级联反应。     

菲律宾蛤仔不同发育时期及成体不同组织中内参基因筛选

为筛选出菲律宾蛤仔17个发育时期及成体7个组织中的最适内参基因,实验采用3个内参基因筛选方法ge Norm、Norm Finder及ΔCt对菲律宾蛤仔不同发育时期和成体不同组织中的12个候选内参基因延伸因子1α基因(EF1A)、TATA盒结合蛋白基因(TBP)、组蛋白H3基因(HIS)、细胞色素b5基因(CYTB5)、泛素缀合酶基因(UCE)、核糖体蛋白L8基因(RPL8)、核糖体蛋白S23基因(RPS23)、核糖体蛋白L2基因(RPL2)、细胞色素C基因(CYTC)、生长因子受体结合蛋白2基因(GFRP2)、肌动蛋白基因(ACT)和微管蛋白基因(TUB)进行表达稳定性分析。结果显示,菲律宾蛤仔不同发育时期q RT-PCR分析需要3个内参基因,分别为CYTC、CYTB5和RPS23;菲律宾蛤仔成体不同组织q RT-PCR分析需要2个内参基因,分别为CYTB5和GFRP2。ACT在菲律宾蛤仔不同发育阶段和不同组织中表达最不稳定。     

菲律宾蛤仔奶牛蛤品系两个世代的杂交与近交效应

为改良菲律宾蛤仔奶牛蛤品系的表型性状,于2010年7月以奶牛品系的全同胞子一代和子二代上选10%的个体作为亲本,采用双列杂交法,建立近交组合(F₂₂、F₃₃)、杂交组合(F₂₃、F₃₂)并设置对照组(C₂₂、C₃₃),研究了两个近交世代的杂交效应及近交效应。结果表明,杂交使得幼虫的生长性状和存活性状得到了部分改良,但稚贝的生长性状尚未得到提高。幼虫表现出微弱的生长优势,中亲生长优势为(0.95±1.23);F₂₃杂种优势为(0.36±0.59),F₃₂杂种优势为(1.56±1.96)。稚贝表现为杂种劣势,中亲生长劣势为(-2.90±3.20);F₂₃稚贝杂种劣势为(-4.60±3.21),F₃₂稚贝杂种劣势为(-0.75±10.13)。幼虫和稚贝均表现为存活优势,中亲存活优势分别为(9.43±4.41)、(8.66±12.25);F₂₃存活优势分别为(0.77±3.60)、(6.70±8.81);F₃₂存活优势分别为(20.93±7.92)、(10.94±16.28)。杂交效应主要受到交配方式的影响,母本效应主要作用于幼虫期。近交使得世代F₂₂、F₃₃的生长性状得到了改良,但两个世代的存活性状均出现了不同程度的近交衰退。世代 F₂₂、F₃₃幼虫期生长性状表现为近交衰退,衰退率分别为(5.17±4.38)、(4.99±2.72);稚贝期生长性状未表现出近交衰退现象,其衰退率分别为(-0.79±13.66)、(-0.93±12.85)。对于存活性状而言,两个世代均出现近交衰退现象,世代F₂₂及F33幼虫和稚贝的近交衰退率分别为(0.16±5.82)、(9.98±10.04),(19.33±11.28)、(13.08±16.17)。表型性状的近交效应主要受到世代效应的影响。通过上选、杂交与近交的有机结合,有效地改良了奶牛蛤品系的表型性状。     

三疣梭子蟹水通道蛋白 1 cDNA 及其盐度胁迫下的表达分析

采用RACE技术克隆获得总长为1 712 bp的三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)水通道蛋白基因全长cDNA序列,命名为PtAQP基因.该基因5'和3'非编码区分别为153 bp和788 bp,开放阅读框为771 bp,推测编码256个氨基酸,预测分子量为27.0 kD,理论等电点为8.26.生物信息学分析表明,PtAQP含有6个跨膜区和2个NPA单元,具有与MIP家族匹配的保守氨基酸序列,属于稳定蛋白;同源性和系统进化分析表明,三疣梭子蟹PtAQP氨基酸序列与可口美青蟹(Callinectes sapidus) AQP1的同源性最高(87％),与可口美青蟹紧密聚为一支;荧光定量RT-PCR分析表明,PtAQP基因在各组织中均有表达,而在胃中的相对表达量最高.通过分析PtAQP基因在盐度胁迫中的表达规律发现,盐度胁迫可显著改变PtAQP基因在三疣梭子蟹鳃和肝胰腺中的表达模式,整体呈先下降后上升最后下降到初始水平的表达趋势.该研究结果表明,PtAQP基因在三疣梭子蟹渗透压调节中发挥重要作用.     

菲律宾蛤仔福建与广东群体的双列杂交

2015年9月–12月,以菲律宾蛤仔福建养殖群体和广东野生群体子一代为亲本,开展了双列杂交实验,建立了两个自交组和两个杂交组,研究了杂交子代幼虫和稚贝的生长与存活的杂种优势。结果显示,各实验组均有较高的受精率和孵化率,但无显著差异。总体上,幼虫期的生长受母体效应影响显著,稚贝期的生长杂交效应主要受交配方式影响。相反,幼虫期的存活受配对方式影响最显著,稚贝期的存活受卵源影响显著。在幼虫期,杂交组与自交组在生长和存活方面差异不显著。在稚贝期,生长表现出明显的杂种优势,壳长和壳高在30日龄以后,正反交组的平均生长速率显著快于自交组。在40日龄时,壳高和壳长总杂交优势值达到最大,分别为25.64和27.00。这可能是因为杂种优势的表达具有时期差异性。在幼虫期,福建自交组表现出最高的存活率,为36.45%±1.85%;稚贝期,广东自交组存活率最高,为52.27%±2.13%。在幼虫期和稚贝期的存活率方面,未观测到杂种优势,这可能是由于两个杂交亲本群体与存活相关的基因频率无差异或者检测次数较少所致。     

低盐胁迫下三疣梭子蟹蝗抗利尿肽基因的表达

本研究采用RACE技术克隆了三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)蝗抗利尿肽(neuroparsin,PtNP)基因。该基因全长1920 bp,5￠端非编码区237 bp,3￠端非编码区1373 bp,开放阅读框309 bp,编码102个氨基酸,预测分子量10.8 k D,理论等电点7.42。PtNP含有12个半胱氨酸残基,具十足目动物蝗抗利尿肽典型的特征。同源性和系统进化分析表明,PtNP与拟穴青蟹(Scylla paramamosain)NP4的同源性最高(89%),并且三疣梭子蟹与拟穴青蟹首先聚为一支。组织表达分析发现,PtNP基因在脑组织中的相对表达量最高,其次是鳃和眼柄,在卵巢、肌肉、心脏和肝胰腺中表达量较低或不表达。通过分析PtNP基因在低盐胁迫过程中的表达规律发现,低盐胁迫可显著改变PtNP基因在脑、鳃和眼柄组织中的表达模式,整体呈现上调表达趋势,其中在脑、鳃和眼柄中表达量分别最高上调至7.7倍、2.8倍和2.6倍,且存在显著差异(P0.05)。去除眼柄后该基因在鳃中的表达呈上升趋势,且去除双侧眼柄组的表达量显著高于去除单侧眼柄组(P0.05)。本研究结果表明PtNP基因在三疣梭子蟹盐度适应中可能发挥一定作用且受神经内分泌系统的调控。     

急性盐度胁迫对日本黄姑鱼肌肉组织转录组的影响

盐度是影响鱼类各种生理活动的重要环境因素,为探讨急性盐度胁迫对经济海水鱼类日本黄姑鱼基因表达水平的影响,实验基于Illumina HiSeq^TM 2500高通量测序平台,对不同盐度条件下日本黄姑鱼幼鱼肌肉组织进行转录组测序并开展生物信息学分析。结果显示,高盐组、低盐组和对照组分别获得46 379 598、36 130 844和38 715 820条Clean reads,总碱基数分别为5.27、4.87和5.53 GB。经组装得到91 667条转录本,去冗余后拼接得到61 601条Unigenes。与对照组相比,高盐组和低盐组分别有2 230和1 377个差异Unigene上调,1 959和2 447个差异Unigene下调,随机选取6条差异表达基因进行实时荧光定量PCR验证,结果与转录组测序一致。通过对显著差异表达基因进行筛选,在高盐组和低盐组中分别发现21和41个差异表达基因与离子通道相关,共有的离子通道相关基因为15个,其中14个基因表达趋势一致。而在高盐组和低盐组发现的离子转运体基因分别为6和10个。GO功能富集分析发现,差异基因显著富集在蛋白酶体、补体激...     

斑马鱼BLT1-like基因的克隆和表达分析

利用RACE技术克隆得到了斑马鱼(Danio rerio)白三烯B4受体样(BLT1-like)基因BLT1-like1和BLT1-like2的全长cDNA序列,其分别编码339和356个氨基酸。序列和结构分析发现,其编码的两个蛋白均属于G蛋白偶联受体家族视紫红质蛋白亚族,并具有典型的G蛋白偶联受体的特征,与人的BLT1同源度达31%以上。进一步将两基因与绿色荧光蛋白融合表达,发现其具有较好的细胞膜定位功能;Western印迹检测也证实,重组表达细胞的全细胞蛋白可与人源BLT1的多克隆抗体发生特异性相互作用。此外,荧光定量PCR分析结果显示,在斑马鱼幼鱼发育过程中,BLT1-like1基因在胚胎发育12 h显著上调,mRNA表达量上升至1 h的18倍,而BLT1-like2基因在胚胎发育24 h发生显著上调,表达量上升至1 h的34倍;而在斑马鱼成鱼中两个基因在心脏和肝脏中表达量相对较高,而肠、皮和眼睛中表达量相对较低。本研究的结果说明斑马鱼中可能存在多个BLT1基因,并为鱼类BLT1基因的克隆和功能鉴定提供基础。