禽流感RT-PCR诊断法的建立

根据禽流感病毒（ＡＩＶ）Ａ／Ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｂｒｅｓｌｉｎ／１９０２（Ｈ７Ｎ７）株的血凝素（ＨＡ）基因参考序列设计合成一对Ｈ７ＨＡ特异引物,并应用ＳＤＳ－蛋白酶Ｋ法提取病毒ＲＮＡ,建立了逆转录－聚合酶链式反应（ＲＴ－ＰＣＲ）检测ＡＩＶＲＮＡ的方法。应用此法对鸡胚培养的ＡＩＶ尿囊液、ＳＰＦ感染鸡粪便进行了检测,并与琼脂扩散试验和电镜技术作了对比。特异性试验以新城疫病毒（ＮＤＶ）、传染性法氏囊病病毒（ＩＢＤＶ）、传染性支气管炎病毒（ＩＢＶ）、减蛋综合征病毒（ＥＤＳ－７６Ｖ）等的感染鸡胚尿囊液作为对照。结果表明,ＡＩＶ尿囊液ＲＴ－ＰＣＲ全部阳性,ＳＰＦ感染鸡粪便８７份,ＲＴ－ＰＣＲ检出６９份阳性,样品处理浓缩后琼脂扩散检出１１份,电镜检测了２３份样品,仅检出２份阳性。非特异性对照样品经ＲＴ－ＰＣＲ检测全部阴性。将ＡＩＶ感染鸡胚尿囊液作１０倍系列连续稀释,可检出稀释度为１０－２的病毒尿囊液。ＲＴ－ＰＣＲ最早检出时间为感染后第３天,而琼扩和电镜均是７天。该法具有高度的特异性和灵敏性,且节约时间（只需８小时左右）,可从分子水平上对ＡＩＶ进行早期快速诊断和流行病学调查     

新城疫病毒（昌黎株）F蛋白基因的克隆和序列分析

以鸡胚尿囊液繁殖的新城疫病毒（昌黎株）,经差速离心浓缩后,提取ＲＮＡ,参考国外发表新城疫病毒Ｆ基因序列,设计并合成了一对长度皆为２６ｂｐ特异性引物,经ＲＴ－ＰＣＲ扩增出ＮＤＶ昌黎株部分Ｆ基因序列,将其插入本室构建的ＦｐＫＳ（－）,进行序列测定。序列分析表明该部分Ｆ基因长度为８１０ｂｐ,编码２６７个氨基酸,有４个半胱氨酸残基和２个糖基化位点,裂解位点区（１１２－１１７）氨基酸序列为Ｒ－Ｒ－Ｑ－Ｋ－Ｒ－Ｆ,与所有强毒株在这一区域的序列（Ｒ／Ｋ－Ｒ－Ｑ－Ｒ／Ｋ－Ｒ－Ｆ）相符,证明ＮＤＶ昌黎株为强毒株。     

RT-PCR检测禽传染性支气管炎病毒

用２对已发表的引物和１对自行设计的引物对同一禽传染性支气管炎病毒（ＩＢＶ）Ｈ１２０株进行ＲＴ－ＰＣＲ,分别获得了Ｓ１基因上与引物设计相一致的１７２０、２２８、６０２ｂｐ的扩增片段。用自行设计的引物对７个毒株（Ｈ１２０、Ｈ５２、Ｍ４１、Ｃｏｎｎ、Ｇｒａｙ、Ｔ、Ｈｏｌｔｅ）和５个分离株（宜毒、上毒、云毒、ＨＫ、１１８）的含毒尿囊液或纯化病毒进行ＲＴ－ＰＣＲ,结果除Ｈｏｌｔｅ株和２个分离株（宜毒、云毒）外,其余均成功地扩增出６００ｂｐ的片段。用１．７、０．２、０．６ｋｂ３对引物对６个ＩＢＶ毒株和６个分离株的含毒尿囊液在相同和不同条件下进行ＲＴ－ＰＣＲ,结果３对引物分别扩增出３、５、９株ＩＢＶ,同时可将不同血清型的１２个ＩＢＶ株分成６种基因型。将ＩＢＶ分离株ＨＫ与标准株Ｍ４１经ＰＣＲ扩增、ＨａｅⅢ和Ｈｉｎｄ酶切、ＲＦＬＰ分析,表明属同一马萨诸塞血清型。３株ＩＢＶ（Ｈ１２０,ＨＫ,Ｍ４１）在鸡胚中繁殖,ＰＣＲ最早检出的时间为２０～２４ｈ。ＲＴ－ＰＣＲ提供了直接从尿囊液和感染鸡组织中快速检测病毒的新方法。     

应用RT—PCR技术扩增禽传染性支气管炎病毒S1基因的研究

选择Ｓ１基因做为目的基因,运用ＲＴ－ＰＣＲ技术分别扩增１２株以非免疫鸡胚繁殖并通过超速离心浓缩的鸡胚尿囊液中的ＩＢＶ,所用引物为ＩＢＶ Ｂｅａｕｄｅｔｔｅ株Ｓ１基因两侧的对应序列,跨幅为１．７２ｋｂ。结果６株ＩＢＶ毒株（ＳＡＩＢ３、Ｆ、Ｄ４１、Ｈ５２、Ｈｏｌｔｅ）扩增出了长约１．７ｋｂ的Ｓ１基因片段,而另６株ＩＢＶ毒株虽经４次ＲＴ－ＰＣＲ重复后也显阴性。用ＨａｅⅢ内切酶对６个毒株的ＲＴ－ＰＣＲ产物     

禽流感RT—PCR诊断法的建立

根据禽流感病毒（ＡＩＶ）Ａ／Ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｂｒｅｓｌｉｎ／１９０２（Ｈ７Ｎ７）株的血凝素（ＨＡ）基因参考序列设计合成一对Ｈ７ＨＡ特异引物,并应用ＳＤＳ－蛋白酶Ｋ法提取病毒ＲＮＡ,建立了逆转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）检测ＡＩＶＲＮＡ的方法,应用此法对鸡胚培养ＡＩＶ尿囊液,ＳＰＦ感染鸡粪便进行了检测,并与琼脂扩莠试验和电镜技术作了对比,特异性试验以新城疫病毒（ＮＤＶ）,传染性氏囊病病毒（ＩＢＤ     

用地高辛标记的核酸探针从尿囊液和组织中检测传染性支气 …

将ＩＢＶＴ株基因组Ｓ１基因上０．６kb片段（位于Ｓ１基因上１１２１bp～１７２３bp之间）克隆到ＰＩＢ－ＰＣＲ Ｃloning vector中,用地高辛标记探针,分别与９株ＩＢＶ 的ＰＣＲ产物和１２株ＩＢＶ的核酸进行点杂交均呈阳性反应,而该探针不与ＩＢＤＶ和ＮＤＶ的ＲＮＡ,ＥＤＳ－７６病毒的ＤＮＡ及正常鸡胚尿囊液的抽提物反应。探针检测ＩＢＶ－ＰＣＲ产物的灵敏度为１００～２００pg。用该探针检测不同毒株ＩＢＶ在鸡胚中的繁     

减蛋综合征病毒套式PCR检测技术的研究

从ＧｅｎｅＢａｎｋ的１段含六邻体蛋白基因、蛋白酶基因、ＤＮＡ结合蛋白基因的序列中,应用Ｐｒｉｍｅｒ软件设计了２对引物。用这２对引物在分别对反应体系成分和聚合酶链反应（ＰＣＲ）试验条件进行优化后,成功地建立了减蛋综合征病毒（ＥＤＳＶ）套式ＰＣＲ检测技术。对鹌鹑源ＥＤＳＶＱＡＶｃ－９４株、ＡＶ－ｘｂ西北分离株、ＡＶ－１２７国际标准株扩增结果,第一轮ＰＣＲ得到约２９０ｂｐ的特异性片段,第二轮ＰＣＲ得到约９０ｂｐ的片段,与预期２８９ｂｐ、８９ｂｐ的设计相符合。而传染性腔上囊病病毒（ＩＢＤＶ）疫苗株Ｂ８７、鸡亲城疫病毒（ＮＤＶ）Ⅳ系疫苗株（ＬａＳｏｔａ）和正常尿囊液等对照的扩增结果均未显示任何扩增条带,有很好的特异性。所建立的套式ＰＣＲ检测方法具有特异、快速的优点,其灵敏度比常规ＰＣＲ灵敏１００倍,可检测出０．０１ｆｇ的     

应用RT-PCR技术扩增禽传染性支气管炎病毒S_1基因的研究

选择Ｓ１基因做为目的基因,运用ＲＴ－ＰＣＲ技术分别扩增１２株以非免疫鸡胚繁殖并通过超速离心浓缩的鸡胚尿囊液中的ＩＢＶ,所用引物为ＩＢＶＢｅａｕｄｅｔｔｅ株Ｓ１基因两侧的对应序列,跨幅为１．７２ｋｂ。结果６株ＩＢＶ毒株（ＳＡＩＢ３、Ｆ、Ｄ４１、Ｍ４１、Ｈ５２、Ｈｏｌｔｅ）扩增出了长约１．７ｋｂ的Ｓ１基因片段,而另６株ＩＢＶ毒株虽经４次ＲＴ－ＰＣＲ重复后也显阴性。用ＨａｅⅢ内切酶对６个毒株的ＲＴ－ＰＣＲ产物进行酶切,结果显示Ｍ４１、Ｈ５２、Ｄ４１３个ＩＢＶ毒株的Ｓ１基因包含两个ＨａｅⅢ位点,Ｆ株与Ｈｏｌｔｅ株Ｓ１基因包含１个ＨａｅⅢ位点,而ＳＡＩＢ３株Ｓ１基因则已丢失ＨａｅⅢ位点。实验结果表明：运用ＲＴ－ＰＣＲ技术检测ＩＢＶ时,由于Ｓ１基因的核酸序列具有较高的变异率,因此Ｓ１基因不宜做为目的基因。     

逆转录—聚合酶链反应（RT—PCR）检测轮状病毒

为了给轮状病毒感染的诊断和流行病学研究提供更为敏感和可靠的手段,选取Ａ组轮状病毒ＶＰ７基因上的２段高度保守序列作为引物,在优化逆转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）条件的基础上,建立了检测轮状病毒的ＲＴ－ＰＣＲ方法。通过对比试验,确定了ＰＣＲ的最优模式：９４℃变性１ｍｉｎ→５５℃退火１ｍｉｎ→７２℃延伸２ｍｉｎ,３０个循环后再在７２℃下延伸１０ｍｉｎ。用此模式进行了ＲＴ－ＰＣＲ的特异性和敏感性试验。检测的６株轮状病毒分离株（牛ＨＮ－７、ＢＲＶ００７、ＢＲＶ０１４、ＢＲＶ６５５５、猪Ｌｉ９９、Ｎａｎ８６）及２株参考株（牛ＮＣＤＶ、猴ＳＡ１１）,都能扩增出唯一的３４２ｂｐ的目的条带;对猪流行性腹泻病毒（ＰＥＤＶ）及传染性胃肠炎病毒（ＴＧＥＶ）感染猪的粪样、正常ＭＡ１０４细胞检测结果均呈阴性;检测的敏感度可达１ｐｇ水平。对４０份猪、牛、兔的腹泻粪样检测,３０份呈阳性,而用作平行对照的夹心ＥＬＩＳＡ法检测,有２５份呈阳性,两者符合率为８７．５％。两法检测不符的５份粪样的ＰＣＲ扩增产物,用地高辛标记探针进行了斑点杂交,结果均呈阳性,表明ＲＴ－ＰＣＲ法比ＥＬＩＳＡ法敏感性高。     

应用反转录—聚合酶链反应检测鸽Ⅰ型副粘病毒的研究

根据鸡新城疫病毒（ＮＤＶ）和鸽副粘病毒Ｆ基因的保守序列，设计合成１对引物ＸＺ９、ＸＺ１０，用反转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）对３种株鸽Ⅰ型副粘病毒均扩增出与预期大小相符的ＲＴ－ＰＣＲ产物，而对鸡传染性支气管炎病毒、禽传染性喉气管炎病毒、大肠埃希氏菌、禽腺病毒、禽巴氏杆菌扩增结果均为阴性；ＲＴ－ＰＣＲ最低能检出１ｐｇ的鸽Ⅰ型副粘病毒的核酸模板。     

应用生物素标记的NDV—cDNA探针检测感染尿囊液中DNV—RNA的初…

本文应用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术从构建的新城疫病毒（ＤＮＶ）ｃＤＮＡ文库中扩增含编码Ｆ糖蛋白前体－Ｆｏ酶切位点序列的３５９ｂｐ的Ｆ蛋白基因ｃＤＮＡ片段。将此３５９ｂｐ ｃＤＮＡ片段经光敏生物素标记后，即成ＤＮＶ－ｃＤＮＡ探针。该探针能特异性地从感染的尿囊液中检测出ＤＮＶ强毒株和疫苗毒株的基因组ＲＮＡ，而不与ＩＢＤＶ－ｄｓＲＮＡ，ＡＩＢＶ－ｓｓＲＮＡ，ＥＤＳ７６－ｄｓＤＮＡ、ＭＤＶ０ｄｓＤＮＡ、Ｆ     

PCR结合分子杂交法检测鸡传染性支气管炎病毒

利用逆转录－ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）特异性扩增鸡传染性支气管炎病毒（ＩＢＶ）基因组中Ｍ基因和Ｎ基因之间一段核酸片段。以ｐＵＣ１９质粒载体将此片段克隆，用ＥｃｏＲＩ和ＨｉｎｄⅢ酶切此重组质粒，回收克隆片段后，制成生物素标记的核酸探针。用ＲＴ－ＰＣＲ及生物素核酸探针法分别对ＩＢＶ，ＩＢＤＶ，ＩＬＴＶ，ＭＤＶ及ＮＤＶ进行检测，结果证明该方法为ＩＢＶ特异性检测方法。对人工感染ＩＢＶ的ＳＰＦ鸡口腔棉拭样品进行跟踪检测，证明本方法能在ＳＰＦ鸡接毒后１～１０ｄ内检出ＩＢＶ。     

应用多重反转录—聚合酶链反应检测鸡新城疫病毒和传染？…

本文建立了一种同时检测ＮＤＶ和ＩＢＶ二种病原体的多重ＰＣＲ。根据ＮＤＶ和ＩＢＶ的基因文库，设计了两对分别与ＮＤＶ与ＩＢＶ某段基因序列互补的引物，用这两对引物对同一样品ＮＤＶ和ＩＢＶＲＮＡ模板进行多重ＲＴ－ＣＰＲ扩增，结果均得到了两条特异性大步与实验设计相符的３１０ｂｐ和１７２０ｂｐ多重的ＲＴ－ＣＰＲ扩增带，而对其他６种禽病病原的ＰＣＲ扩增结果均为阴性，敏感性测定结果表明，该多重ＲＴ－ＰＣＲ技术能同     

巢式PCR快速鉴定鸡传染性支气管炎病毒的研究

鸡传染性支气管炎病毒（ＩＢＶ）经鸡胚增殖后,直接用尿囊液提取ＲＮＡ后反转录成ｃＤＮＡ,用ＩＢＶ基因３’端的ＵＴＲ１－／ＵＴＲ２＋和ＵＴＲ３－／ＵＴＲ４＋两对引物进行巢式ＰＣＲ,所检测的４个ＩＢＶ标准参考株和１６个ＩＢＶ野毒株均得到了预期的１７４ｂｐ大小的片段,而鸡新城疫病毒（ＮＤＶ）,鸡传染性法氏囊病毒（ＩＢＤＶ）及正常鸡胚尿囊液经同样处理没有可见片段出现。本试验不需纯化册毒只需０５ｍｌ病毒尿囊液即可在２４小时内得到准确的试验结果。这表明与其它ＩＢＶ鉴定方法相比,该法具有快速、灵敏、特异的优点。     

用单抗介导的荧光抗体技术检测鸡尿囊细胞内传染性支气管炎病毒的研究

用传染性支气管炎病毒（ＩＢＶ）Ｈ１２０、Ｈ５２、Ｍ４１、ＡＲＫ、澳大利亚Ｔ株、野外分离株ＲＳ、ＲＹ及鸡新城疫病毒（ＮＤＶ）、鸡传染性法氏囊病毒（ＩＢＤＶ），鸡传染性喉气管炎病毒（ＩＬＴＶ）、减蛋综合症病毒（ＥＤＳＶ）等分别接种９日龄ＳＰＦ鸡胚，３７℃孵育４８小时后，将其尿囊液离心，沉淀用ＰＢＳ悬浮，涂片，用抗ＩＢＶ单抗ＭＣ作一抗、进行间接荧光抗体检测。结果：Ｈ１２Ｏ、Ｈ５２、Ｍ４１“ＡＲＫ、Ｔ株及ＲＳ、ＲＹ均显阳性，而ＮＤＶ、ＩＢＤＶ、ＩＬＴＶ、ＥＤＳＶ均为阴性。结果表明、用此法检测鸡胚尿囊液中ＩＢＶ．具有快速、敏感、特异的优点。     

用RT—PCR检测犬外周血液单核细胞中犬瘟热病毒核衣壳蛋…

为了迅捷地诊断犬瘟热病毒（ＣＤＶ）感染，本研究采用及转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）技术，检测犬外周血液核细胞（ＰＢＭＣ）中ＣＤＶ核衣壳蛋白（ＮＰ）基因。以两套引物针对ＣＤＶＯｎｄｅｒｓｔｅｐｏｏｒｔ毒株ＮＰ基因的两个片段。应用ＲＴ－ＰＣＲ〉以６株ＣＤＶ毒株感染Ｖｅｒｏ细胞，用ＣＤＶ人工感犬染的的ＰＢＭＣ，在这两处细胞的提的ＲＮＡ中，手增ＮＰ基因片段，取得了较好的结果。在３２例临床疑为ＣＤＶ感染     

用PCR技术从一兔出血症病料扩增和检出2种病毒核酸

应用ＰＣＲ和ＲＴ－ＰＣＲ技术,对兔出血症病毒核酸作了鉴定,分别设计合成２对ＰＣＲ扩增特异性引物,即按兔出血症病毒中国分离的ＮＪ核酸酸序列合成１对引物（ＮＪ引物）,按国分离的ＦＲＧ株核酸序列民另１对引物（ＦＲＧ引物）,进行ＰＣＲ和ＲＴ－ＰＣＲ。     

IBDV逆转录—聚合酶链反应和核酸杂交检测方法的研究

以建立的传染性法氏囊病病毒（ＩＢＤＶ）逆转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）和核酸杂交检测方法，检测了细胞培养物、病理组织、粪便和饲料中的ＩＢＤＶ，并与ＩＢＤＶ夹心ＥＬＩＳＡ、琼脂扩散试验（ＩＤ）和病毒分离方法进行了平行比较试验。结果表明，ＲＴ－ＰＣＲ和核酸杂交检测方法具有高度的敏感性和特异性，是深入研究ＩＢＤ流行病学，特别是传播途径的新手段     

新城疫病毒弱毒株分子生物学特性的研究

于１９９６年从长春地区一养鸡场分离到一株新城疫病毒（ＮＤＶ长春株）,经过病毒生物学特性的研究表明该ＮＤＶ毒株为弱毒株。将ＮＤＶ长春株纯化培养后,提取病毒ＲＮＡ,经ＲＴ－ＰＣＲ扩增Ｆ基因,并测定出Ｆ基因的全部核苷酸序列为１７５８ｂｐ,编码有５５３个氨基酸残基。与国内外发表的部分ＮＤＶ病毒的强毒株和弱毒株的相同序列进行比较,其核苷酸同源性在８８．２％￣９６．７％之间,氨基酸同源性在９０．１％￣９８．１％之间,并与所有弱毒株Ｆ蛋白裂解位点区（１１２￣１１７）氨基酸序列Ｇｌｙ－Ａｒｇ／Ｌｙｓ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙ／Ｓｅｒ－Ａｒｇ－Ｌｅｕ相同,从基因和分子水平上进一步证明ＮＤＶ长春株为ＮＤＶ弱毒株。     

鹅副粘病毒的分类地位初探

对从病鹅体分离的禽副粘病毒（ＧＶＰ）ＹＧ９７株，经红细胞凝集（ＨＡ）和红细胞凝集抑制（ＨＩ）试验证明，与新城疫病毒（ＮＤＶ）存在着极大的相关性。参考ＮＤＶ的３个毒力指标－最小致死量致病鸡胚平均死亡时间（ＭＤＴ）、１日龄雏鸡内接种致病指数（ＩＣＰＩ）和６周龄非免疫雏鸡静脉接种致病指数（ＩＶＰＩ）对ＹＧ９７株进行测定，表明其有与ＮＤＶ速发型类似的毒力，属强毒力的毒株。应用ＲＴ－ＰＣＲ技术对Ｆ基因重要功能区片段扩增后进行序列测定，并与多株已报道的ＮＤＶ相应片段进行序列比较，经遗传进化树分析后，初步判定其为禽副粘病毒－Ⅰ型，属基因Ⅶ型ＮＤＶ。