重离子束辐照对绵羊卵母细胞及体外受精卵早期发育的影响

试验探索重离子束辐照对绵羊卵母细胞的体外成熟及体外受精卵早期胚胎发育的影响。用不同剂量的重离子束辐照绵羊卵母细胞和精液,观察卵母细胞体外成熟率及体外受精后早起胚胎的卵裂率、桑椹胚率及囊胚率。试验结果显示:与对照组相比,1.0、1.5Gy辐射可以明显提高绵羊卵母细胞的体外成熟率(p0.01);重离子辐照绵羊精液和卵母细胞并做体外受精后,早期胚胎发育有着显著变化。当用0.5、1.0Gy剂量辐照精液时,绵羊早期胚胎的卵裂率和桑葚胚率显著升高(p0.05),囊胚率无显著变化,1.5 Gy剂量,卵裂率显著提高(p0.05),2.0 Gy剂量,卵裂率、桑葚胚率、囊胚发育率均极显著降低(p0.01);当重离子束辐照卵母细胞时,0.5、1.0Gy剂量组的卵裂率、桑葚胚率和囊胚发育率显著升高(p0.05),而2.0Gy剂量组的卵裂率和桑葚胚发育率极显著降低(p0.01),而囊胚发育率为0。结果表明低剂量的重离子辐照绵羊精液、卵母细胞,对体外受精和早期胚胎发育具有明显的促进作用,而高剂量辐照则抑制细胞的生长发育。     

受精液中肝素和咖啡因的组合对牛卵母细胞体外受精的影响

采用２种肝素浓度（１０，３０ｍｇ／Ｌ）与３种咖啡因浓度（２．５，５，１０ｍｍｏｌ／Ｌ）的交叉组合，以３０ｍｇ／Ｌ肝素的受精液为对照，探讨肝素和咖啡因对牛卵母细胞体外受精的影响，并确定受精后将卵母细胞移至单层细胞的合适时间。结果表明，当卵母细胞在受精后５ｈ移至单层细胞时，１０ｍｇ／Ｌ肝素加５ｍｍｏｌ／Ｌ咖啡因或３０ｍｇ／Ｌ肝素加２．５ｍｍｏｌ／Ｌ咖啡因的体外受精效果最好，二者的囊胚率和囊胚孵化率分别为５６．９％±７．０，８１．１％±１２．７及５６．９％±７．０，７８．９％±９．８。     

乙二胺四乙酸钠、能量基质、氨基酸对猪卵母细胞的体外成熟和早期孤雌发育的影响

本研究探讨了:(1)成熟培养基中葡萄糖和丙酮酸钠剂量对猪卵母细胞体外成熟极体排放率的影响;(2)培养基中葡萄糖、谷氨酰胺、牛磺酸和亚牛磺酸的剂量对猪孤雌激活胚胎体外发育的影响,同时探讨不同浓度乙二胺四乙酸钠(EDTA-N a)对猪孤雌激活胚胎体外发育的影响。利用屠宰场猪卵巢卵母细胞,在含不同剂量葡萄糖 丙酮酸钠的成熟液中体外成熟44~48 h,计算其极体排放率(试验1),进行化学法孤雌激活后,在含不同剂量的葡萄糖 谷氨酰胺 牛磺酸 亚牛磺酸与不同浓度的EDTA-N a的培养基中体外培养,计算孤雌激活胚的第48小时卵裂率和第168小时囊胚率(试验2)。结果表明:(1)葡萄糖 丙酮酸钠在1倍剂量(浓度分别为3.05 mm o l/L和0.91 mm o l/L)时,猪卵母细胞体外成熟的核成熟率为(59.3±5.0)%,当其剂量加倍时,猪卵母细胞体外成熟的核成熟率极显著下降(P<0.01),为(51.0±4.4)%;(2)随着EDTA-N a添加浓度的增加,猪孤雌激活胚的的囊胚发育率不断上升,添加浓度达到50μm o l/L时囊胚率最高(7.2±4.1)%,超过此浓度后囊胚率开始下降,培养基中添加适当浓度(25-100μm o l/L)的EDTA-N a对猪孤雌激活胚的囊胚发育率具有有利作用(P<0.05),添加浓度达到200μm o l/L时其有利作用消失;(3)培养基中葡萄糖 氨基酸的剂量过高(葡萄糖、谷氨酰胺、牛磺酸、亚牛磺酸的浓度分别大于5.55,1.0,7.0,5.0 mm o l/L)对猪孤雌激活胚的卵裂率无显著影响(P>0.05),但对其囊胚发育率有不利作用(P<0.05)。本研究得出以下结论:(1)适当浓度(25~100μm o l/L)的EDTA-N a对猪早期胚胎体外发育具有促进作用;(2)培养基中能量基质剂量过高会抑制猪卵母细胞体外成熟;(3)培养基中能量基质 氨基酸的剂量过高会抑制猪早期胚胎的体外发育。     

影响体外受精生产奶牛性控胚胎的因素

为了促进性控精液体外受精胚胎的产业化应用,本实验从卵母细胞体外成熟后卵丘细胞脱除程度(不脱除~完全脱除)、种公牛个体(A~C)、性控精液受精滴体积(30~100μL)和性控精子密度(0.3×106~1.0×106个/mL)4个方面,研究影响牛性控精液体外受精效率的因素。结果表明:(1)卵丘细胞部分脱除组的卵裂率(67±4.74)%显著高于不脱除组(41±2.23)%和完全脱除组(37.50±2.88)%(P<0.05);(2)种公牛B的性控精液进行体外受精,卵裂率(61.25±5.78)%和囊胚率(26.53±3.31)%显著高于A(42.5±3.45,17.65±3.65)%和C(30±2.62,16.67±2.36)%(P<0.05);(3)50~100μL受精滴卵裂率(60±3.54)%~(64.17±3.04)%和囊胚率(20.41±4.33)%~(23.38±4.47)%无显著性差异(P>0.05),但显著高于40、30μL的卵裂率[(48.33±2.89)%,(33±2.74)%]和囊胚率[(13.79±2.02)%,(12.12±3.73)%](P<0.05);(4)精子密度0.5×106~1....     

牛分离精子对体外受精的影响

本研究的目的是测定流动细胞分离仪的精子对牛卵母细胞体外受精和胚胎发育的影响。共使用了4273个牛的卵母细胞和3种类型的精子（分离、染色未分离和未染色未分离）进行体外受精试验。这些精子分别来自于3头公牛，每头公牛重复试验3－5次，数据使用ANOVA程序进行统计分析。结果显示，用3种类型精子受精后的卵母细胞囊胚率无显著差异，分别为20．4％，22．62％和22．14％，但用分离精子受精后的卵裂率显著低于未分离的精子（53．66％比71．93％，P＜0．05）。所测度的3头公牛的卵裂率和囊胚率在不同公牛之间有所差异，H008号公牛所产生的囊胚明显低于H010号公牛组（分别为17．4％比25．1％，P＜0．05）。结果证明分离过程或染色并没有影响胚胎发育，流动细胞分离仪可以有效地用于牛胚胎的体外生产。此外，分离、染色未分离和未分离精子的受精和胚胎发育率，在不同公牛之间有差异的这一发现表明，选择能产生高质量精子的公牛精液进行精子分离，可以提高体外受精的效率。     

受精温度对牛卵母细胞体外受精及随后胚胎发育的影响

将经过２０～２４ｈ体外成熟培养后的牛卵母细胞在含５％ＣＯ２，９５％空气，最大相对饱和湿度和温度分别为３７℃（Ｇ１），３８℃（Ｇ２）和３９℃（Ｇ３）的培养条件下进行体外受精，以观察受精温度对牛体外受精及其随后胚胎发育的影响。结果显示，不同受精温度对牛卵母细胞体外精子入卵率（９３．６％～１００％）及受精卵裂率（７８．５％～８０．３％）无明显影响；而早期胚胎卵裂发育速度、体外囊胚发育速度及体外囊胚发育率和孵化率均随着受精温度的升高呈上升趋势。在ＩＶＦ４２～４６ｈ，Ｇ３发育到５细胞以上卵裂周期阶段的早期胚胎比率（４０．３％）非常显著地高于Ｇ２（２４．３％）和Ｇ１（１８．８％，Ｐ＜０．００１）；而相应处于２细胞阶段的胚胎比率（Ｇ３为１４．６％）则十分显著地低于Ｇ２（２５．２％）和Ｇ１（３０．１％，Ｐ＜０．０１）。Ｇ３的囊胚体外孵化率（７５．８％）也非常明显地高于Ｇ２（５１．９％）和Ｇ１（４７．９％，Ｐ＜０．００）。结果表明，受精温度（３７～３９℃）主要影响早期胚胎的质量，从而影响到其随后的囊胚发育率、发育速度及其孵化率，而对卵母细胞的受精、卵裂率无明显影响。     

不同成熟液对猪卵母细胞体外成熟和体外受精后早期胚胎发育的影响

本研究探讨了不同成熟液[改良TCM-199液(mTCM)和改良NCSU-23液(mNCSU)]对猪卵母细胞体外成熟和体外受精后早期胚胎发育的影响，以期提高其受精和胚胎发育潜能。试验表明：(1)猪卵母细胞的核成熟与其周围的卵丘细胞扩展没有必然的联系，卵丘细胞扩散或成放射状不宜作为猪卵母细胞核成熟的标准，只有排出第一极体才能作为猪卵母细胞核成熟的标志；(2)利用mTCM 10％猪卵泡液和mNCSU 10％猪卵泡液的猪卵母细胞体外培养核成熟效果优于mNCSU 10％胎牛血清，但这三组成熟液对猪卵母细胞的卵丘细胞扩散和体外受精后的早期胚胎发育无显著影响。     

胰岛素和葡萄糖对水牛体外受精早期胚胎发育的影响

探讨了不同浓度的胰岛素和葡萄糖对水牛体外受精早期胚胎体外发育的影响。结果表明,添加胰岛素浓度为5μg/mL时,水牛早期胚胎的囊胚发育率、囊胚细胞数及冷冻-解冻后胚胎的孵化率都显著高于对照组及其他浓度组(P<0.05);加入葡萄糖的浓度大于6 mm o l/L时显著影响水牛早期胚胎发育到囊胚及孵化囊胚的阶段(P<0.05);联合添加胰岛素和葡萄糖时能显著提高水牛早期胚胎的孵化囊胚率、总囊胚率和囊胚细胞数(P<0.05)。实验证实,浓度为5μg/mL胰岛素能促进水牛体外受精早期胚胎的发育;在TCM-199中单独添加葡萄糖是不必要的,联合添加葡萄糖和胰岛素能促进水牛体外受精早期胚胎的发育。     

用荧光染料（Hoechst 33342）和激光处理精子对牛卵母细胞体外受精的影响

用流动细胞计数法分离牛的Ｘ，Ｙ精子，需要对精子进行活体荧光染色及激光照射处理。本研究进行２个实验，以探索荧光染料（Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２）和激光对牛精子以及牛卵母细胞的体外受精和胚胎的体外培养的影响。实验１包括４个精子处理组：（１）０处理组（对照组）；（２）染色组，用９ｍｇ／Ｌ的Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２对精子进行染色；（３）激光照射组，用强度为１５０ｍＷ的激光对精子进行照射；（４）染色及激光照射组，综合（２）和（３）的处理。实验２用不同浓度的Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２处理精子，以研究染料浓度与体外受精效果的关系。实验结果表明，Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２作用于精子之后，能显著降低牛卵母细胞体外受精后的分裂率、囊胚率、一级囊胚率、囊胚孵化率及胚胎发育速度，而且降低的幅度随着染料浓度的升高而增加（卵裂率除外）。精子经激光照射后对体外受精的效果没有显著影响。     

体细胞因子对牛卵母细胞体外受精的影响

本研究系统探讨了体细胞因子对牛卵母细胞体外受精的影响。在受精液中添加５％或１０％的牛卵泡液（ＢＦＦ）明显降低牛卵母细胞受精后的分裂率（３８．３％和４０．４％比对照８７．５％，Ｐ＜０．００１）和囊胚发育率（１７．４％和８．３％比对照４０．４％，Ｐ＜０．００１）。然而，在受精液中加入５０％的内膜细胞受精条件液明显提高牛卵母细胞受精后的囊胚发育率（４３．１％比３４．８％，Ｐ＜０．０５），虽然该处理对牛卵母细胞受精后的分裂率无明显影响。在体外受精系统中加入颗粒细胞的受精条件液，新鲜的输卵管细胞，输卵管细胞的单层细胞或输卵管细胞的受精条件液对牛卵母细胞的分裂率及囊胚发育率均无明显影响。相反，新鲜输卵管细胞组获得较低的分裂率（８１．７％）和囊胚发育率（３２．２％）。这些结果表明：ＢＦＦ对牛卵母细胞的体外受精具抑制作用，而内膜细胞的条件液则具促进效应。ＢＦＦ的这种受精抑制因子可能来自血清而不是卵泡细胞。     

水牛和黄牛种间体外受精的研究

将从屠宰母牛卵巢上采集的水牛和黄牛的卵母细胞经 2 0～ 2 4 h体外成熟培养后 ,分别用么拉水牛或奶牛精液进行种间和种内体外受精。受精卵在体外条件下继续培养到囊胚和孵化囊胚阶段。结果表明 ,用黄牛精子受精水牛卵母细胞 (黄×水 )或用水牛精子受精黄牛卵母细胞 (水×黄 )的种间体外受精均有较高的卵裂率 (分别为 4 6.5%和 68.4 % )。但其体外囊胚发育率分别只有 3.5%和 8.7% ,显著低于种内受精组(水×水组为 1 9.9% ,黄×黄组为 2 8.0 % ,P<0 .0 5)。在受精后 2 0 h对受精卵进行固定、染色 ,发现种间受精的黄×水和水×黄组 ,分别有 36.8%和 75.0 %的受精卵形成有 1个以上原核 ,且这些受精激活卵中大部分含 2个原核以上 (分别为 80 .9%和 80 .0 % ) ,说明种间受精的精子已进入到卵母细胞内受精并形成了雄性原核。     

牛卵泡液对牛卵母细胞体外成熟的影响

本研究系统探讨了牛卵泡液（ＢＦＦ）对牛卵母细胞体外成熟的影响。在成熟培养液中添加１０％的ＢＦＦ，明显提高牛卵母细胞体外成熟后的囊胚发育率（４５．１％比２８．２％，Ｐ＜０．０５），虽然该处理对牛卵母细胞体外成熟后的受精分裂率无明显影响（８７．５％比８７．５％）。然而，当ＢＦＦ在成熟培养液中的浓度提高到４０％时，卵母细胞体外成熟后的受精分裂率（６８．６％）和囊胚发育率（１６．６％）均明显下降（Ｐ＜０．０５）。来自不同大小卵泡（２～５ｍｍ，５．１～８ｍｍ和大于８ｍｍ）ＢＦＦ的卵母细胞体外成熟培养效果无明显差异，只是来自大于８ｍｍ卵泡的ＢＦＦ将卵母细胞粘在一起，明显地降低成熟培养后的可用卵母细胞数。在成熟培养液中加入激素（２．５×１０３ｉｕ／Ｌ促性腺激素（ＨＣＧ），５０ｉｕ／Ｌ促乳素，０．０５ｍｇ／Ｌ胰岛素、睾酮和雌二醇）对ＢＦＦ的卵母细胞成熟培养效果无影响。这些结果表明，在成熟培养液中添加一定浓度的ＢＦＦ可促进牛卵母细胞获得胚胎发育能力，ＢＦＦ的这一作用与其来源的卵泡大小和激素的存在与否无关。     

幼畜繁殖（JIVET）技术在性成熟前奶牛上的应用

本实验旨在建立高效的性成熟前奶牛幼畜繁殖(JIVET)技术体系.建立了有效的对性成熟前犊牛进行促性腺激素处理的方法,平均每只犊牛可获得卵母细胞31枚:卵母细胞在体外成熟和体外受精过程中,受精率达到63.2%,与成年牛(59.7%)差异不显著.胚胎体外培养后犊牛胚胎囊胚率达到31.6%,仍显著低于成年牛(48.0%).对3头同期发情受体母牛进行胚胎移植,其中2头受孕,1头完成全程妊娠,受孕率达到66.7%.     

胎牛血清对猪体外受精卵早期发育的影响

采用猪卵母细胞体外成熟、体外受精和受精卵体外培养技术，探讨了胎牛血清对猪体外受精卵早期发育的影响。结果表明：在猪体外受精卵体外培养的第1天添加胎牛血清可增强早期胚胎发育能力，随着添加时间的延迟，胎牛血清的效果逐渐下降，添加胎牛血清的时间决定了其对猪体外受精卵体外发育的影响。     

6－二甲氨基嘌呤对牛卵母细胞孤雌发育的影响

本研究系统探讨了 6-二甲氨基嘌呤 ( DMAP)对牛卵母细胞孤雌发育的影响。牛卵母细胞体外成熟 2 4 ,2 6,2 8或 30 h后 ,先用含 7%乙醇的培养液激活处理 5min,然后在含 2 mmol/L DMAP的培养液中培养 3h,或直接在培养液中进行培养。结果发现 ,经 2 mmol/L DMAP培养处理 3h的卵母细胞的激活分裂率和囊胚发育率均明显高于未处理的卵母细胞 ,特别是对于体外成熟 2 4 h和 2 6h的卵母细胞差异更为显著。如若在 DMAP处理的基础上同时加入 5μg/m L的细胞松驰素 ( CB) ,卵母细胞激活后的囊胚发育率则得到进一步提高 ( 48.7%比 37.5% )。研究结果表明 ,DMAP和 CB对卵母细胞激活后的孤雌发育有促进作用 ,并能降低卵龄所引起的激活效果差异     

成熟培养时间对水牛卵母细胞体外成熟的影响

采用ＴＣＭ１９９＋１０％ＯＣＳ为成熟培养液、以Ｔｙｒｏｄｅ｀ｓ改良液为受精液对水牛卵母细胞作体外成熟培养和受精,比较不同成熟培养时间（２４ｈ和３０ｈ）对水牛卵母细胞成熟率和受精率的影响。其结果为,水牛卵母细胞在成熟培养２４ｈ和３０ｈ后,其成熟率分别为６６．５％和６７．２％,受精率分别为５７．５％和４９．０％,在统计学上成熟率及受精率均无显著差异（Ｐ＞０．０５）。表明水牛卵母细胞的成熟培养时间可为２４ｈ和３０ｈ。     

山羊卵母细胞无血清体外成熟培养

为研究无血清培养系统对山羊卵母细胞体外成熟及孤雌激活胚胎早期发育力的影响,分别以0.3%牛血清蛋白(BSA)(mV)、1%聚乙烯醇(PVA)(mV)和1%胰岛素转铁蛋白亚硒酸钠(ITS)(VV)代替成熟培养液中胎牛血清(FBS),以添加5?S的OM为对照组,对来源于屠宰场的卵巢卵母细胞复合体(COCs)进行体外培养。成熟率PVA添加组(50.00%)显著低于FBS组(83.23%)(P<0.01)、BSA组(71.19%)和ITS组(76.79%),与FBS组无显著差异(P>0.05);成熟卵母细胞用离子霉素联合6-DMAP激活,在SOFaa中进行孤雌胚培养,BSA、PVA、ITS及FBS各组的卵裂率依次为61.90%、46.97%、79.07%和83.58%,囊胚率分别为25.00%、19.70%、55.81%和60.45%。结果表明:在OM基础培养液中添加BSA或PVA,卵母细胞的成熟率明显低于添加FBS,且卵裂率和囊胚发育率也低于对照组(P<0.05或P<0.01);添加ITS,卵母细胞成熟率虽低于对照组,但孤雌胚卵裂率和囊胚发育率与对照组接近(P>0.05)。表明以ITS代替FBS,可用于山羊卵母细胞体外成熟培养。