小麦NBS-LRR类抗病基因同源cDNA序列的克隆与表达分析

为获得小麦抗叶锈病相关基因,以小麦近等基因系TcLr19所构建的非亲和cDNA文库中获得的EST序列(Contig 914)为靶序列,用RT-PCR方法和cDNA末端快速扩增技术,分离克隆到片段为3 042bp的全长cDNA序列。序列分析表明该序列符合典型单子叶植物的CC-NBS-LRR结构模式,命名为TaNLR。该基因包含一个完整的2 739bp的开放阅读框(ORF),具有连续的Poly A尾和典型的加尾信号AATTAA。ProtParam程序预测表明该基因编码912个氨基酸。发育树分析显示该氨基酸序列与大麦的NBS-LRR类抗病基因蛋白同源性最高达89%。荧光定量PCR分析表明,在小麦与叶锈菌互作中,TaNLR基因受叶锈菌诱导下调表达。本研究在TcLr19小麦中成功获得了抗病同源基因,这为明确NBS-LRR在小麦抗叶锈病中的作用奠定了基础。     

小麦抗病基因同源序列(RGAs)的克隆与分析

RGA(抗性基因同源序列)法是克隆植物抗性基因的一种经济有效的方法,成为近年来的研究热点。本实验综合分析了拟南芥,西红柿,水稻,烟草等植物已克隆的抗性基因,并以这些抗性基因的NBS(核酸结合位点),LRR(富含亮氨酸重复),STK(丝氨酸/苏氨酸激酶)保守结构域设计并合成了几十对RGA引物,对小麦抗条锈病材料进行PCR扩增,获得以Xal-NBS为引物的R88RGA片段,经克隆和序列比对分析,发现该片段与逆境条件下植物抗病信号传导相关,与蛋白激酶同源性达到96%。此项研究对抗病机理的研究和基因的发掘有重要的指导意义。     

黄瓜硝酸还原酶基因(CsNR)序列分析及正反义表达载体的构建

为进一步研究CsNR的作用机制,从黄瓜幼叶中克隆获得硝酸还原酶基因编码区序列(CDS)全长和片段(CsNR;EC1.6.6.1),并运用生物学软件对该基因进行序列分析。其中CDS全长2 748 bp,编码915个氨基酸;CDS片段360 bp。CDS全长和p ROKⅡ经Kpn I单酶切和连接,构建了CsNR正义表达载体;CDS片段和p ROKⅡ经Kpn I和Sac I双酶切,构建了CsNR反义表达载体。通过与其他高等植物NR蛋白进行同源性比对分析,结果发现,CsNR基因的氨基酸序列与甜瓜、烟草、拟南芥、油菜NR基因编码的氨基酸序列高度同源,其中与甜瓜NR蛋白之间同源性最高,为98.25%。     

2 种甘蔗病害胁迫果蔗NBS 类抗病基因 同源序列的表达分析

在眼斑病和轮斑病病原菌侵染下,分析果蔗NBS类抗病基因同源序列在侵染初期的表达情况,为后续克隆关键抗病基因、研究抗病机理提供理论依据。已克隆的7条果蔗RGAs可视为来源不同的3个基因片段。将2种病原菌分别针刺接种到感病基因型黔糖3号和抗病基因型黔糖5号叶片后,3条果蔗RGAs在2种病害侵染初期均受到不同程度的上调,RGA12478对两种病害的响应最为迅速,RGA5的表达量最高,尤其在轮斑病菌的胁迫下,RGA5在胁迫后12 h的表达量大约分别是同时间点RGA12478和RGA36表达量的16倍和6倍。因此,RGA5可认为是果蔗在抵御轮斑病和眼斑病侵染初期发挥主要作用的抗病基因片段,后续应结合RACE技术获得基因全长,作为关键抗病候选基因研究其功能和在外源信号因子作用下的表达情况,全面了解该抗病基因的抗病机理。     

云南稻种抗病基因同源序列类似性分析

 利用已知植物抗病基因和蛋白激酶序列中的保守区域设计的 3对引物对 137个水稻品种DNA进行PCR扩增及聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。结果表明 ,水稻抗病基因同源序列类型丰富 ,以带型差异类似性 96 %为标准 ,这些品种可划分出籼粳差异较为明显的 3个类群 ;以带型差异类似性 6 0 %为标准 ,这些品种可划分为 2 0个类群。这些依分子标记划分的类群与品种的亲缘关系和抗瘟性基本一致。     

黄瓜膜联蛋白基因CsANN2的克隆和表达分析

以‘津研四号’黄瓜品种为材料,克隆得到一个黄瓜膜联蛋白基因的cDNA全长,命名为CsANN2。为进一步探究黄瓜CsANN2基因的功能,对CsANN2基因编码的蛋白序列进行生物信息学分析后,发现其理化性质、保守结构域以及多个功能蛋白位点都和其他植物的膜联蛋白一致。系统进化树分析表明,黄瓜CsANN2与AtANN2、AtANN6、AtANN7、BjANN2和BjANN6有较近的亲缘关系。亚细胞定位结果显示,CsANN2蛋白在细胞膜、细胞质与细胞核内都有分布。qRT-PCR结果分析表明,CsANN2基因受ABA、SA、PEG和H2O2诱导表达,但对NaCl胁迫无响应。     

黄瓜DIR家族基因的全基因组鉴定及其表达分析

【目的】基于黄瓜基因组信息和转录组测序大数据,利用生物信息学手段,对黄瓜中DIR基因家族进行鉴定,并分析其在不同组织器官和胁迫响应过程中的表达模式,为后续深入研究黄瓜DIR基因的生物学功能奠定重要基础。【方法】基于已报道的DIR基因HMM模型文件,利用HMMER软件包的hmmsearch程序从黄瓜蛋白数据库中筛选出可能的DIR基因ID,并利用在线工具Pfam和SMART进行验证,最终确定黄瓜DIR家族基因。利用ExPASy、TBtools、GSDS、MEME、MEGA、MCScanX和Circos等工具分析黄瓜DIR基因家族成员的理化特征、染色体定位、基因结构、系统进化树和共线性。基于黄瓜在不同组织和胁迫响应下的转录组测序大数据,利用黄瓜V3版本基因组信息进行转录组分析,检索黄瓜DIR基因在不同转录组测序分析中的表达情况,利用TBtools软件绘制表达热图,分析黄瓜DIR基因在不同组织和胁迫响应过程中的表达模式。【结果】在黄瓜中鉴定到23个DIR家族基因,分布于7条染色体上,编码氨基酸个数在78—684,分子量8.70—73.82 kD;系统进化分析将黄瓜DIR基因家族划分为3个亚族,...     

辣椒抗病基因同源序列的克隆与分析

 【目的】利用同源序列法分离辣椒抗病基因同源序列。【方法】根据已知植物抗病基因的NBS-LRR保守结构域设计简并引物,以辣椒品系PR205基因组DNA为模板对抗病基因同源序列进行扩增。【结果】获得了25个抗病基因同源序列（resistance gene analogs,RGAs）,聚类分析将其分为7个不同的类别。由其核酸序列推导的氨基酸序列与Mi-1.2、prf、Hero、I2C-1、RPM1基因相应区域的同源性为27.4%～98.2%。其中RGA-p20与Mi-1.2 基因的核苷酸和氨基酸序列相似性均达到99%,确认RGA-p20为抗根结线虫基因的一部分,即辣椒中也含有与Mi基因同源的根结线虫抗性基因。【结论】本研究在辣椒品系PR205中获得了抗病基因同源序列,为辣椒抗病基因的克隆奠定了基础。     

甘薯抗病基因同源序列的克隆与分析

对根据紫花苜蓿（Medicago truncatula）NBS区域的保守序列等设计的16对简并引物进行优化,筛选出6对简并引物,以甘薯的基因组DNA为模板进行PCR扩增,克隆甘薯抗病基因同源序列（RGA）。结果克隆出342个不同的甘薯RGA,这342个甘薯RGA和已知的抗病基因历、N、RGCl等具有高度同源性（Evalue〈e×10^-20）。根据抗病基因同源序列的相似性,利用Cluxtalw软件将其分为22个不同的类群。这些甘薯的抗病基因同源序列已提交GenBank（编号：DQ903322至DQ903664）。在342个甘薯RGA中,除7个是TIR外,其余属于DOD—TIR类型。用Blastx和DNAman软件对342个甘薯RGA进行列队比较,发现有9个含有抗线虫病RGC1序列的RGA,它们与RGC1的同源件为50％～100％．     

黄瓜蜡质合成相关基因CsCER4的克隆与表达分析

以华南型黄瓜649为材料,克隆了拟南芥调控蜡质合成基因CER4在黄瓜中的同源基因,命名为CsCER4。CsCER4基因CDS全长540 bp,编码179个氨基酸。启动子序列分析表明,CsCER4启动子中包括与干旱、冷、盐等多种逆境胁迫相关的调控元件。进化分析表明,黄瓜CsCER4与同为葫芦科的甜瓜、苦瓜、南瓜和西葫芦的CER4亲缘关系较近。qRT-PCR结果表明,CsCER4在黄瓜的子房和果皮中表达量较高,而在雄花、茎和叶片中表达量较低。推测CsCER4可能直接参与或通过调控蜡质合成途径影响蜡质的合成。     

6-BA诱导黄瓜CsaIAAs基因的表达研究

Aux/IAA基因是一类典型的能被生长素诱导表达的基因家族,可以被生长素、细胞分裂素、盐及干旱胁迫等诱导表达。采用Trizol法提取黄瓜幼苗的根、茎、叶、花及卷须的总RNA,经反转录成cDNA,再利用CsaIAAs基因特异性引物进行半定量RT-PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳检测CsaIAAs基因的表达情况。结果表明,黄瓜29个CsaIAAs基因中,除了CsaIAA25、CsaIAA26几乎在所有器官中都不表达外,CsaIAA07、CsaIAA09、CsaIAA16和CsaIAA20只在个别器官中表达,如CsaIAAs20只在茎中弱表达,CsaIAA29只在卷须中有弱的表达。而绝大部分的CsaIAAs基因（CsaIAA02、CsaIAA03、CsaIAA04、CsaIAA05、CsaIAA06、CsaIAA08、CsaIAA10、CsaIAA11、CsaIAA13、CsaIAA15、CsaIAA16和CsaIAA19等）在大多数器官中都可以被6-BA诱导表达,尤其是以根、茎、叶和卷须中表达量高。探讨CsaIAAs基因在黄瓜根、茎、叶、花及卷须中的表达情况,可为黄瓜CsaIAAs基因的功能研究提供重要的理论参考。     

黄瓜雌性性状的QTL定位分析

以黄瓜雌性系D0420×强雄性系D06103的211株F2单株为作图群体,应用SSR分子标记进行多态性筛选,得到与黄瓜雌性性状相关的标记位点21个,分属4个连锁群,连锁群全长为98.5 cM,标记间平均距离4.9 cM,最短的连锁群0.5 cM(LG1),最长的连锁群53.4 cM(LG2);标记间最小的遗传距离0.2 cM,最大的遗传距离25.2 cM;采用复合区间定位分析,检测到与黄瓜雌性性状相关的QTL位点2个,均位于第3连锁群上,距离最近标记的遗传距离分别为2.1和1.4 cM,LOD值分别为50.04和6.48,贡献率分别为15.36%和5.69%.     

Functional analysis of the nitrogen metabolism-related gene CsGS1 in cucumber

Glutamine synthetase(GS) plays an important role in nitrogen(N) metabolism in cucumber. In this study, we cloned and sequenced the CsGS1 gene, and analyzed the expression patterns and subcellular localization of the GS1 protein in response to different N conditions in order to determine its role in low-nitrogen(LN) tolerance. CsGS1 was abundantly expressed in the leaves of the low N-requiring cultivar D0328, while the high N-requiring cultivar D0422 showed similar expression levels across different tissues including leaves, shoots and roots. Furthermore, the GS1 protein was primarily localized in the cytoplasm of plant cells. Both cultivars were then transformed with the CsGS1 coding sequence or antisense sequence via Agrobacterium tumefaciens in order to overexpress and silence GS1 expression, respectively. Overexpression of CsGS1 significantly improved LN tolerance and photosynthetic parameters, and increased chlorophyll b content, biomass, plant height, root length, N accumulation and GS activity under LN condition compared to the control. CsGS1 silencing on the other hand significantly reduced the above indices. Taken together, CsGS1 is crucial for maintaining N metabolism in cucumber plants during N deprivation, and is a promising target for generating novel transgenic breeds with increasing nitrogen utilization efficiency.     

Genome-wide analysis of OVATE family proteins in cucumber (Cucumissativus L.)

OVATE family proteins(OFPs) are plant-specific proteins with a conserved OVATE domain that regulate plant growth and development.Although OFPs have been studied in several species,their biological functions remain largely unknown in cucumber(Cucumis sativus L.).This study identified 19 Cs OFPs distributed on seven chromosomes in cucumber.Most Cs OFP genes were expressed in reproductive organs,but with different expression patterns.Ectopic expression of Cs OFP12-16c in Arabidopsis resulted in sho...     

黄瓜枯萎病抗性遗传规律研究

利用黄瓜抗病品种‘长春密刺’和感病品种‘津研四号’构建的6个世代对枯萎病抗性基因进行遗传分析。结果表明,抗性遗传符合Mather的加性—显性遗传模型,抗性遗传组成成分以加性遗传为主,部分不完全正显性,显性作用的效应不等。抗病性由核基因控制,双亲基因分布属非集中分布类型,控制抗病性的加性基因至少有1个,广义遗传力为42.55%,狭义遗传力为38.75%,育种中采用常规有性杂交育种方法比杂种优势育种方法更有效。     

黄瓜霜霉病和白粉病病原菌的rDNA-ITS序列分析

为了应用分子特征确定黄瓜霜霉病和白粉病的病原菌种类,扩增、测定了上海地区黄瓜霜霉病菌和白粉病菌的核糖体DNA内转录间隔区(rDNA-ITS)序列,依据rDNA-ITS序列特征分析了两种病原菌种类,以及与近缘种的差异性。结果显示,黄瓜霜霉病菌的rDNA-ITS1和rDNA-ITS2长度分别为141和406 bp,rDNA-ITS1 GC含量为41.13%,rDNA-ITS2 GC含量为46.80%(闵行区株和金山区株)或46.55%(浦东新区株),rDNA-ITS序列在种内保守性很高,种间差异性与亲缘关系呈正相关,分子特征证实研究的黄瓜霜霉病病原菌为古巴拟霜霉菌;黄瓜白粉病菌的rDNA-ITS1和rDNA-ITS2长度分别为136和89 bp,GC含量分别为59.56%和66.29%,rDNA-ITS序列在研究材料中保守,与瓜类单囊壳(Sphaerotheca cucurbitae)完全相同,但与形态鉴别的结果Sphaerotheca fuliginea差异高达4.5%,提示黄瓜白粉病病原菌的种类需进一步澄清和确定。     

黄瓜RNA解旋酶基因家族的生物信息学鉴定和表达分析

利用生物信息学方法对黄瓜RNA解旋酶基因家族成员、基因分类、染色体定位和系统进化关系进行了分析预测,并利用实时荧光定量PCR技术检测了11个黄瓜DEAD-box RNA解旋酶基因的组织表达模式和NaCl、低温4℃、脱落酸(ABA)以及高温39℃胁迫条件下的表达变化。结果表明,黄瓜RNA解旋酶家族包含101个基因,DEAD-box、DEAH-box和DExD/H-box 3个亚家族分别包含32、27和42个基因成员;黄瓜的7条染色体均有RNA解旋酶基因分布,其中第3条染色体最多,有30个RNA解旋酶基因,仅有8个基因分布在第4条染色体上;黄瓜RNA解旋酶基因编码的蛋白包含376~2 330个氨基酸,等电点在5.13~10.00;qRT-PCR分析发现,除CsDEAD16和CsDEAD25外,其他基因在花中表达量均最高,在黄瓜根中仅检测到CsDEAD17、CsDEAD21、CsDEAD22和CsDEAD24的表达;黄瓜幼苗经上述胁迫处理后11个基因均有不同程度的表达量变化,其中CsDEAD16、CsDEAD21、CsDEAD22、CsDEAD24、CsDEAD25和CsDEAD27明显受ABA上调,而CsDEAD24的表达受高温诱导。本研究为进一步探索黄瓜RNA解旋酶基因在其生长发育中的作用和抗性作用机制,奠定了一定的理论基础。     

黄瓜低霜霉威残留性相关基因SDH克隆及表达

通过Solexa技术和比较基因组学方法鉴定霜霉威胁迫下黄瓜果实差异表达基因,筛选黄瓜低霜霉威残留性相关基因SDH。研究利用PCR克隆获得SDH基因全长,命名为Cs SDH。构建亚细胞定位表达载体,利用农杆菌浸润法注射烟草叶片后激光共聚焦显微镜下观察;分别用荧光定量RT-PCR方法和酶联免疫法研究高、低农残品系D9320和D0351中Cs SDH基因在农药霜霉威处理后,不同时间点、不同组织部位时空表达特征和琥珀酸脱氢酶活性。结果表明,Cs SDH基因在烟草叶片细胞中被定位在细胞膜上。黄瓜低农残品种D0351中,Cs SDH基因在果实受霜霉威胁迫后反应迅速,主要在处理前期响应表达强烈,琥珀酸脱氢酶活性显著增加,且该基因表达量显著高于其在高农残品种D9320中表达量。Cs SDH果、叶中表达量较茎中高,且各组织部位表达量高低顺序稳定,为叶果茎。黄瓜高农残品种D9320中,Cs SDH基因表达量在0.5、1、3、12 h呈现上调表达,6、9 h基因表达量差异不显著,48 h出现上调表达高峰。说明克隆得到的Cs SDH基因属农药处理前期响应基因,且该基因可能在降低黄瓜农药残留过程中发挥重要作用。试验通过研究黄瓜琥珀酸脱氢酶基因(SDH)在霜霉威胁迫下表达情况,为挖掘黄瓜低农药残留性功能基因以及探明其作用分子机制奠定基础。     

黄瓜白粉病病原菌及抗病性研究进展

文章概述了黄瓜白粉病病原菌的种类、特性、寄主范围及其分布,Sphaerotheca fuliginea和Erysiphe cichoracearum的致病力类型和生理小种的分化,黄瓜抗白粉病鉴定接种方法,生物技术在瓜类白粉病病原菌研究中的应用以及黄瓜抗白粉病的遗传基础,并提出了今后黄瓜白粉病研究的方向。