重组鸡痘病毒vFV282疫苗株理化特性测定

将重组鸡痘病毒疫苗株 vFV282 经酸、碱、热、氯仿、乙醚以及胰蛋白酶处理,接种到CEF上,观察处理前后重组鸡痘病毒疫苗株 vFV282 毒力活性的变化,分析这些理化因子对重组鸡痘病毒疫苗株 vFV282 的影响。结果在pH 3.0~pH 9.0 范围内,pH变化不会造成该重组鸡痘病毒疫苗株 vFV282毒力活性的显著变化。该重组鸡痘病毒疫苗株vFV282经50 ℃ 60 min、55 ℃ 30 min或60 ℃ 15 min即可被灭活,对氯仿敏感,经胰蛋白酶37 ℃作用 1 h,TCID50降低 2.55 log TCID50/0.1 mL,对乙醚不敏感,经乙醚作用24 h, TCID50下降1.0 log TCID50/0.1 mL。     

重组鸡痘病毒vFV282活疫苗最小免疫剂量及攻毒保护试验

将重组鸡痘病毒vFV282疫苗用生理盐水作10^-1，10^-2，10^-3，10^-4系列稀释，分别免疫7天龄鸡，于免疫后21d，分别用NDV、IBDV和FPV攻毒，观察其保护率，结果除NDV攻毒在10^-4组保护率为40％（4／10），其余各组均为100％（10／10）保护。表明该疫苗的最小免疫剂量≤10^-3TCID50/0.02mL。     

重组鸡痘病毒vFV282疫苗株细胞免疫水平的研究

用1羽份重组鸡痘病毒vFV282活疫苗对7日龄商品鸡分别进行刺种免疫和肌注免疫，28d时刺种进行二次免疫，通过不同时间阶段脾脏淋巴细胞转化指标分析表明，Con A刺激脾淋巴细胞增殖反应的净增值（OD570nm）于免疫后7d时明显升高0.092，28d时达到最高峰0.155，42d时下降至0.032，首次免疫后刺种组明显优于肌注组，二次免疫高于一次免疫组。     

鸡痘病毒弱毒疫苗株在鸡组织内的分布、消长规律及毒性试验

通过两侧翅内侧皮肤无血管处刺种和滴鼻、点眼等途径给10日龄商品蛋公鸡接种鸡痘病毒（FPV）弱毒疫苗株，利用PCR的方法检测其在鸡体内的分布与消长规律并对其毒性进行了研究。刺种组：接种后6h在刺种部位皮肤即可检测到病毒DNA；接种后1d，皮肤、肺、脑PCR检测阳性；7d，在皮肤、肺、脑，心、脾、肾、法氏囊均可检测到病毒DNA，肝为疑似；10、15d，肝为阳性；21d，脾、法氏囊PCR检测为阴性，肝为疑似；28d，除刺种部位皮肤外所有内脏器官中均未检测到病毒DNA，但刺种部位皮肤一直到接种后35d仍可检测到病毒DNA。而对照组在整个试验期间PCR检测均为阴性。滴鼻点眼组：基本规律与刺种组相同。接种后3h，在肺部即可检测到病毒DNA；6h，在肺和脑部PCR检测成阳性，法氏囊为疑似；1d，在肺、脑、心、脾、肾、法氏囊均可检测到病毒DNA，肝为疑似；21d，肺、肾、法氏囊、脑均为阳性。其中脑一直持续到接种后28d。而对照组在整个试验期间PCR检测均为阴性。毒性试验表明，FPV弱毒疫苗株虽使用安全但通过翅内侧皮肤无血管处大量刺种存在导致全身皮肤感染出痘的危险。     

口蹄疫重组鸡痘病毒活载体疫苗在豚鼠、猪体内的毒性、分布及抗体消长规律

利用临床观察、病理解剖、PCR、RT-PCR、ELISA、中和抗体检测等方法,对口蹄疫(FMD)重组鸡痘病毒(FPV)在豚鼠、仔猪体内的毒性、分布以及抗体消长规律进行研究。结果表明,FMD重组鸡痘病毒免疫的动物在整个试验期间,未表现出明显的临床症状和不良反应;病理组织切片检测无明显的组织学变化;PCR、RT-PCR检测证明,豚鼠、猪免疫FMD重组鸡痘病毒后,在心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肌肉、脑、肠系膜淋巴结内检测到FPVDNA和FMDV DNA,且在大部分组织能存在3 d左右;FMD重组鸡痘病毒均可诱导免疫动物产生较高水平的抗FMDV特异性抗体和中和抗体,验证了所构建重组FPV的生物安全性及良好的免疫原性,为其他哺乳动物实验提供了必要的基础数据。     

口蹄疫病毒重组鸡痘病毒活载体疫苗和DNA疫苗免疫牛的试验研究

将本课题组构建的共表达FMDV衣壳蛋白前体P1—2A基因以及蛋白酶3C基因的重组鸡痘病毒活载体疫苗vUTAL3CP1以及共表达P1—2A和猪白介索18基因的重组DNA疫苗（pVIRIL18P1），分别以单独及混合的共3种方式接种牛，然后通过间接ELISA、中和试验和T淋巴细胞增殖试验评价其诱导的特异性体液和细胞免疫水平。结果表明这2种基因工程疫苗均能诱导牛产生特异性的体液及细胞免疫应答。其中重组鸡痘病毒vUTAL3CP1免疫组以及联合免疫组（vUTAL3CP1／pVIRIL18P1，pVIRIL18P1／vUTAL3CP1）诱导的中和抗体滴度分别达到1：64、1：64和1：54，已接近于常规灭活疫苗水平（1：90），而特异性的T淋巴细胞增殖反应则比后者高得多（P〈0．01）。该研究结果为进一步进行免疫攻毒试验，并最终筛选出最佳疫苗和免疫程序奠定了基础。     

抗鸡传染性喉气管炎重组鸡痘病毒基因工程疫苗同居感染试验

疫苗的接触传播是疫苗免疫接种需要考虑的重要因素,为了检测重组鸡痘病毒载体疫苗水平传播的能力,对隔离条件下饲养的SPF鸡用重组鸡痘病毒基因工程疫苗接种,同时设立非免疫对照鸡,饲养期间特意延长清粪时间以增加感染的机会,1个月之后攻击传染性喉气管炎WG株强毒和鸡痘102株强毒,疫苗免疫鸡全部获得保护,而非免疫鸡则全部发病.在试验动物饲养场的自然条件下,将免疫鸡和试验对照两组鸡饲养在同一个鸡舍内,让疫苗毒的传播更接近自然条件.在每个月的攻毒试验中,对照鸡都没有获得对鸡痘和传染性喉气管炎强毒的保护.在疫苗免疫期间进行连续5个月的跟踪检测,同居未免疫鸡没有检测到抗传染性喉气管炎病毒gB抗体.这些实验结果表明抗鸡传染性喉气管炎重组鸡痘病毒基因工程疫苗不能通过接触传播.     

鸡痘病毒282E_4株TK基因重组载体质粒的构建

应用已克隆的鸡痘病毒（ＦＰＶ）２８２Ｅ＿４株基因组ＴＫ基因，在ＮｃｏⅠ部位引入痘苗病毒Ｐ７．５启动子和Ｐ１１启动子控制下的大肠杆菌ＬａｃＺ基因，经酶切鉴定，成功地构建了用于ＦＰＶ重组的载体质粒。与亲本毒株在鸡胚成纤维细胞内共转染，产生了表达ＬａｃＺ基因的重组鸡痘病毒。经传代筛选、纯化，重组病毒较稳定。实验结果表明，以ＴＫ基因构建的重组载体质粒可用于外源基因的重组表达研究。     

禽痘病毒感染对禽流感重组禽痘病毒疫苗免疫效力的影响

表达禽流感病毒 (AIV)HA和NA基因的重组禽痘病毒rFPV_HA_NA能够诱导鸡体产生 10 0 %抵抗高致病性禽流感病毒 (HPAIV)H5N1的攻击。而当鸡群已进行禽痘疫苗免疫或者感染了禽痘病毒的情况下 ,此重组疫苗的免疫效力如何 ?首先用禽痘病毒S_FPV_0 17人工感染SPF试验鸡 ,既而在感染后的不同间隔时间接种重组疫苗 ,免疫后检测鸡群的HI抗体水平 ,同时用 10 0LD50 的HPAIVH5N1进行攻击。结果重组疫苗免疫与禽痘病毒人工感染时间间隔在 4周 (或以上 )时 ,预先感染禽痘病毒对重组疫苗的免疫效力不构成影响 ,对禽流感的保护力为 10 0 % ,而间隔时间在 1、2、3周时 ,重组疫苗的免疫保护效力则受到不同程度的影响。     

表达传染性喉气管炎病毒gB基因重组鸡痘病毒疫苗免疫持续期试验

将200003批疫苗免疫4周龄SPF鸡,免疫后的7、14、21、30、60、90、120、150、180和225 d分别采血,分离血清,采用ELISA方法检测血清抗FPV抗体,结果表明重组疫苗免疫后14 d,免疫鸡血清抗体已经全部阳转,免疫后的21 d血清抗FPV的抗体出现峰值,此后便开始下降,到免疫后的6个月抗体水平已经接近阴性对照的水平.用ILTV WG株和FPV 102株强毒进行的攻毒保护试验与血清检测的结果基本一致,在免疫后的5个月内可以使免疫鸡获得100%(10/10)保护,免疫后的6个月对ILT和FP的免疫保护分别为1/7和2/10,此时需要对鸡群实施二次免疫.其他5批疫苗(200001、200002、200101、200102和200103)免疫SPF鸡后5个月用ILTV WG株和FPV 102株攻击也获得了完全保护.     

表达传染性喉气管炎病毒gB基因和新城疫病毒F基因重组鸡痘病毒疫苗免疫持续期试验

用表达传染性喉气管炎病毒gB基因和新城疫病毒F基因的重组鸡痘病毒（rFPV～gB—F）制备的疫苗免疫4周龄SPF鸡，免疫后的7、14、21、30、60、90、120、150、180d分别采血，分离血清，检测抗FPV和gB的抗体。结果表明重组疫苗免疫后14d，免疫鸡血清抗体已经全部阳转，免疫后的21d血清抗FPV的抗体出现峰值；此后便开始回落，到免疫后的6个月抗体水平已经接近阴性对照的水平。抗gB的抗体在免疫后的第二周达到阳性，之后的六个月都为阳性。在免疫后的每个月将免疫鸡取20只再分成两组。分别用新城疫强毒与传染性喉气管炎强毒的攻击。在免疫后的第一个月对新城疫的保护率为8／10，第2个月对新城疫的保护为7／10，第3个月为2／10，因此对新城疫的免疫保护期为2个月。在免疫后的5个月内可以使免疫鸡对传染性喉气管炎强毒攻击的保护率达到8／10以上，免疫后的6个月对ILT为8／13．因此rF—PV-gB—F对传染性喉气管炎的免疫保护期为5个月。     

表达新城疫病毒F基因重组鸡痘病毒的遗传稳定性

本实验为了评价表达新城疫病毒F基因重组鸡痘病毒（rFPV282E4-SF，rFPV Lp-SF）的遗传稳定性，将其在鸡胚成纤维细胞连续培养20代。通过蓝斑来鉴定重组鸡痘病毒纯度，结果所有蚀斑100％变蓝。通过对第0、10和20代F基因扩增并进行序列测定，所有碱基和氨基酸序列均和原始转移载体序列完全一致，没有发生任何改变。随后又通过间接免疫荧光证实rFPV282E4-FS和rFPV LP-FS各个代次F基因的特异表达。所有结果均显示了上述重组鸡痘病毒：艮有良好的遗传稳定性，满足兽医生物制品的遗传稳定性要求。     

鸡新城疫重组鸡痘病毒活疫苗的免疫持续期和加强免疫研究

本研究旨在评价表达新城疫病毒（NDV）血凝素-神经氨酸酶（HN）基因的重组鸡痘病毒（rFPV-12LSHN）活疫苗的免疫持续期和加强免疫对疫苗免疫效力的影响。用rFPV-12LSHN活疫苗免疫14日龄SPF鸡,103PFU/羽,7d即可检测到NDV HI抗体应答,对NDV强毒F48E8株攻毒保护率达100%。一次免疫18周后,对NDV强毒攻击依然提供完全保护。鸡痘病毒（FPV）疫苗免疫4周,再接种rFPV-12LSHN活疫苗,攻毒保护率降低至50%。相反,rFPV-12LSHN免疫4周,随后二次免疫可显著提高对NDV的体液免疫应答水平（P〈0.01）,对NDV强毒攻击的保护率仍然为100%。结果表明,表达NDV HN基因的重组鸡痘病毒（rFPV-12LSHN）活疫苗,能够快速建立坚强免疫力,免疫持续期至少可达18周,rFPV-12LSHN的二次免疫可以提高疫苗的免疫力。     

表达传染性支气管炎病毒S1基因重组鸡痘病毒的构建

将鸡传染性支气管炎病毒S1基因插入到鸡痘病毒转移载体pSY681中，获得重组转移载体pSY681。将pSY681-IBVS1转染已感染亲本鸡痘病毒S-FPV-017株的鸡胚成纤维细胞，使其在鸡胚成纤维细胞内与鸡痘病毒基因组发生同源重组，产生表达鸡IBVS1蛋白的重组鸡痘病毒rFPV-IBVS1。在含有X-gal的营养琼脂培养基上进行蓝斑筛选且进一步纯化14代。S1基因的PCR检测表明，获得的含传染性支气管炎病毒S1基因的重组鸡痘病毒能够稳定遗传，间接免疫荧光和Western blot等试验证实该重组病毒在CEF内真实地表达了分子量约为90Ku的具有免疫学活性的IBV S1糖蛋白。     

鹅细小病毒VP3基因重组禽痘病毒的构建和表达

本实验采用质脂体转染方法将禽痘病毒转移载体质粒PSY681VP3LacZ转染被禽痘病毒FPV-017感染的鸡胚成纤维细胞CEF，通过蓝白筛选和6轮蚀斑克隆纯化，获得了稳定的重组病毒。PCR鉴定，重组病毒基因组中含有VP3基因。Dot-ELISA实验证明，重组病毒表达了VP3，并具有抗原性。