J亚群禽白血病病毒膜表面糖蛋白基因gp85的克隆与表达

以pGEM-IMC2.2重组质粒为模板扩增禽白血病病毒内蒙株IMC10200gp85基因，构建了转移栽体pFast Bacl-IM gp85，并利用Bac-to-Bac表达系统获得了重组杆状病毒rBac-IMC gp85。转染Sf9细胞后的表达研究表明，重组杆状病毒可高效表达IMC10200的gp85基因，表达产物具有病毒的抗原特异性，与ALV-J单抗JE9有强的间接免疫荧光反应。蛋白质印迹法分析表明，表达产物的分子质量约54ku。     

安徽省五华鸡J亚群禽白血病病毒gp85基因分子序列特征分析

为进一步了解J亚群禽白血病病毒(avian leukosis virus subgroup J,ALV-J)gp85基因的结构、功能及其遗传变异趋势,采用PCR方法克隆了安徽省地方品种五华鸡ALV-J gp85基因序列ALV-J-WH,并将该序列与GenBank数据库中登录的15个gp85基因序列进行了比对分析。结果显示,ALV-J-WH与所比对的氨基酸序列同源性介于85.9%~96.2%之间,与其同源性最高的是来自于国内ALV-J毒株的JN378888基因序列,进化树也证实两者亲缘关系较近;此外,相对其他ALV-J gp85氨基酸序列,ALV-J-WH在223位氨基酸后有10个氨基酸的缺失;对所有全长序列分析结果表明,共有71个可变氨基酸位点,10个高度变异位点,尤其是hr1和hr2区域分布较多。结果表明,ALV-J-WH与国内部分ALV-J毒株分离gp85基因来自共同的原始病毒,但其具有独特的序列特征;ALV-J gp85基因高度易变,部分高频率突变的氨基酸位点可能是ALV-J在抗体免疫选择压下的作用位点。     

我国2000～2001年J亚群禽白血病病毒分离株gp85基因的序列比较

以相当于J亚群禽白血病病毒（ALV-J）原型株HPRS-103基因组碱基#5394-#5416及#7811-#7794的1对引物对PCR，在2000-2001年从山东，河南和宁夏分离的8株ALV-J中，有6株可以扩增出含gp85基因的2.2kb左右的特异性片段，对其中5株的扩增片段做了序列分析，结果表明，这5个毒株的囊膜糖蛋白gp85与原型株hprs-103有93.4%-96.8%的同源性，与我国最早的分离株SD99024有93.7%-98.7%的同源性，它们相互之间的同源性为91.2%-98.7%，由此说明，我国AVL-J的gp85基因正在不断发生变异。     

J亚群禽白血病病毒gp85基因的克隆与表达

构建J亚群禽白血病病毒gp85基因的原核表达载体,并在大肠埃希菌中获得表达。根据原核表达载体pET30的酶切图谱设计引物,以重组质粒pBS-T-env为模板,扩增gp85基因。将此段基因克隆到表达载体pET30上,转化大肠埃希菌BL21,用IPTG诱导表达,经SDS-PAGE分析,表达出约为70ku的融合蛋白。获得了gp85基因的表达产物,为研制ALV-J的特异性抗血清及国内ALV-J病毒分子诊断试剂盒奠定了基础。     

J亚群禽白血病病毒安徽分离株的鉴定及其gp85基因序列分析

从安徽省的黄羽肉鸡和罗曼蛋鸡中各分离鉴定出1株J亚群禽白血病病毒,克隆获得了2条相应的gp85基因序列,并与参考毒株进行序列比对。结果表明,两分离毒株与J亚群参考毒株同源性为82.1%~99.4%,分离毒株之间同源性为85.4%。其中肉鸡分离毒株与J亚群原型毒株HPRS-103同源性为97.1%,与J亚群国内毒株SD09TA04、SDYC02J同源性均为99.4%;蛋鸡分离毒株与HPRS-103的同源性为89.0%,与SD09TA04和SDYC02J同源性仅为88.6%。两分离毒株的gp85氨基酸序列出现突变和缺失,在高变区hr1、hr2变异明显。进化分析进一步表明,2个分离毒株亲缘关系较远,可能来源于不同的原始病毒株。     

J亚群禽白血病病毒gp85基因在重组杆状病毒中的表达及鉴定

为获得J亚群禽白血病病毒(ALV-J)的gp85蛋白,将ALV-J的gp85基因克隆至pFastBac-HTA供体质粒,将其转入DH10BacTM大肠杆菌感受态细胞,使gp85基因整合到Bacmid穿梭载体中,构建重组穿梭载体Bacmid-gp85。通过脂质体介导,将重组穿梭载体Bacmid-gp85转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒rBacgp85。Western-blot和间接免疫荧光试验(IFA)鉴定结果表明ALV-J gp85蛋白在Sf9昆虫细胞中得到正确表达,表达的重组gp85蛋白分子量约为38 ku。ALV-J gp85重组蛋白在Sf9细胞中的正确表达为其功能研究和应用提供了良好的基础。     

五华鸡J亚群白血病病毒env部分基因的克隆和序列分析

本试验通过PCR技术获得了安徽省地方品种五华鸡禽白血病病毒J亚群(avian leukosis virus subgroup J,ALV-J)env部分基因序列ALV-J-env1,并将该序列与GenBank数据库中登录的8条env基因相应序列进行了比对分析。结果表明,五华鸡已经感染了J亚群禽白血病,且部分鸡个体已经发病。通过分析可见,ALV-J-env1与所比较的基因序列同源性介于94.2%~96.6%之间,说明不同毒株之间的env基因有一定变异。但与ALV-J-env1同源性最高的是来自于中国ALV-J毒株的HQ425636和HM235665基因序列,且在进化树中聚集为一组,暗示它们之间亲缘关系较近,由共同的毒株进化而来。与ALV-J-env1同源性最低的是来源于马来西亚毒株的AY312965基因序列,遗传进化分析也进一步证实,两者之间亲缘关系较远。     

J、K亚群禽白血病病毒的分离和囊膜蛋白(gp85)基因序列分析

为了解现阶段我国禽白血病病毒(ALV)的流行特征和演化趋势,本试验于2021—2022年从国内某鸡场采集蛋清ALV衣壳蛋白(p27)抗原阳性的鸡血浆,接种鸡胚成纤维细胞(DF-1)分离病毒并进行亚群鉴定;采用聚合酶链式反应(PCR)技术扩增分离株的囊膜蛋白(gp85)基因片段,并对其进行测序,将基因序列与ALV不同亚群毒株进行比对和遗传进化分析;选取氨基酸变化差异较大的分离毒株进行间接免疫荧光鉴定。结果显示,共分离到7株ALV毒株(3株J亚群,4株K亚群),ALV-J分离毒株CAU4932、CAU4860和CAU2259的gp85基因片段长度为918 bp,编码306个氨基酸,分离毒株之间gp85基因核苷酸同源性为90.5%～95.2%,gp85蛋白氨基酸同源性为95.1%～99.3%;ALV-K分离毒株CAU7049、CAU5006、CAU7176和CAU7168的gp85基因片段长度为1 008 bp,编码336个氨基酸,分离毒株之间gp85基因核苷酸同源性为89.4%～92.3%,gp85蛋白氨基酸同源性为94.0%～99.7%。gp85蛋白氨基酸序列同源性比对发现,分离株gp8...     

五华鸡J亚群白血病病毒env部分基因的和序列分析

本试验通过PCR技术获得了安徽省地方品种五华鸡禽白血病病毒J亚群(avian leukosis virus subgroup J,ALV-J)env部分基因序列AL V-J-env1,并将该序列与GenBank数据库中登录的8条env基因相应序列进行了比对分析.结果表明,五华鸡已经感染了J亚群禽白血病,且部分鸡个体已经发病.通过分析可见,AL V-J-env1与所比较的基因序列同源性介于94.2％～96.6％之间,说明不同毒株之间的env基因有一定变异.但与ALV J-env1同源性最高的是来自于中国ALV-J毒株的HQ425636和HM235665基因序列,且在进化树中聚集为一组,暗示它们之间亲缘关系较近,由共同的毒株进化而来.与ALV-J-env1同源性最低的是来源于马来西亚毒株的AY312965基因序列,遗传进化分析也进一步证实,两者之间亲缘关系较远.     

J亚群禽白血病病毒四川株SCMS1的分离及其囊膜基因序列分析

为研究四川首例分离株SCMS1株J亚群禽白血病病毒(ALV-J)囊膜(env)基因是否产生新的变异,本实验通过将病毒接种鸡胚成纤维细胞、RT-PCR及PCR检测技术,对包括env基因和部分3'UTR在内的片段进行PCR扩增、克隆和序列测定.结果发现该病毒gp85基因出现6个碱基的缺失,与HPRS-103原型株6995位～7242位对应的核酸序列也发生248个碱基的缺失,包括整个rTM区域.这些碱基的缺失在病毒致病性变化中可能具有潜在的意义.     

J亚群禽白血病病毒gp85单因子血清的制备

J亚群禽白血病病毒(ALV-J)在中国普遍存在,严重危害养禽业,暂时尚无有效预防、治疗禽白血病的措施,只能通过净化控制。因此,研究一种低成本、易推广的检测方法对防控此病非常重要。用DF-1细胞接种病毒,以细胞基因组为模板,通过巢式PCR方法扩增出941 bp的含酶切位点的ALV-J特异性基因gp85基因序列,连接于pET32a(+)载体上,实现gp85蛋白在宿主菌BL21的表达,以切胶回收方式纯化蛋白,成功获得约52 ku的重组融合蛋白,免疫新西兰兔,制备gp85单因子抗血清,Dot-ELISA检测抗体效价。结果显示,纯化所得蛋白质具有良好抗原性,制备的抗血清效价高于1.024×10⁵。本试验通过较简便、低耗的方法获得高效单因子血清,为抗血清的制备提供参考,为ALV-J gp85蛋白的研究、ALV-J特异性检测方法的研制打下基础,对ALV-J的净化有重要意义。     

血管瘤相关J亚群禽白血病病毒ZH-08株的分离与全基因组序列测定

本研究从临床表现为典型血管瘤型禽白血病病例的广东某肉种鸡场的病鸡中,分离到1株J亚群禽白血病病毒(ALV-J),命名为ZH-08。利用ELISA抗原检测、PCR和间接免疫荧光试验对分离株进行鉴定,结果都呈阳性。依据ALV-J原型株HPRS-103前病毒全基因组序列设计并合成3对引物,采用分段扩增的方法完成了分离株的全基因组序列测定。结果显示该分离株基因组序列全长7 597 bp,与已公开的全基因组序列大小比较略有差异,但符合典型的复制完全型反转录病毒的基因组结构,基因序列中不含已知致癌基因。将该分离株的亚群特异性gp85基因序列与国内外各参考株相应序列进行相似性比较,发现ZH-08与YZ9901株相似性最高(93.7%)。基于gp85核苷酸序列的系统进化分析表明:ZH-08株与SD07LK1株的亲缘关系最近。本研究为该毒株的生物学特性以及致病机制研究奠定了基础。     

黄羽肉鸡J亚群禽白血病病毒分离鉴定与全基因组序列分析

为了解J亚群禽白血病在黄羽肉鸡中的流行状况,采用病料研磨液接种DF-1细胞、ELISA p27抗原检测、PCR扩增等方法,从广东某鸡场送检疑似禽白血病的黄羽肉鸡病料中分离鉴定出1株J亚群禽白血病病毒,命名为GDLZ0715。为进一步了解该病毒分子学特性,对其进行全基因组测序,并与其他ALV-J毒株进行比较。结果表明,GDLZ0715分离株整个基因组中gag、pol、env基因和LTR相对保守,与各参考ALV-J毒株序列同源性分别达93.5%~95.9%、96.8%~97.3%、89.6%~94.6%和90.8%~95.1%;3′UTR变异较大,与各ALV-J参考毒株序列同源性仅为80.5%~93.4%,其中rTM和E元件大量碱基缺失;进一步分析表明3′UTR中rTM区和E元件大量碱基缺失正成为我国肉鸡ALV-J毒株的变异趋势。     

J亚群禽白血病病毒双抗体夹心ELISA检测方法的建立

本研究利用J亚群禽白血病病毒(subgroup J avian leukosis virus,ALV-J)gp85单因子血清纯化后的抗体成功建立了检测ALV-J抗原的双抗体夹心ELISA方法(DAS-ELISA)。结果表明,该方法具有良好的特异性、重复性和稳定性,对ALV-J抗原的最小检出量为0.165 μg/mL。用该法对48份临床血浆样品进行检测,结果与PCR方法的符合率达到85.2%。     

从J亚群禽白血病肿瘤中检测出禽网状内皮组织增生症病毒

将表现为典型 J亚群禽白血病肿瘤的病料分别接种于鸡胚成纤维细胞和 DF1细胞 ,采用间接荧光抗体试验(IFA)和 PCR方法 ,从这些肿瘤病料中分离和鉴定出 8株 J亚群禽白血病病毒 (AL V- J)。对证明感染了 AL V- J的细胞继续培养 ,并用禽网状内皮组织增生症病毒 (REV)的特异性单抗及引物做 IFA和 PCR,在 8株 AL V- J中 ,有 3株AL V- J的感染细胞中同时有 REV感染。由此表明 ,发生肿瘤的肉鸡中 ,AL V- J和 REV的共感染已相当普遍。将这 3株 REV- SD0 0 0 3、SD0 0 0 4和 SD0 10 2的 3′- L TR用 PCR扩增、克隆和序列比较 ,发现分离的 SD0 0 0 3、SD0 0 0 4和SD0 10 2与国内的另外 2株 REV- SD990 1和 HA990 1的同源性为 96 .7%和 96 .1% ;而与另 1株 REV参考株鸭脾坏死性病毒 (SNV)的同源性高达 99%。     

表现腺胃炎的蛋用型鸡J亚群-白血病病毒的分离与鉴定

从表现腺胃炎的尼克珊瑚粉商品代蛋鸡中分离到J亚群-白血病病毒(ALV-J)。将病料或鸡白细胞接种于CEF,培养12 d,分别采用单克隆抗体间接免疫荧光试验检测,结果10只鸡中有9只鸡分离到ALV-J,其中有4只鸡还存在与禽网状内皮增生病病毒(REV)的共感染。通过PCR扩增gp85基因,与已发表的20株ALV-J进行同源性比较。结果表明,与来自白羽肉鸡的HPRS103的同源性为97.8%,而与来自蛋用型鸡的SD07LK1株的同源性为93.0%。本研究发现,在某些仅仅发生腺胃炎的鸡也可能普遍存在ALV-J感染,再次显示了腺胃炎病料中病毒感染的多样性。ALV-J可能成为致腺胃炎的病原之一,但其致病作用有待进一步研究。     

禽白血病病毒J亚群自然感染商品蛋鸡致瘤性新特征

2009年8月,山东省邹城市某海兰褐蛋鸡群,160日龄发病,死亡率为7％.患鸡经大体剖检、病理组织学、PCR和免疫组织化学等检测,确诊为禽白血病病毒J亚群(ALV-J)感染.病理组织学检测发现,病鸡单独患血管瘤,或髓细胞瘤和纤维肉瘤多发性出现,由ALV-J自然感染引起同一鸡体出现髓细胞瘤和纤维肉瘤尚属国内外首次报道.肝脏研磨接种DF-1细胞培养7d后传3代,细胞无病变,ELISA检测感染细胞上清ALV p27抗原阳性,进一步确诊此鸡群为ALV感染.对病变严重的鸡进行病毒分离及ALV-J gp85基因同源性比较显示与原型株HPRS-103的同源性最高,达94.1％.本研究丰富了ALV-J感染的临床诊断依据,并为ALV-J在我国蛋鸡群中多潜能致瘤机制的研究提供了科学基础.     

禽白血病病毒J亚群(ALV-J)的攻毒试验

将禽白血病病毒 J亚群 (AL V- J)内蒙株 NM876 1和 NM9996人工接种于 1日龄爱维茵肉种鸡 ,通过眼观、病理组织学检查观察了攻毒鸡的病理学特征 ;通过 PCR和 EL ISA技术检测了病毒感染率、抗体变化规律以及病毒和抗体的相关性。结果显示 ,攻毒鸡从第 3周开始即可检出病毒 ,NM876 1株和 NM9996株病毒感染率分别为 71.4 %和6 4 .3% ;从第 5周开始 ,出现较明显的病理学变化 ,病变特征以骨髓、肝脏、心脏、脾、卵巢等组织内髓细胞增生为主 ,而法氏囊、脑、坐骨神经无变化 ;攻毒鸡抗体消长变化有一定的规律 ,一般在 7～ 8周龄和 18～ 2 0周龄时分别出现 1次高峰 ,而在 4～ 6周龄、10周龄和 2 3周龄分别出现 1次低谷 ,提示鸡场进行 EL ISA检测时要避开这一时期 ;攻毒鸡产生耐受性病毒血症 ,即病毒阳性而抗体阴性 (V A- )的比例较高 (7/14 ,9/14 )。通过以上的研究证明 ,AL V- J内蒙株疾病模型复制成功 ,NM876 1、NM9996可作为原型株进行相关研究     

J亚群白血病的病理学观察及基因分析

内蒙古某肉种鸡场40周龄种鸡发生肿瘤性疾病，死淘率15％；经病理组织学检查，增生的肿瘤为典型的髓细胞瘤，因此怀疑此病是J亚群白血病。取病鸡肝电镜观察，在肝细胞胞浆膜下见有圆形的类病毒粒子存在；将肝病料处理后接种于鸡胚成纤维细胞(CEF)，经电镜观察，可见正出芽的病毒粒子。为进一步确诊，以ALV-J原型株HPRS-103囊膜gp85基因为基础设计特异性引物，以感染的CEF基因组DNA为模板，体外扩增(PCR)gp85基因，结果获得了924bp的相应片段。将PCR产物进行分子克隆和序列测定，结果表明，内蒙古地区ALV-Jgp85蛋白的推测氨基酸与ALV-J原型株HPRS-103、山东SD9901株、美国ADOL-R5-4株及内源性病毒EAV-HP的gp85蛋白的氨基酸同源性分别为97.40％、95.13％、86.69％和85.06％，其中与HPRS-103的同源性最高，与EAV-HP同源性最低。因此可以确定本研究所克隆的基因为ALV-Jgp85基因，暂命名为ALV-J-NM8761。