用磁珠富集法制备史氏鲟的微卫星分子标记

采用生物素-磁珠富集法与放射性同位素杂交法相结合的方式,研究了史氏鲟Acipenser schrencki基因组的微卫星资源。结果表明:在得到的1 400多个细菌中,有300多个阳性克隆,将其中96个进行测序,在这些序列中共有115个微卫星核心序列,含99个重复次数大于10次的微卫星核心序列。其中完美型标记40个,占40.4%;非完美型标记52个,占52.5%;混合型标记共7个,占7.1%。随机选取侧翼序列较长的50个序列,依据引物设计原理设计引物50对,经3次PCR筛选,有28对引物可得到稳定的特异性扩增;同时利用史氏鲟的6个个体检验了这些位点的多态性,并统计了等位基因数,发现有22对等位基因具有良好的多态性。     

用磁珠富集法制备史氏鲟的微卫星分子标记

采用生物素-磁珠富集法与放射性同位素杂交法相结合的方式,研究了史氏鲟Acipenser schrencki基因组的微卫星资源。结果表明:在得到的1 400多个细菌中,有300多个阳性克隆,将其中96个进行测序,在这些序列中共有115个微卫星核心序列,含99个重复次数大于10次的微卫星核心序列。其中完美型标记40个,占40.4%;非完美型标记52个,占52.5%;混合型标记共7个,占7.1%。随机选取侧翼序列较长的50个序列,依据引物设计原理设计引物50对,经3次PCR筛选,有28对引物可得到稳定的特异性扩增;同时利用史氏鲟的6个个体检验了这些位点的多态性,并统计了等位基因数,发现有22对等位基因具有良好的多态性。     

磁珠富集法分离柿微卫星标记

【目的】分离柿属植物的微卫星标记,为柿种质资源的分类、进化等遗传研究奠定基础。【方法】提取磨盘柿(Diospyros kaki)基因组DNA后,用EcoRⅠ和MesⅠ2种内切酶酶切并连接接头,再用接头特异引物进行PCR扩增。扩增产物与生物素标记的(GA)15和(AC)15探针杂交,杂交复合物用链亲和素包裹磁珠进行结合,得到单链DNA目标片段,经PCR扩增,连接pGEM-T载体,转化入感受态大肠杆菌,得到微卫星富集小插入片段DNA文库。用Colony-PCR法筛选阳性克隆,进行测序分析。【结果】测序96个克隆,54个含微卫星序列,24个为有效微卫星序列,其中完美型(perfect)9个,占37.5%;非完美型(imperfect)7个,占29.2%;混合型(compound)8个,占33.3%(。GA)n重复最为常见。21条含微卫星序列已登录GenBank(Accession Number:EF567396~EF567416)。成功设计21对引物,经初步筛选,14对表现出多态性。【结论】试验方法分离柿基因组微卫星简便有效,得到的多态性引物可用于柿种质资源的遗传研究。     

利用磁珠富集法开发花榈木微卫星引物

将花榈木(Ormosia henryiPrain)基因组DNA用MseⅠ酶切后,连接相应的接头,PCR扩增后回收500~1000bp片段,与用生物素标记的微卫星探针(GA)12,(AAG)8杂交后,运用磁珠富集含有微卫星序列的DNA片段。获得的序列经PCR扩增,连接载体pMD19-T,构建富含微卫星序列的小片段插入文库;用PCR法筛选文库,获得78个阳性克隆,经测序分析得到24个微卫星序列,成功设计出9对引物。     

用磁珠富集法快速制备银鲫微卫星标记

将磁珠富集法和用γ-32P标记的放射性探针法相结合,快速制备银鲫Carassius auratus gibelio微卫星。用限制性内切酶MboI对银鲫完整基因组DNA酶切,用不同蔗糖浓度梯度离心收集400~900 bp大小的片段,连接Brown接头,构建银鲫全基因组文库。用生物素标记的(CA)16寡核苷酸探针进行筛选,磁珠富集含有微卫星的DNA单链序列;对DNA模板进行PCR扩增,连接pMD18-T载体,转入用CaCl2制备的感受态大肠杆菌Escherichia coliDH5α中,得到微卫星序列文库;经用同位素γ-32P标记的探针(CA)16二次筛选,获得235个阳性克隆,对其测序,得224个含微卫星序列,完美型、非完美型、复合型序列分别占总数的52.8%、28.7%、18.5%。除探针中使用的(CA/GT)n重复单元外,还观察到(GA/CT)n、(ACTC)4的重复序列。设计163对引物,选择合成30对引物,经聚丙烯酰胺凝胶筛选,9对可以获得清晰条带,其中3对为单态,6对为多态。     

用磁珠富集法快速制备银鲫微卫星标记

将磁珠富集法和用γ-32P标记的放射性探针法相结合,快速制备银鲫Carassius auratus gibelio微卫星。用限制性内切酶MboI对银鲫完整基因组DNA酶切,用不同蔗糖浓度梯度离心收集400⁹00 bp大小的片段,连接Brown接头,构建银鲫全基因组文库。用生物素标记的(CA)16寡核苷酸探针进行筛选,磁珠富集含有微卫星的DNA单链序列;对DNA模板进行PCR扩增,连接pMD18-T载体,转入用CaCl2制备的感受态大肠杆菌Escherichia coliDH5α中,得到微卫星序列文库;经用同位素γ-32P标记的探针(CA)16二次筛选,获得235个阳性克隆,对其测序,得224个含微卫星序列,完美型、非完美型、复合型序列分别占总数的52.8%、28.7%、18.5%。除探针中使用的(CA/GT)n重复单元外,还观察到(GA/CT)n、(ACTC)4的重复序列。设计163对引物,选择合成30对引物,经聚丙烯酰胺凝胶筛选,9对可以获得清晰条带,其中3对为单态,6对为多态。     

长臀鮠肌肉脂肪酸组成分析

为了解长臀鮠的营养价值,对其肌肉脂肪酸的组成成分进行了分析.结果表明:长臀鮠肌肉中含有11种脂肪酸,其中,饱和脂肪酸4种,不饱和脂肪酸7种.饱和脂肪酸的质量分数占脂肪酸总质量分数的33.96%,不饱和脂肪酸的质量分数占脂肪酸总质量分数的66.03%,其中,单不饱和脂肪酸的质量分数占脂肪酸总质量分数的50.49%,多不饱和脂肪酸的质量分数占脂肪酸总质量分数的15.54%.长臀鮠肌肉脂肪酸主要由C18:1、C16:0和C18:2n-6脂肪酸组成,这3种脂肪酸质量分数总和占脂肪酸总质量分数的80.44%,C18和C16脂肪酸含量最高.长臀鮠肌肉脂肪酸种类组成与其他几种鱼类有明显差异.     

海南长臀鮠人工驯养技术研究

为了更好的保护海南长臀鮠这一海南淡水土著鱼类,对其进行了人工驯养技术研究。结果表明,在池塘和网箱中,人工饲养条件下,野生的海南长臀鮠通过驯养可以主动摄食人工配合饲料,生长速度较快。     

温泉水驯养长臀鮠技术

长臀鮠（Cranoglanis bouderius）隶属于长臀鮠科（Cranoglanididae）长臀鮠属（Cranoglanis）鱼类,是珠江水系特有名贵品种,具有较高的营养价值,深受消费者喜爱,但因过度捕捞导致自然资源量减少。为长臀鮠的规模化养殖提供技术参考,从池塘条件、池塘清整与消毒、鱼种投放、饲养管理、技术应用效果等方面介绍了温泉水驯养长臀鮠技术。     

海南长臀鮠人工繁殖与胚胎发育的研究

使用LHRH—A2＋DOM＋PG混合催产剂对从海南引进经池塘驯化养殖5冬龄的海南长臀鲍进行催产,并用日产80i光学显微镜观察胚胎发育过程。取得平均催产率88．9％,平均受精率82．3％,平均孵化率68．7％的效果。成熟的卵子为圆球形、淡黄色、粘性卵。在水温24．8～27．0℃条件下,其受精卵经细胞期、囊胚期、原肠期、体节出现期、器官出现期和出膜前期等多个发育时期孵化出膜,所需时间为82h 15min。拍摄了胚胎发育照片25幅。     

长臀鮠含肉率及肌肉营养成分分析

为长臀鮠种质资源的开发利用提供依据,对长臀鮠含肉率及肌肉营养成分进行了测定.结果表明:长臀鮠含肉率为69.92%;肌肉中蛋白质、脂肪和灰分含量分别为17.89%、5.20%、1.10%;肌肉中17种常见氨基酸(除色氨酸)总含量(占肌肉干重)为79.18%.其中,必需氨基酸含量为33.04%,占氨基酸总量的46.14%.必需氨基酸与非必需氨基酸含量的比值为0.72.鲜味氨基酸含量为29.59%,占氨基酸总量的37.37%.必需氨基酸指数(WH0/FAO标准为参照)为86.60.缬氨酸为第1限制性氨基酸,蛋氨酸+胱氨酸为第2限制性氨基酸.     

海南长臀鮠人工繁殖与胚胎发育的研究

使用LHRH—A2＋DOM＋PG混合催产剂对从海南引进经池塘驯化养殖5冬龄的海南长臀鲍进行催产,并用日产80i光学显微镜观察胚胎发育过程。取得平均催产率88．9％,平均受精率82．3％,平均孵化率68．7％的效果。成熟的卵子为圆球形、淡黄色、粘性卵。在水温24．8～27．0℃条件下,其受精卵经细胞期、囊胚期、原肠期、体节出现期、器官出现期和出膜前期等多个发育时期孵化出膜,所需时间为82h 15min。拍摄了胚胎发育照片25幅。     

松涛水库长臀鮠遗传多样性研究

在测定的海南松涛水库南丰、番加、白沙群体44条长臀线粒体DNA控制区全序列961 bp中,T、C、A、G碱基含量分别为31.2％、21.7％、34.0％、13.1％;共出现26个变异位点,其中多态信息位点18个,简约信息位点14个;共检测到11个单倍型,单倍型多样性为0.8594±0.0169,核昔酸多样性为0.00484±0.00313,呈现出较高的单倍型多样性与较为贫乏的核苷酸多样性.其中白沙群体的核苷酸多样性最高(0.00517±0.001847),番加群体的最低(0.00482±0.004522).Tajima's D(0.36899,P＞0.10)和FuFs (0.09041,P＞0.10)中性检验以及核苷酸不配对分析均表明长臀并未经历过大规模的种群扩张.F分析(-0.00324～-0.01878,P＜0.05)与分子方差分析(-3.87％,P＜0.05)显示群体间无明显遗传分化,表明3个群体隶属于同一种群.就松涛水库长臀而言,建议优先保护白沙群体.     

草鱼基因组中微卫星分子标记的制备及筛选

采用新型的生物素-磁珠吸附微卫星富集法与传统的放射性同位素杂交法相结合的方式,研究了草鱼（Ctenopharyngodon idella）基因组中存在的微卫星资源.结果,从1 000个细菌中,挑出90个阳性克隆,把其中45个进行测序分析,在这些序列中共含有68个微卫星核心序列,有55个含有重复次数大于5次的微卫星核心序列.其中,单一型标记49个,占72%,包括CA重复单元共22个,GT重复单元共18个,其他重复单元为9个;在72%的单一型标记中,完美单一型微卫星标记为44个,占65%.另外,混合型标记共19个,13为完美混合型;在所有微卫星标记中,CA重复类型最普遍,依次为GT、GA等.在68个微卫星标记中,有15个依据引物设计原理设计了引物.     

草鱼基因组中微卫星分子标记的制备及筛选

采用新型的生物素-磁珠吸附微卫星富集法与传统的放射性同位素杂交法相结合的方式,研究了草鱼（Ctenopharyngodon idella）基因组中存在的微卫星资源.结果,从1 000个细菌中,挑出90个阳性克隆,把其中45个进行测序分析,在这些序列中共含有68个微卫星核心序列,有55个含有重复次数大于5次的微卫星核心序列.其中,单一型标记49个,占72%,包括CA重复单元共22个,GT重复单元共18个,其他重复单元为9个;在72%的单一型标记中,完美单一型微卫星标记为44个,占65%.另外,混合型标记共19个,13为完美混合型;在所有微卫星标记中,CA重复类型最普遍,依次为GT、GA等.在68个微卫星标记中,有15个依据引物设计原理设计了引物.     

中华绒螯蟹部分基因组文库构建和微卫星位点的筛选

利用磁珠富集和放射性杂交相结合构建了中华绒螯蟹基因组微卫星文库.并利用生物素标记的(GA)12探针进行微卫星片段的富集.将得到的片段与pGEM-T载体连接后转入DHSα大肠杆菌中,然后利用γ-32P同位素标记的(GA)12:探针进行第二次筛选.结果共获得微卫星基因组文库1 500个菌,杂交前菌落PCR检测阳性克隆率为62.5%;杂交后得到的阳性克隆为447个,占29.8%.经测序,有248个克隆含有重复次数大于5次的微卫星序列.在得到的微卫星序列中,重复单元除GA/CT外,还观察到三碱基、四碱基重复单元.根据侧翼序列没计引物164对,选择合成50对,通过优化PCR反应条件,结果有21对引物可扩增出清晰可重复的目的条带,15对具有多态性.本研究对中华绒螯蟹基因组资源的开发利用提供了相关资料.     

基于线粒体控制区Dloop序列的长臀(鮠)种群遗传结构分析

[目的]了解长臀(鱼危)Cranoglanis3个种群的野生资源状况,并对3个种群的物种有效性进行分析.[方法]采用线粒体控制区Dloop基因序列测定技术,分析了珠江水系、海南水系和越南红河水系长臀(鱼危)种群的群体遗传结构及其变异.[结果]在检测的84个个体中共得到43个单倍型,呈现出较高的单倍型多样性与较为贫乏的核苷酸多样性,其中海南长臀(鱼危)C.multiradiatus群体的单倍型多样性(Hd =0.871)和核苷酸多样性(Pi =0.006 4)最低;Tajima's D中性检验以及核苷酸不配对分析均表明,3个长臀(鱼危)群体趋于稳定,未经历过大规模的种群扩张.Fst分析发现,海南长臀(鱼危)同珠江长臀(鱼危)C.bouderius、红河长臀(鱼危)C.henrici产生了一定的遗传分化,而珠江和红河群体未发现明显遗传分化,从遗传距离来看,珠江和红河长臀(鱼危)净遗传距离为0.000.[结论]长臀(鱼危)野生资源较为贫乏,且海南群体最为严重;认为应将珠江长臀(鱼危)和红河长臀(鱼危)归为同一亚种长臀(鱼危)C.bouderius,而海南长臀(鱼危)作为长臀(鱼危)的另一个亚种.