利用RecTE基因重组体系构建hrpS基因缺失型冠菌素工程菌株

冠菌素 (coronatine, COR) 是一种新型植物生长调节剂,能有效调控植物生长,增强植物抗逆性。目前冠菌素主要通过微生物菌株发酵的方式获得,而菌株自身产率低是限制冠菌素应用的最大问题。为了开发冠菌素高产菌株,本研究以模式菌株丁香假单胞菌番茄致病变种Pseudomonas syingae pv. tomato DC3000为出发菌株,利用RecTE基因重组体系对菌株Pst DC3000中hrpS基因进行了敲除,并成功筛选到基因重组菌株H1-20。对H1-20菌株进行发酵培养,结果表明,H1-20菌株中冠菌素的产量达到了22.67 mg/L,是出发菌株冠菌素产量的2.36倍。本研究通过RecTE基因重组体系,成功地构建了冠菌素工程菌株H1-20,为产冠菌素菌株提供了更多选择,为后续进一步开展冠菌素高产菌株改造工作奠定了基础。     

丁香假单胞菌发酵液中的冠菌素含量测定方法及其应用

为了辅助提高工程菌种改良的效率,建立了一种简单、快速、高效的分散液-液微萃取-高效液相色谱检测丁香假单胞菌发酵液中冠菌素的分析方法。优化了蛋白沉淀法、萃取剂的种类和体积、分散剂的种类和体积、萃取时间和离心强度等对萃取率的影响。确定最优萃取条件为:以2.0 mL丙酮作为分散剂,以400 μL氯苯为萃取剂,萃取5 min,在5 000 r/min下离心5 min。高效液相色谱的检测条件为:流动相为V (甲醇) : V (0.5%乙酸水溶液) = 70 : 30,等梯度洗脱,流速1.0 mL/min,柱温30 ℃,检测波长220 nm。在3.2~100 mg/L范围内,冠菌素的峰面积与其质量浓度间呈良好的线性关系,相关系数 (r) 为0.999 8。方法的检出限为2.1 mg/L,定量限为6.5 mg/L。在6.5、25和100 mg/L添加水平下,冠菌素在丁香假单胞菌发酵液中的回收率在95%~98%之间,相对标准偏差 (n = 5) 在2.7%~5.1%之间。该方法可用于丁香假单胞菌发酵液中冠菌素含量的测定。     

氨基酸补料对伊枯草菌素A发酵的影响

对枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis ZK8)进行4种不同工艺(分批发酵和3种氨基酸浓度的补料分批发酵)的发酵,测定并分析了发酵过程中各时间点样品中菌量、伊枯草菌素A (iturin A)的效价、还原糖、总氮及16种游离氨基酸的含量及变化趋势。结果表明,在工艺2 (补料浓度分别为天冬氨酸55 mg/L,谷氨酸12 mg/L,脯氨酸6 mg/L)发酵条件下,枯草芽胞杆菌ZK8菌量最高,达2.163×1010个/mL,比分批发酵(对照组)提高9.5%;在工艺1(补料浓度分别为天冬氨酸50 mg/L,谷氨酸9 mg/L,脯氨酸5 mg/L)发酵条件下,iturin A效价最高,达20 101.1 U,比对照提高了93.94%。     

分批发酵和补料分批发酵生产木霉素的研究

为了提高木霉素的发酵产量,以哈茨木霉Trichoderma harzianum Rifai菌株LC2为生产菌,在10L发酵罐中对分批发酵和补料分批发酵工艺进行了研究。结果表明,在分批发酵工艺中,在8%接种量、4L/min通气量和200r/min搅拌转速条件下,发酵72h时木霉素产量达到最大值149.6mg/L。在间歇补料分批发酵工艺中,分6次补料,使培养基中各成分的终浓度与分批发酵相同,木霉素的发酵产量提高到182mg/L,比分批发酵提高21.7%。     

豆薯细菌性角斑病的病原鉴定

 在安徽滁州的豆薯叶片上发现一种由细菌侵染引起角斑症状的病害,从角斑上分离到具有致病性的非荧光的杆状细菌,菌株的表型特征、细菌学特征、LOPAT试验和生理生化试验表明该细菌与丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae van Hall)相似,BIOLOG系统鉴定结果与丁香假单胞菌豌豆致病变种(P.syringae pv.pisi)相近,接种试验表明豆薯菌株能侵染大豆、菜豆和眉豆,但对豌豆的致病性差;在豇豆、绿豆和蚕豆上不表现症状。结果表明豆薯细菌性角斑病是一种新病害,病原菌属于丁香假单胞菌群的一个新的致病变种,命名为P.syringae pv.pachyrhizus nov.     

广东南瓜细菌性叶枯病及其病原鉴定

 在广东省雷州市发生一种南瓜(Cucurbita moschata)叶枯病,病株叶片边缘开始出现水渍状病斑,逐步发展成大病斑,后期病斑焦枯;在叶片上也可形成近圆形水渍状病斑,伴有黄色晕圈,后期病斑联合形成不规则大枯斑;叶柄和匍匐茎被侵染后呈水渍状腐烂。从病斑上分离到一种细菌,在KB培养基上,菌落为椭圆形,乳白色,半透明,边缘参差不齐,紫外灯照射下产生荧光反应。致病性测定结果表明,该病原细菌可侵染6个南瓜品种引起与田间症状相同的叶枯病。生理生化试验结果表明,该病原细菌与丁香假单胞丁香致病变种(Pseudomonas syringae pv. syringae)的特性一致。应用假单胞菌属特异引物Ps-for/Ps-rev和丁香假单胞丁香致病变种组群特异性引物Group III-F/Group III-R,可从该病原细菌中扩增出预期大小分别为1 018 bp和750 bp的目的片段。应用丁香致病变种syrB基因特异性引物B1/B2,可从该病原菌中扩增出预期大小为750 bp的丁香霉素基因片段。基于16S rDNA与gyrB基因序列系统进化分析均表明,南瓜叶枯病菌株与已报道的P. syringae pv. syringae菌株HS191(CP006256)亲缘关系最近,二者聚类在一起形成一个小分支。人工接种条件下,该病原细菌还可侵染西葫芦、丝瓜、茄子、番茄、菜豆、扁豆等植物。这些结果表明,引起广东省南瓜叶枯病的病原为丁香假单胞丁香致病变种(Pseudomonas syringae pv. syringae)。这是首次在中国发现丁香假单胞丁香致病变种引起南瓜叶枯病。     

应用PCR方法快速检测黄瓜细菌性角斑病菌

黄瓜细菌性角斑病是黄瓜上的一种重要细菌病害,其病原为丁香假单胞菌黄瓜致病变种(Pseudomonas syringae pv.lachrymans),目前未见到该病害特异性PCR检测方法的报道。通过分析丁香假单胞菌(P.syringae)不同致病变种glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase 1(gap1)基因序列设计得到一对Psl特异性PCR引物。利用该引物对丁香假单胞菌不同致病变种、假单胞菌属其他种及其他属的共46株菌株进行了PCR扩增,结果表明,所有不同来源的12株黄瓜细菌性角斑病菌均得到179bp的目标片段,而所有其他参试菌株均无扩增条带,PCR检测的灵敏度为7.5×103cfu/mL。利用该方法可从接种后发病的黄瓜叶片总DNA中检测到特异条带,而健康叶片无条带。该引物的PCR检测方法可直接用于植株总DNA的检测,无需进行病原菌的分离培养,快速简便,适用于进出境检验检疫及种苗健康检测等。     

软枣猕猴桃种质资源溃疡病抗性鉴定方法的建立与评价

以51份软枣猕猴桃Actinidia arguta种质资源为材料,以中华猕猴桃Actinidia chinensis Planch'红阳'、美味猕猴桃Actinidia chinensis var.deliciosa'徐香'为对照,利用丁香假单胞菌猕猴桃致病变种Pseudomonas syringae pv.actin...     

中国猕猴桃细菌性花腐病菌的鉴定

 从福建、湖南和湖北猕猴桃病花上分离到能引起花腐病的32个细菌菌株,经细菌学和BiologGN测试板测定,可以看出中国的猕猴桃细菌性花腐病菌与新西兰的猕猴桃花腐病菌、丁香假单胞菌丁香致病变种Pseudomonas syringae pv.syringae和绿黄假单胞菌P.viridiflava相似,与萨氏假单胞菌P.savastanoi和猕猴桃溃疡病菌P.syringae pv.actinidiae有更多的不同,但是DNA/DNA同源性测定结果却显示出中国的菌株可分为2个类型:第1个类型与新西兰猕猴桃花腐病菌和萨氏假单胞菌有很高的同源性,第2类型与绿黄假单胞菌有很高的同源性,说明中国菌株分别属于这2个种。第1类型来自于福建和湖北,第2类型来自于湖南。     

甜樱桃流胶病原菌的分子鉴定和致病性检测

 为明确甜樱桃流胶病的病原菌,采用普通细菌学方法从15个病样中分离获得10个代表性菌株,对病原菌的形态学特征、生理生化特性以及致病性进行了研究。利用PCR对菌株的16S-23S rDNA转录间隔区(ITS)序列进行扩增,扩增产物克隆测序,结果显示该菌株属于丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)。用MegAlign构建系统发育树,结果显示该菌株与丁香假单胞菌丁香致病变种(P. syringae pv. syringae)亲缘关系最近,两者最先聚在一起。分离菌株中均可检测到syrB基因。研究结果表明P. syringae pv. syringae为甜樱桃流胶病的病原菌。     

嗜线虫致病杆菌HB310菌株对东亚飞蝗的生物活性

通过生物测定比较了9种昆虫病原线虫共生菌对东亚飞蝗Locusta migratoria manilensis 4龄蝗蝻的杀虫活性,其中嗜线虫致病杆菌Xenorhabdus nematophila HB310菌株(以下简称Xn HB310)对4龄蝗蝻的活性最高;采用浸叶法进一步测定了Xn HB310菌液对不同虫态的东亚飞蝗的毒力。结果表明:在饲喂96 h 后,Xn HB310菌液对2龄蝗蝻、4龄蝗蝻和成虫的致死中浓度(LC50)分别为2.97×105、4.90×105和6.24×105 CFU/mL,致死中时间(LT50)分别为51.48、52.59和64.34 h。研究还发现该菌株对东亚飞蝗具有明显的拒食活性,处理48 h 后Xn HB310菌液对2龄蝗蝻、4龄蝗蝻和成虫的拒食中浓度(AFC50)分别为1.15×105、2.36×105和3.16×105 CFU/mL。通过点滴或剪除东亚飞蝗成虫感觉器官的方法,证实了Xn HB310菌液对东亚飞蝗产生拒食作用的器官是下颚须和下唇须,剪除下颚须和下唇须及两者均剪除的拒食率分别为37.36%、51.28%和100%。研究结果表明,嗜线虫致病杆菌Xn HB310菌液对东亚飞蝗的杀虫速度快且活性高,具有开发为防治东亚飞蝗杀虫剂的潜力。     

注射大肠杆菌后草地贪夜蛾高龄幼虫的免疫应激反应

为采用生物技术防控草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda的扩散为害,对草地贪夜蛾5龄和6龄幼虫注射浓度为1×109CFU/mL的大肠杆菌Escherichia coli菌液,并以注射等量磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution,PBS)和未做任何处理(CK)为对照,24 h后测定幼虫体重、集结数和酚氧化酶(phenoloxidase,PO)活性。结果显示,注射大肠杆菌菌液24 h后,草地贪夜蛾5龄和6龄幼虫体重均受到抑制,其体重分别为0.170 g和0.411 g,均显著低于CK的0.181 g和0.484 g;注射大肠杆菌菌液24 h后,草地贪夜蛾5龄和6龄幼虫集结数分别为135.0、338.4个索引集结数(the indexed nodules,INs),前者极显著低于后者,且均显著高于CK和PBS处理,分别为0.4、10.2个INs和0.3、10.9个INs;注射大肠杆菌菌液24 h后,草地贪夜蛾5龄幼虫PO活性为0.156 ABS·min-1·mg-1,显著高于CK和PBS处理,分别为0.046 ABS·min-1·mg-1和0.066 ABS·min-1·mg-1,但草地贪夜蛾6龄幼虫的PO活性为0.050 ABS·min-1·mg-1,显著低于CK和PBS处理,分别为0.066 ABS·min-1·mg-1和0.069 ABS·min-1·mg-1,且草地贪夜蛾5龄幼虫的PO活性显著高于6龄幼虫的PO活性。表明细菌侵染后草地贪夜蛾不同高龄幼虫的免疫应激反应存在差异,而这种差异可能受幼虫生长发育及细胞免疫和体液免疫功能之间权衡现象的影响。     

极长链霉菌SL01菌株抑菌活性物质的发酵条件优化和稳定性研究

为了获得极长链霉菌Streptomyces longissimus SL01菌株发酵的最佳培养基配方和发酵条件,采用单因素和正交试验法对SL01菌株的发酵液配方进行了优化,采用离体枝条和果实病斑抑制试验检测了其配方优化效果,并测定了SL01抑菌活性物质对温度、酸碱度和紫外光照射的稳定性。最终获得最佳发酵液的配方（质量分数）为:小米粉2%、酵母粉1%和MgSO4·7H2O 0.15%。以在28℃、初始pH 7.0、接种量2%、装液量50 mL/250 mL和转速180 r/min的条件下培养7 d得到的发酵液抑菌活性最强。采用优化的培养基配方发酵所得的SL01发酵液对苹果枝条和果实上的苹果树腐烂病的防效,分别比对照提高了39.86%和10.15%。所得发酵液在低于40℃、pH在6~10或紫外光照射12 h时,抑菌活性仍较为稳定。研究表明,通过培养基优化,可以显著提高SL01发酵产物的抑菌活性。     

解淀粉芽胞杆菌EA19菌株对小麦赤霉病的防治效果

为明确解淀粉芽胞杆菌Bacillus amylolyticus EA19菌株对小麦赤霉病的防治效果,室内测定EA19菌株及其发酵液对小麦赤霉病菌Fusarium asiaticum菌落生长、孢子萌发、子囊壳形成的影响,以及在室内离体麦穗上的防治效果,并进行了田间小区防治试验。室内试验测定结果表明,EA19菌株发酵液对小麦赤霉病菌菌落生长和分生孢子的萌发具有显著的抑制作用,在室内离体麦穗上的防治效果可达80.0%,对子囊壳形成无显著影响。田间小区防治试验结果表明,在添加紫外保护剂抗坏血酸的条件下,EA19菌株发酵液和菌体悬浮液对赤霉病均有显著的防治效果,其中EA19菌株发酵液的防治效果可达81.2%。EA19菌株喷雾粉可湿性粉剂对赤霉病的防治效果可达67.4%,能使小麦籽粒中脱氧镰刀菌烯醇毒素含量显著降低36.8%,与50%多菌灵可湿性粉剂的效果无显著差异。表明EA19菌株在生产上防治赤霉病具有较大的开发应用潜力。     

Bacillomycin D发酵与纯化工艺优化及其抑菌活性初步研究

为建立高纯度bacillomycin D（杆菌霉素D）脂肽的可放大制备工艺,促进其在农用抗生素领域应用价值的开发,经分离纯化及分子结构鉴定,确定了海洋源解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens TYg 3-2所产活性化合物为bacillomycin D脂肽类抗生素;选择精制过的天然培养基（酵母提取物和蛋白胨）,与组分明确的速效碳源、氮源（葡萄糖和硫酸铵）组成复合培养基,结合响应面优化调整培养基配方,建立了bacillomycin D发酵水平高达990 mg/L的5 L罐发酵工艺,其20.62 mg/（L·h）的比生产速率远高于文献报道的10.23 mg/（L·h）;在高品质原料基础上,发酵液经菌液分离、酸化沉淀、甲醇浸提、乙醚沉淀、大孔树脂吸附及硅胶柱层析工艺,可高效制备纯度达94.72%的样品。针对所制备的高纯度bacillomycin D样品进行了抑菌活性初步研究,证实其可离体拮抗德氏霉菌、玉米弯孢霉、稻绿核菌和长柄链格孢,并通过盆栽试验证实了bacillomycin D能提升同源芽孢杆菌TYg 3-2的防效,500 mg/L的bacillomycin D与4×106 CFU/mL的TYg 3-2菌体混合施用,对黄瓜炭疽病的防效可达95.3%,优于单独施用bacillomycin D（78.4%）和菌体（0）的防治效果。研究初步探索了bacillomycin D在农用抗生素领域的开发价值,同时其高纯度脂肽可放大制备工艺的建立至关重要,不仅能在保全生产菌（其芽孢为生防菌剂原料）的同时从其发酵液中分离和纯化目标脂肽,以促成对农用抗生素价值的深入研究,也能够满足中国农药登记相关毒理学试验对样品的要求（纯度>85%的克量级样品）,其结果可为芽孢杆菌源脂肽类抗生素的研究与开发提供参考。     

四种诱抗剂对苎麻生长发育和抗苎麻夜蛾特性的影响

为探究绿色环保的诱抗剂对苎麻生长发育以及抗苎麻夜蛾Arcte coerula特性的影响,选取4种常见且经济的诱抗剂水杨酸、几丁寡糖、壳寡糖1500和壳寡糖1000,分别设置8个浓度处理苎麻后喂食苎麻夜蛾,观察其取食叶面积,在田间处理区半人工释放苎麻夜蛾,观察其为害程度,并在收获时测量苎麻株高和原麻产量。结果表明,4种诱抗剂在适宜浓度下均能显著诱导苎麻对苎麻夜蛾的抗性,田间试验和室内试验结果的一致性较好。其中,80×10^-6几丁寡糖稀释液处理对苎麻的诱抗效果最高,苎麻夜蛾为害程度指数仅为8.38,其次是120×10^-6壳寡糖1000稀释液处理,为害程度指数为16.71,3.0 g/L壳寡糖1500处理和1.2 mmol/L水杨酸处理对苎麻的诱抗效果最低,为害程度指数分别为27.21和28.07。4种诱抗剂在适宜浓度下都能显著增加苎麻株高和原麻产量,但各诱抗剂处理的增产量无显著差异,原麻产量以40×10^-6壳寡糖1000稀释液处理最高,其次为2.0 g/L壳寡糖1500处理,最后为120×10^-6几丁寡...     

超高效液相色谱-串联质谱法测定浙贝母中6种农药残留

建立了QuEChERS-超高效液相色谱-串联质谱 (UPLC-MS/MS) 同时测定浙贝母鲜样和干样中吡虫啉、啶菌齅唑、氟唑菌酰胺、嘧菌环胺、吡唑醚菌酯和阿维菌素共6种农药残留量的方法。样品用V(乙腈) : V(水) = 4 : 1混合溶液提取,经C₁₈ 50 mg + PSA 50 mg + MgSO₄ 150 mg净化,采用UPLC-MS/MS电喷雾离子化正离子扫描和多反应监测模式 (MRM) 测定,基质匹配标准溶液外标法定量。结果表明:在0.001~0.2 mg/L 范围内,6种农药的质量浓度与相应的峰面积间呈良好的线性关系,相关系数均大于0.994。6种农药在浙贝母鲜样中的定量限 (LOQ) 为0.01 mg/kg,检出限 (LOD) 为2×10–5~3×10–4 mg/kg,在干样中的LOQ 为0.05 mg/kg,LOD 为1×10–4~1×10–3 mg/kg。在0.01、0.5 和 2 mg/kg 添加水平下,6种农药在浙贝母鲜样中的平均回收率均在80%~109%之间,相对标准偏差 (RSD) 在0.95%~13%之间 (n = 5);在0.05、0.5 和 2 mg/kg 添加水平下,6种农药在浙贝母干样中的平均回收率均在77%~101%之间,RSD在0.89%~7.5%之间 (n = 5)。经实际样品检测验证,该方法快速、简便、可靠、高效,适用于同时检测浙贝母中吡虫啉、啶菌齅唑、氟唑菌酰胺、嘧菌环胺、吡唑醚菌酯和阿维菌素等农药的残留。     

气相色谱法测定元胡、浙贝母和白芍中嘧霉胺残留

建立了一种测定元胡、浙贝母和白芍3种中药材中嘧霉胺残留的气相色谱分析方法。样品经二氯甲烷提取,液-液分配,柱层析[m（中性氧化铝）:m（弗罗里硅土）=3:2]净化,气相色谱-氮磷检测器（GC-NPD）检测,基质匹配外标法定量,同时经气相色谱-串联质谱（GC-MS/MS）验证。结果表明:在0.02~10 mg/L范围内,分别以正己烷和3种空白基质溶液为溶剂配制嘧霉胺的标准工作溶液,峰面积与相应的质量浓度间呈良好的线性关系,R2均大于0.999;在0.01（元胡中为0.02）、0.1和0.5 mg/kg 3个添加水平下,添加回收率为75%~104%,日内相对标准偏差（RSD）为1.3%~10.2%（n=5）,日间RSD为1.2%~9.0%（n=3）。分析方法在元胡、浙贝母和白芍中的定量限（LOQ）分别为0.02、0.01和0.01 mg/kg。该方法的灵敏度、准确度及精密度均符合农药残留分析要求,且简单易行,净化效果好,适用于元胡、浙贝母和白芍中嘧霉胺分析。     

小麦茎基腐病防治药剂及抗病品种的筛选

为获得防治小麦茎基腐病的有效药剂和抗病品种,测定12种杀菌剂对小麦茎基腐主要病原菌假禾谷镰孢菌Fusarium pseudograminearum的室内毒力、对小麦生长的影响及对小麦茎基腐病的室内防治效果,并鉴定144份小麦品种（系）对茎基腐病的抗性。结果表明,12种杀菌剂对假禾谷镰孢菌均有一定的抑制效果,其中15%氰烯菌酯·5%己唑醇的抑制率最高,EC₅₀为0.002 mg/L,其次是6.6%嘧菌酯·1.1%咯菌腈·3.3%精甲霜灵、25 g/L咯菌腈和430 g/L戊唑醇,EC₅₀分别为0.016、0.069和0.099 mg/L。12种杀菌剂拌种处理对小麦出苗、株高、根长和鲜重均有不同程度的影响,尤其对出苗率影响最大,其中15%氰烯菌酯·5%己唑醇处理的出苗率最低,为30.41%。15%氰烯菌酯·5%己唑醇拌种处理的防治效果最好,为70.43%;其次是430 g/L戊唑醇和25 g/L咯菌腈·37.5 g/L精甲霜灵,防治效果分别为56.34%和53.34%。在供试144份小麦品种（系）中,仅3份对小麦茎基腐病表现为中感,其余141份均表现为高感,无免疫和抗病品种。综上,目前防治小麦茎基腐病时建议选用15%氰烯菌酯·5%己唑醇等杀菌剂进行拌种处理,但应严格控制药剂用量,以防影响小麦出苗。