沙葱萤叶甲热激蛋白基因GdHsp10a的克隆、分子特征与表达分析

为明确热激蛋白HSP10在沙葱萤叶甲Galeruca daurica生长发育过程中的作用,采用RTPCR及RACE技术克隆沙葱萤叶甲Hsp10基因cDNA的全长序列,采用生物信息学方法分析其序列特征,并利用qPCR技术对该基因在沙葱萤叶甲不同发育阶段、成虫羽化后不同时期以及不同温度下的表达谱进行分析。结果表明,克隆获得1条新的沙葱萤叶甲Hsp10基因,命名为GdHsp10a,GenBank登录号为MG460308,cDNA序列全长为526 bp,开放阅读框为333 bp,编码蛋白含110个氨基酸,预测分子量为11.97 kD,等电点为9.74;无信号肽及跨膜结构。同源比对及系统进化分析表明,GdHSP10a与光肩星天牛Anoplophora glabripennis HSP10亲缘关系最近,氨基酸序列一致性为53.15%。qPCR结果表明,GdHsp10a在沙葱萤叶甲各发育阶段均有表达,其中在卵期和成虫期的表达量显著高于幼虫期、预蛹期及蛹期;成虫羽化后不同时期表达量差异显著,25 d时表达量最高,其次为100、10和7 d时的表达量;温度对GdHsp10a表达量有显著影响,30℃下表达量最高,35℃下表达量次之,15、20、25及40℃下表达量最低且无显著差异。表明GdHsp10a可能在沙葱萤叶甲生长发育及成虫越夏中起着多重作用。     

沙葱萤叶甲表皮蛋白基因GdAbd的克隆及对温度胁迫的响应

为揭示沙葱萤叶甲Galeruca daurica表皮蛋白基因GdAbd在其应对温度胁迫中的作用,采用RACE技术克隆表皮蛋白基因GdAbd的cDNA全长序列,并进行生物信息学分析;利用实时荧光定量(qPCR)技术比较GdAbd经不同温度处理1 h及25℃恢复30 min后在沙葱萤叶甲2龄幼虫体内的表达水平。结果表明,GdAbd基因全长708 bp(GenBank登录号:MG874710),开放阅读框为477 bp,编码158个氨基酸;蛋白预测分子量为16.98 kD,等电点为4.26;编码蛋白具有典型的表皮蛋白RR保守结构域,属于RR-2亚族;具有1个跨膜结构和1个信号肽。同源序列比对和系统发育分析表明,GdAbd与马铃薯甲虫Leptinotarsa decemlineata SgAbd-4的同源性最高,氨基酸序列一致性达50.63%。qPCR检测结果表明,与25℃对照相比,GdAbd基因表达水平在-10～5℃低温胁迫时未发生显著变化,而在35℃高温胁迫时发生显著上调;-10、-5和0℃低温胁迫后25℃恢复30 min可诱导GdAbd显著上调表达,但5℃低温和35℃高温胁迫处理与对照差异不显著。说明短时低温胁迫不能显著影响GdAbd表达,但胁迫后回温可诱导其上调表达。     

温度胁迫下沙葱萤叶甲小热激蛋白基因GdHsp20.6的克隆及表达分析（英文）

为明确小热激蛋白在沙葱萤叶甲Galeruca daurica应对温度胁迫中的作用,采用PCR方法克隆沙葱萤叶甲小热激蛋白基因Hsp20(GdHsp20.6)完整的开放阅读框(open reading frame,ORF)序列,应用在线软件对GdHsp20.6基因进行生物信息学分析,通过原核表达技术诱导表达及纯化其编码蛋白,并通过实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,RT-qPCR)技术分析不同温度胁迫下GdHsp20.6基因的表达量。结果显示,GdHsp20.6基因ORF序列长度为543 bp,编码180个氨基酸,预测分子量为20.6 kD,无跨膜区和信号肽。GdHsp20.6氨基酸序列有高度保守的α-结构域。GdHsp20.6氨基酸序列与其它鞘翅目昆虫的Hsp20氨基酸序列有较高的一致性,其中与花绒寄甲Dastarcus helophoroides的Hsp20.99氨基酸序列的一致性最高,为63%。GdHsp20.6基因在大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)细胞系中成功表达,经异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(isopropyl-β-d-thiogalactoside,IPTG)诱导后GdHsp20.6蛋白成功表达,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)和Western-blot分析表明融合蛋白大小与预测大小一致,并纯化获得了纯度较高的目的蛋白GdHsp20.6。低温(-10～5℃)和高温(35～40℃)处理1 h以及处理后25℃恢复30 min均能诱导GdHsp20.6基因表达上调,并且0℃处理30～120 min也能诱导GdHsp20.6基因表达上调。表明GdHsp20.6基因在沙葱萤叶甲应对低温和高温胁迫中可能起着重要作用。     

高温胁迫下绿豆象内参基因筛选及其Hsp70基因的表达特性

为明确Hsp70蛋白在绿豆象Callosobruchus chinensis高温耐受性中的作用,该研究筛选并克隆β-actin、α-tubulin、β-tubulin、EF1-α、GAPDH、Hsc70、AK和RPL40八个候选内参基因,采用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)技术测定其在绿豆象雌雄成虫体内的表达量,通过geNorm、BestKeeperr和NormFinde软件对这8个候选内参基因的表达稳定性进行评价,选择最适宜的内参基因对不同高温胁迫下绿豆象体内Hsp70基因的表达特性进行测定。结果表明,8个候选基因引物均有良好的特异性和引物扩增效率,引物扩增效率介于91.6%～108.1%之间。高温胁迫下,β-tubulin基因较其他7个候选基因有较小的平均变异度、稳定值和标准差,为最适宜的内参基因。39、42和45℃高温处理1 h后绿豆象雌雄成虫体内Hsp70表达水平较对照显著上调,当处理时间延长至3 h后,Hsp70基因的相对表达量较对照也有不同程度上调,但差异不显著,表明绿豆象Hsp70基因可以响应高温胁迫,Hsp70蛋白在绿...     

马铃薯甲虫热激蛋白基因Ld-hsp90的克隆及温度胁迫下的表达

马铃薯甲虫Leptinotarsa decemlineata是一种抗逆性极强的世界性检疫害虫,对温度胁迫具有很强的适应性,为进一步明确其对温度胁迫适应性的分子生态机制,采用RT-PCR及RACE技术克隆得到了1个hsp90基因的cDNA全长序列,命名为Ld-hsp90,并利用实时荧光定量PCR技术检测其在温度胁迫后相对表达量的变化。Ld-hsp90全长为2 489 bp,开放阅读框(ORF)长度为2 160 bp,编码719个氨基酸,理论等电点为4.98,分子量约为82.09 kD,5'端与3'端非编码区长度分别为113 bp和216 bp。氨基酸序列中含有HSP90家族的5个签名序列及胞质特征序列MEEVD。实时荧光定量PCR检测结果显示:38℃和44℃高温热激1 h,马铃薯甲虫成虫体内的Ld-hsp90的表达量均显著高于对照组,而0℃与-10℃低温处理1 h后的表达量与对照组均无显著差异。研究表明Ld-hsp90的上调表达在马铃薯甲虫抗高温中起着重要的作用。     

温度诱导对星豹蛛热激蛋白hsp70和hsp90基因表达的影响

为探讨温度诱导对星豹蛛的应激反应,运用实时定量PCR法测定了不同温度对星豹蛛热激蛋白hsp70和hsp90基因表达量的影响。结果表明:经过17、20、23、26℃诱导后,星豹蛛hsp70和hsp90基因表达量与对照组差异不显著,当高于26℃时,随着温度的升高表达量呈先升高后降低的趋势,且在38℃时最高,分别为对照组的716.46和10.44倍,差异显著;低于17℃时,表达量随着温度的降低呈逐渐升高的趋势,其中-1℃时最高,分别为对照组的334.53和9.38倍,差异显著;-1~41℃范围内,在相同诱导温度处理下,星豹蛛hsp70基因表达量显著高于hsp90基因。表明当星豹蛛受到温度高于26℃或低于17℃的刺激后,体内hsp70和hsp90基因表达量均增加,且hsp70基因表达量高于hsp90基因。说明热激蛋白只有在极端高温和低温的条件下才充分表达,从而对机体产生保护作用,且这种保护只在一定温度范围内起作用。     

沙葱萤叶甲己糖激酶基因的克隆、相对表达量及RNA干扰效应

为揭示沙葱萤叶甲Galeruca daurica己糖激酶基因的功能,根据本课题组组装的沙葱萤叶甲转录组测序数据,应用cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends,RACE)克隆获得沙葱萤叶甲己糖激酶基因的cDNA全长序列,分析其编码蛋白的氨基酸序列与其它昆虫同源蛋白氨基酸序列之间的系统进化关系,采用实时荧光定量技术(real-time quantitative polymerase chain reaction,qPCR)测定不同发育阶段和不同温度下沙葱萤叶甲己糖激酶基因的相对表达量以及对RNA干扰的响应。结果表明,沙葱萤叶甲己糖激酶基因的cDNA全长为1 699 bp,开放阅读框长为1 479 bp,编码492个氨基酸;沙葱萤叶甲己糖激酶氨基酸序列与玉米根萤叶甲Diabrotica virgifera virgifera己糖激酶氨基酸序列一致性最高,为65.42%。己糖激酶基因在沙葱萤叶甲不同发育阶段均有表达,成虫滞育期间相对表达量维持在低水平,而滞育结束后相对表达量急剧上升达最高值。在0～40℃范围内,随着温度增加,己糖激酶基因在沙葱萤...     

棉铃虫小分子热激蛋白sHSP22.0基因的克隆及表达谱分析

棉铃虫Helicoverpa armigera是一种重要的农业害虫,本文旨在研究小分子热激蛋白在其生长发育过程、抵御高温及Cry1Ac杀虫蛋白中的功能.利用PCR结合RACE技术克隆了棉铃虫sHSP22.0(small heat shock pro-tein 22.0)基因,通过生物信息学软件分析了棉铃虫sHSP22....     

大豆蚜Aghsp75基因对吡虫啉及温度胁迫的应激表达

热激蛋白在昆虫抵御温度胁迫和药剂胁迫反应中具有重要作用。本试验通过高通量测序获得一条大豆蚜热激蛋白基因的cDNA序列,该序列全长2982 bp,含1个长度为2052 bp的开放阅读框,编码683个氨基酸组成的多肽,多肽等电点约为6.30,分子质量约为77.8 kDa;推导的氨基酸序列与棉蚜Aphis gossypii HSP75同源性高达99.12%,属于hsp 75家族。我们把该基因定名为Aghsp75,已提交至GenBank（登录号为MN068810）。Aghsp75通过不同浓度吡虫啉药剂和不同温度胁迫成蚜后发现,经LC₅₀吡虫啉浓度胁迫3、6和24 h时以及在LC₃₀浓度吡虫啉胁迫12 h时该基因表达量显著升高;经6℃处理6 h时以及36℃处理3 h和6 h时该基因表达量显著升高。本研究表明该基因可能参与大豆蚜的抗逆过程,为利用分子生物技术手段防治大豆蚜提供理论保障。     

莲草直胸跳甲热激蛋白90基因的分子特征、表达模式及对温度胁迫的响应

莲草直胸跳甲Agasicles hygrophila是世界性入侵杂草空心莲子草Alternanthera philoxeroides的专食性天敌,冬季低温和夏季高温会影响其种群数量从而降低防控效果。为进一步探讨莲草直胸跳甲对温度胁迫适应性的分子生态机制,本研究对其热激蛋白90(AhHSP90)进行了蛋白结构、磷酸化修饰及系统发育等生物信息学分析,并采用荧光定量PCR检测了AhHSP90基因的时空表达动态及不同温度胁迫后的表达。RT-qPCR结果显示,AhHSP90在莲草直胸跳甲整个生活史及雌成虫各组织中均有表达;高温(30、35和40℃)、低温(-5、0、5、10、15和20℃)胁迫2 h后,AhHSP90在高温40℃下表达显著升高,但在其他温度下无显著差异。根据对AhHSP90分子特征、表达模式以及对温度胁迫的响应等方面的综合分析,推测其可能在莲草直胸跳甲发育及抵抗高温过程中发挥着重要的作用。     

四种钙结合蛋白基因在沙葱萤叶甲幼虫生长发育中的作用

为明确沙葱萤叶甲Galeruca daurica钙结合蛋白基因的功能,利用本实验室组装的沙葱萤叶甲转录组数据库鉴定钙结合蛋白基因序列,采用RNA干扰（RNA interference,RNAi）技术沉默沙葱萤叶甲3龄幼虫体内钙调蛋白（calmodulin,CaM）、钙网蛋白（calreticulin,CRT）、类钙磷蛋白（calcyphosine-like,CAPSL）和类肌钙蛋白C（troponin C-like,TnCl）共4种钙结合蛋白基因,观察幼虫发育历期、存活率、体重及蛹重的变化;应用实时荧光定量PCR测定干扰效率。结果表明,共筛选到41条编码钙结合蛋白的基因序列,选取4条具有完整开放阅读框的钙结合蛋白基因序列进行后续研究。4种钙结合蛋白基因的干扰效率从高到低依次为CAPSL（94.4%）、TnCl（76.2%）、CRT（70.5%）和CaM（54.5%）;干扰效率最高的时间分别为干扰后第4、2、6和2天。沉默CAPSL后,沙葱萤叶甲幼虫体重显著降低了21.0%~34.9%,存活率显著下降了53.5%,发育历期显著缩短了15.1%,蛹重显著降低了15.8%。沉默TnCl后,沙葱萤叶甲幼虫体重显著降低了10.5%~25.0%,存活率显著下降了19.1%,蛹重显著降低了11.0%,而对发育历期无显著影响。沉默CaM后,沙葱萤叶甲幼虫体重显著降低了5.9%~6.6%,存活率显著降低了8.7%,而幼虫发育历期和蛹重无显著变化。沉默CRT后,沙葱萤叶甲幼虫体重、蛹重、存活率和发育历期均无显著变化。表明CAPSL、TnCl和CaM在沙葱萤叶甲幼虫生长发育过程中发挥着重要作用,而CRT可能未参与沙葱萤叶甲幼虫生长发育的调控过程。     

绿僵菌与3种杀虫剂混用对沙葱萤叶甲的协同作用

采用点滴法,于室内测定了阿维菌素、茚虫威和鱼藤酮3种杀虫剂单独使用及与绿僵菌混用对沙葱萤叶甲3龄幼虫的协同致死作用,以期为协调使用化学药剂和生防制剂防治沙葱萤叶甲提供参考。3种杀虫剂单独使用时的毒力测定结果表明,阿维菌素对沙葱萤叶甲3龄幼虫的毒力最强,LD50值为4.80 ng/头,其次是茚虫威和鱼藤酮,LD50值分别为10.47和53.21 ng/头。采用不同浓度的3种杀虫剂分别处理绿僵菌24和48 h后,发现药剂对绿僵菌分生孢子萌发均有一定的抑制作用,但抑制率低于20%,且抑制率随着药剂浓度的降低和作用时间的延长而降低,其中茚虫威的平均抑制率最小,分别仅为1.89%±0.57%和0.89%±0.39%。将3种杀虫剂分别与绿僵菌孢子悬液混配使用,对防治沙葱萤叶甲3龄幼虫均具有协同增效作用:其中茚虫威与绿僵菌混用增效作用最强,比单独施用绿僵菌时LT50值缩短了8.12 d;阿维菌素与绿僵菌混用时LT50值缩短了7.60 d;鱼藤酮与绿僵菌混用时LT50值缩短了6.45 d。     

三叶草斑潜蝇hsp70的克隆及其表达量在高低温胁迫下的变化

为了明确高低温胁迫对三叶草斑潜蝇hsp70表达量的影响,采用RT-PCR和RACE技术获得了1条三叶草斑潜蝇诱导型热激蛋白基因hsp70,命名为Lthsp70-1,并利用实时荧光定量PCR技术检测其在温度胁迫后的表达量.该基因的开放阅读框为1923 bp,编码640个氨基酸.氨基酸序列中含有HSP70家族的签名序列IFDLGGGTFDVSIL和IVLVGGSTRIPK、DnaK特征基序IDLGTT(Y)S(C)V、非细胞器基序RARFEEL,以及C末端的保守序列EEVD.实时荧光定量PCR结果显示:成虫在31～33℃范围内,其hsp70表达量随温度升高而上升,33℃时达到最高峰;35～39℃时,hsp70表达量迅速下降;蛹经0℃胁迫0.5～2.0 h,其hsp70表达量随时间延长呈上升趋势.由此可见,高低温胁迫均能诱导三叶草斑潜蝇hsp70的表达.     

水稻热休克蛋白HSP70基因克隆、表达分析及原核表达

为明确水稻热休克蛋白70（heat shock protein 70,HSP70）基因在逆境胁迫下的表达特征,以日本晴粳稻水稻品种为材料,通过基因克隆方法获得水稻HSP70基因cDNA全长序列,并采用生物信息学的方法分析其序列特征,利用实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR,RT-qPCR）技术测定不同水稻组织、不同激素、不同温度以及不同逆境下HSP70基因的相对表达量,同时对其原核表达条件进行优化。结果表明,水稻HSP70基因全长1 950 bp,预测蛋白大小为71.18 kD,等电点为5.10,亚细胞定位于细胞质内,有较强的亲水性。水稻HSP70蛋白序列与香蕉HSP70蛋白序列的亲缘性较高;水稻HSP70基因表达具有组织特异性,在茎中的相对表达量最高,在根中最低;低温胁迫后,水稻HSP70基因在12 h内基因相对表达量相对稳定,在24 h时相对表达量达到峰值,为9.60;高温胁迫后,在较短时间内水稻HSP70基因显著上调并达到峰值,为79.10;激素吲哚乙酸、脱落酸和油菜素内酯均能诱导水稻HSP70基因表达;但在甘露醇模拟干旱和NaCl盐胁迫处理下,水稻HSP70基因的相对表达量呈现先升后降的趋势。水稻HSP70蛋白的最佳诱导温度是30℃,异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷最佳诱导浓度为1.2 mmol/L。