铁皮石斛两个DEAD-box RNA解旋酶基因克隆及特征分析

为获得铁皮石斛DEAD-box RNA解旋酶(RH, RNA Helicase)基因并进行表达及序列分析,利用RACE从其叶片cDNA中分离RH基因,对编码蛋白相关理化特性进行生物信息分析;采用MEGA 6.0构建系统进化树;借助定量PCR技术检测基因表达特性。结果表明:分离到铁皮石斛两个DEAD-box RH基因 DoRH1和 DoRH2(GenBank注册号KT957555和KT957556),全长为1 648 bp和1 851 bp,各编码1条由428和499个氨基酸组成的肽链,编码蛋白相对分子质量分别为48 206和55 432,等电点5.51和8.65; DoRH1和DoRH2蛋白均包含3个保守的RH结构域和多个基元,无信号肽或跨膜域,预测均定位在细胞核;两个基因与植物DEAD-box RH家族基因相似性高达80%以上; DoRH1、 DoRH2分别聚在拟南芥、水稻、大豆和雷蒙德氏棉DEAD-box RH家族基因进化树的Ⅲ、Ⅳ支; DoRH1和 DoRH2表达模式不同, DoRH1在根、茎、叶中表达量无显著差异, DoRH2在根中的相对表达量为叶中的3.26倍,茎与叶中无差异...     

铁皮石斛SEP3基因的生物信息学分析及敲除载体的构建

SEP3(SEPALLATA3)基因是MADS-box家族中的一员,在花器官的形成和发育过程中具有重要作用.为了解SEP3基因在铁皮石斛(Dendrobium officinale)中的成花转变机理,从铁皮石斛转录组序列中获得一个SEP3基因序列,并命名为DoSEP3.预测其编码区长度为354 bp,预测编码117个氨基酸.DoSEP3蛋白相对分子质量13457.87 Da.其不稳定系数为60.53,亲水性的平均值为-0.121,是不稳定的亲水性蛋白,主要在内质网和细胞核中起作用.二级结构主要以α-螺旋为蛋白质最大量的结构元件,跨膜区分析推测DoSEP3蛋白质具有一个跨膜区.进一步的氨基酸比对显示,铁皮石斛DoSEP3蛋白与金钗石斛SEP3蛋白亲缘关系最近,可能具有类似的功能.基于生物信息学分析,利用CRISPR/cas9技术构建铁皮石斛基因敲除载体,并使用农杆菌介导法进行遗传转化,且已获得阳性原球茎,可为后续的SEP3基因表达研究奠定基础.     

铁皮石斛RRT家族全基因组鉴定及表达分析

多糖是药用植物铁皮石斛(Dendrobium officinale)的主要成分之一。鼠李半乳糖醛酸聚糖Ⅰ鼠李糖转移酶(rhamnogalacturonⅠrhamnosyltransferase, RRT)在Ⅰ型鼠李半乳糖醛酸聚糖的合成中起重要作用。利用生物信息学在全基因组水平鉴定出4个铁皮石斛RRT家族基因( DoRRT1、 DoRRT2、 DoRRT3、 DoRRT4),通过逆转录定量PCR检测该基因家族在不同组织和胁迫下的表达情况。结果表明：在系统发育上DoRRT1、DoRRT3被聚为一组,DoRRT2、DoRRT4被聚为一组;DoRRT蛋白均为亲水蛋白质,可定位于高尔基体;DoRRT蛋白的α-螺旋和无规卷曲较多;4个DoRRT蛋白均有O-FucT保守结构域;组织表达显示 DoRRT1、 DoRRT2、 DoRRT4在根、茎、叶中均有表达,且在地上部的转录水平较高;胁迫表达表明 DoRRT2、 DoRRT4在高温胁迫下表达显著下调, DoRRT2在PEG模拟干旱条件下表达显著下调,说明 DoRRT2、 DoRRT4参与非生物胁迫响应。以上结果为深入研究DoRRT的生物学功能提供数据...     

铁皮石斛纤维素合成酶超级基因家族生物信息学分析

纤维素合成酶超级基因家族是植物体纤维素合成的重要基因。为研究铁皮石斛纤维素合成酶和类纤维素合成酶基因(CESA/CSL)家族的功能,利用从铁皮石斛转录组中鉴定出的32个在茎中高表达量的纤维素合成酶超级基因家族成员为研究对象,使用MEGA 5.0、GSDS、SMART、TMHMM、WoLF PSORT等软件对其构建系统进化树,并对基因结构及蛋白质保守结构域、跨膜结构和亚细胞定位等进行综合分析。结果显示,CESA/CSL基因在铁皮石斛不同组织中表达的数目和表达量均不同,具有组织表达特异性。铁皮石斛茎中表达量较高的CESA/CSL基因家族可分为6个亚族,外显子数目1～21个。CESA/CSL基因编码的蛋白质保守性较强,除CSLA亚族外,其余亚族均含有该基因家族的保守结构域Cellulose synthase。CESA/CSL蛋白主要分布于质膜上,大部分具有跨膜结构域。     

铁皮石斛鲨烯合酶基因的克隆及其组织表达模式分析

【目的】克隆珍稀濒危兰科药用植物铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)鲨烯合酶(Squalene synthase,SS)基因(DoSS),并对其进行生物信息学与组织表达模式分析,为研究其生物学功能提供参考。【方法】采用RT-PCR和RACE技术,获得DoSS基因全长序列;利用生物信息学软件预测DoSS蛋白的理化性质、结构域及亚细胞定位等分子特性;用DNASTAR 6.0和MEGA 4.0分别进行DoSS蛋白氨基酸多序列比对和进化关系分析;借助qPCR检测DoSS基因的组织表达模式。【结果】成功克隆获得铁皮石斛鲨烯合酶基因,命名为DoSS(GenBank注册号JX272631),其cDNA全长1 735bp,编码一条由410个氨基酸组成的多肽,分子质量46.99ku,等电点7.13;DoSS蛋白含有鲨烯/八氢番茄红素合成酶保守结构域(44-315位氨基酸);DoSS与其他多种植物SS基因的编码蛋白同源性很高(61%~75%),与水稻、玉米等单子叶植物的亲缘关系较近;DoSS基因为组成型表达,在根中的表达量最大,为叶的12.41倍;茎次之,为叶的1.87倍。【结论】成功克隆得到1个鲨烯合酶基因(DoSS)全长cDNA;DoSS基因的(在根中高)表达特征暗示,其可能在铁皮石斛根的生长发育中发挥重要的调控功能。     

铁皮石斛DcbHLH14基因克隆及表达分析

【目的】克隆铁皮石斛转录因子DcbHLH14基因并分析其在非生物胁迫响应中的表达情况,为研究DcbHLH14基因的功能提供理论参考。【方法】通过同源克隆从铁皮石斛叶组织中得到DcbHLH14基因,对其编码的蛋白序列特征和组织表达特性进行分析,并采用qRT-PCR对DcbHLH14基因在低温、干旱和ABA处理过程中的表达量进行分析。【结果】DcbHLH14基因开放阅读框(Open reading frame, ORF)为1 269 bp,与参考序列存在7个碱基差异,仅含有1个外显子且无内含子,编码422个氨基酸。DcbHLH14蛋白的分子式为C₂₀₁₁H₃₁₉₂N₅₈₆O₆₁₃S₁₃,理论分子量为45.8 kD,理论等电点(pI)为5.98,含有bHLH家族保守结构域bHLH-MYC-N和HLH,属于bHLH家族,与鼓槌石斛(Dendrobium chrysotoxum)和春兰(Cymbidium goeringii)bHLH蛋白的氨基酸序列同源性较高,分别为97.16%和86....     

铁皮石斛糖苷水解酶GH3基因家族鉴定及表达模式分析

利用生物信息学方法对铁皮石斛GH3基因家族成员进行筛选、鉴定,对其基因结构、蛋白理化性质、亚细胞定位、系统进化、蛋白质二级结构及跨膜预测、基序及染色体定位进行分析,同时分析GH3基因家族在不同组织以及低磷与正常磷水平下的表达模式。在铁皮石斛全基因组中筛选得到13个GH3家族基因,其中一个基因存在可变剪切,表达为14个GH3蛋白。GH3基因家族蛋白可分为3个亚家族,各亚家族中不同基因相对保守;各成员均含有内含子与外显子,内含子相位在0～2,13个基因分布在8染色体上。GH3基因家族在铁皮石斛的8个组织中均有表达,其中白根和花蕾表达量高,茎和唇瓣低,推测GH3基因家族可能参与铁皮石斛根系生长以及开花现蕾。低磷与正常磷水平表达结果表明,低磷水平下叶中基因LOC110110392、LOC110100144表达上调,根中基因LOC110095762、LOC110107269表达上调。该研究对铁皮石斛糖苷水解酶GH3基因家族成员生物信息学、在不同组织以及正常磷与低磷条件下的表达水平进行研究分析,筛选响应低磷信号的糖苷水解酶基因,为后期研究糖苷水解酶参与低磷条件下铁皮石斛多糖代谢调节机制提供研究基础...     

铁皮石斛酸性蔗糖转化酶基因家族鉴定及低温下表达分析

为了探究DcAI家族基因的生物学特性及其在逆境响应中的潜在功能,基于已公布的铁皮石斛基因组数据,对铁皮石斛DcAI基因家族进行鉴定和生物信息学分析,并用RNA-Seq(转录组测序)技术分析其在低温胁迫下的表达模式。结果表明,DcAI基因家族共有4个成员,其中液泡蔗糖转化酶编码基因和细胞壁蔗糖转化酶编码基因各2个,在数量上与其他物种间的差异较大,存在基因丢失现象。DcAIs具有相似的内含子/外显子结构,且不均匀地分布在染色体上,其蛋白质结构高度保守,具有酸性蔗糖转化酶特有的氨基酸保守基序。DcAIs启动子含有多种顺式作用元件,涉及光响应、胁迫响应、激素响应、发育调节等多种生理生化过程;DcAIs在铁皮石斛不同组织中的表达丰度不同,具有明显的组织表达特异性;DcAIs在低温胁迫下呈现不同的表达模式,以同工酶形式在不同组织中对低温胁迫采取不同的响应机制,推测DcAIs可能通过调节自身基因的表达以提高细胞内可溶性多糖含量,从而增强铁皮石斛对低温的耐受能力。研究结果可为DcAIs基因的利用及铁皮石斛优良种质的分子遗传改良提供参考借鉴。     

鲤RNF2基因的克隆、组织表达与生物信息学分析

以鲤肾脏组织RNA为模板,扩增并克隆鲤环指蛋白2(RING Finger Protein 2,RNF2)基因的CDS区全长,分析其组织表达谱.结果显示,鲤RNF2基因的CDS区序列长1011 bp,编码336个氨基酸;该基因与鲫、斑马鱼、金头鲷、海洋青鳉鱼、鳕鱼、非洲爪蟾、尖尾娇鹟、小鼠、智人的同源性分别为98.2％、...     

CBF3基因的克隆、生物信息学分析及植物表达载体的构建

从拟南芥基因组DNA中分别克隆了CBF3基因和逆境诱导型启动子Rd29A,测序结果显示:克降的CBF3基因长776bp.编码216个氨基酸,与GeneBank公布的的序列相比对,核苷酸同源性达到99.2%,并利用生物信息学手段对其氨基酸序列、进化树、理化性质、疏水性/亲水性等进行分析;启动子Rd29A全长为956 bp,与已报道的该启动子序列比较,其核苷酸同源性为99.5%.以双元载体pCAMBIAl301为基础,成功构建了植物表达载体pCAMBIA1301一Rd29A-CBF3,为利用CBF2基因提高植物的耐寒性创造了条件.     

铁皮石斛多糖的提取工艺优化及其抗氧化活性研究

【目的】优化铁皮石斛多糖的提取工艺,并评价铁皮石斛多糖的抗氧化活性。【方法】以铁皮石斛多糖提取率为响应值,在单因素试验基础上,以提取时间、提取次数及液(mL)料(g)比为试验因素,采用响应面法建立数学模型,筛选最佳提取工艺条件。采用自由基清除能力体系初步评价铁皮石斛多糖的抗氧化活性。【结果】通过二次回归模型响应面分析,获得最佳的铁皮石斛多糖提取工艺为:提取次数3次、提取时间2h、液(mL)料(g)比75。在此最佳工艺条件下,铁皮石斛多糖提取率为34.96%,与理论值(36.57%)相对误差小于5%。铁皮石斛多糖对DPPH和ABTS自由基的半数清除率分别为1.20和3.65mg/mL。【结论】采用响应面法优化得到了铁皮石斛多糖的最佳提取工艺,该工艺方便可行,得到的多糖具有较强的抗氧化活性。     

铁皮石斛可溶性酸性转化酶基因克隆与表达分析

【目的】克隆铁皮石斛Dendrobium officinale可溶性酸性转化酶基因SAI,分析该基因生物学信息及时空表达特异性。【方法】基于同源序列克隆铁皮石斛SAI基因c DNA全长,采用生物信息学方法进行序列分析,并采用qRTPCR进行组织特异性表达分析。【结果】铁皮石斛SAI基因全长为1 595 bp,c DNA编码区1 368 bp,Genbank登录号为KU598852。该基因编码455个氨基酸,蛋白相对分子质量为50 700。NCBI BLASTx分析表明,该基因氨基酸序列与柑橘Citrus unshiu酸性转化酶基因、甜橙C.sinensis酸性β-呋喃果糖苷酶基因序列相似性最高,达77%,与其他植物酸性转化酶基因的相似性均高于68%。聚类分析表明,铁皮石斛SAI基因与玉米Zea mays液泡转化酶基因、甘蔗Saccharum officinarum SAI基因亲缘关系最近。该基因编码的蛋白质属于非跨膜结构的亲水性热稳定蛋白,定位于液泡中。SAI基因在2年生铁皮石斛的茎中表达量最高,3年生的叶中表达量最低。【结论】成功克隆铁皮石斛液泡酸性转化酶基因,该基因在铁皮石斛不同组织不同生育时期的表达量差异较大。     

小麦TaCYP78A5基因的克隆及生物信息学分析

细胞色素P450(Cytochromes P450)蛋白家族含有硫羟基和血红素结构域,参与多种生物合成,CYP78A家族成员对籽粒大小形成有重要的功能。利用同源克隆的方法,分别从小麦大粒品系‘P271’和小粒材料‘中国春’中扩增到位于2AS、2BS、2DS上的TaCYP78A5-2A、TaCYP78A5-2B和TaCYP78A5-2D基因,编码534、544、549个氨基酸。通过分析发现在‘P271’和‘中国春’克隆到的TaCYP78A5序列一致,说明TaCYP78A5基因在这2个粒型的小麦中是保守的。CYP78A家族在水稻和拟南芥中具有非自主性细胞表达模式,结合对CYP78A家族的生物进化关系研究发现,CYP78A家族的各个基因在单子叶植物中是保守的。‘P271’和‘中国春’籽粒大小的差异,可能是TaCYP78A5基因在‘P271’中的基因表达量高于‘中国春’,引起种子发育过程中内表皮细胞的增殖,从而促进种子表皮增大,使得‘P271’种子大小和质量增加。     

霍山石斛生物碱的提取及铁皮石斛的鉴别

采用超声波辅助酶法提取霍山石斛中的生物碱，通过对固液比、超声时间、超声功率、酶解时间、复合酶（纤维素酶和果胶酶1∶1等活力混合）质量分数的单因素试验和正交试验，确定提取最佳的条件；通过气相色谱-质谱法对霍山石斛中生物碱的组成成分进行分析；通过傅里叶变换红外光谱及二阶导数变换谱图快速鉴定霍山石斛和铁皮石斛。结果表明，当固液比为1:40（g·mL^-1），超声时间为20 min，超声波功率为200 W，复合酶（纤维素酶和果胶酶1∶1等活力混合）添加量1.5%，酶解时间1.5 h为提取条件时，提取效率最佳，生物碱得率为0.053%。根据气相色谱-质谱法检测结果可得知，相对于铁皮石斛，霍山石斛的石斛碱和6-羟基石斛次碱为其特殊生物碱。二阶导数变换谱图可更直观地通过二者峰形状、个数和强度的不同来区分。因此，可以将气相色谱质谱联用和傅里叶红外光谱结合在一起来高效鉴定霍山石斛与铁皮石斛。     

梭梭液泡膜焦磷酸酶HaVVP基因克隆及序列分析

以梭梭叶片为材料,根据其他植物液泡膜焦磷酸酶基因的保守序列设计引物,采用同源基因克隆及RACE-PCR方法克隆到1个H+-PPase基因,命名为HaVVP。HaVVP基因编码区长2 734bp,编码767个氨基酸;所得序列与GenBank中注册的高等植物H+-PPase基因核苷酸序列的同源性均在68%以上、氨基酸序列的同源性达80%以上。     

猕猴桃 AcNPR1基因克隆及抗病响应表达分析

为探究猕猴桃 AcNPR1基因在抗病响应中的作用及其在不同抗性猕猴桃品种间抗性差异机制,以高感病品种‘红阳’和抗病品种‘徐香’猕猴桃叶片为材料克隆 AcNPR1基因序列;利用ExPASy-ProtParam tool、MEGA 7.0 等对‘红阳’AcNPR1蛋白的理化性质进行分析、亚细胞定位进行预测、进化关系等进行分析;通过RT-qPCR分析 AcNPR1基因在不同品种猕猴桃植株中的组织表达模式以及病原菌和水杨酸（Salcylic acid,SA）对其诱导表达模式。结果表明, AcNPR1基因开放阅读框1 770 bp（Genbank 登录号MW881148）,编码589个氨基酸,理论等电点6.27,具有典型的BTB/POZ结构域、ANK重复序列、NPR-like等NPR1蛋白保守结构域,AcNPR1蛋白预测定位于细胞核中;蛋白质的二级结构以α螺旋和无规卷曲为主;系统进化显示其与茶树的亲缘关系最为密切,相似性为83.94%。组织特异性分析表明 AcNPR1基因在‘红阳’和‘徐香’品种叶片中的表达水平最高。在丁香假单胞杆菌猕猴桃致变种（Pseudomonas syringae pv.actinidiae,Psa）处理下,抗病品种‘徐香’ AcNPR1基因的相对表达水平在处理0 h后迅速增加,为对照的3.6倍;而高感品种‘红阳’在48 h后显著增加,为对照的2.7倍。在SA+Psa处理下,‘徐香’ AcNPR1基因相对表达水平在24 h内达到最高水平,是对照的7.7倍;‘红阳’在72 h后达到最大值,仅为对照的1.6倍。 ‘徐香’ AcNPR1基因的抗病响应反应早于‘红阳’且更易受SA诱导表达。 AcNPR1基因在猕猴桃抗病胁迫方面具有一定作用,在不同抗性的猕猴桃品种抗病机制中存在差异。