淇河鲫cyp19a1b基因的克隆表达及芳香化酶抑制剂对其表达的影响

为探索脑型芳香化酶基因(cyp19a1b)在雌核发育三倍体鱼淇河鲫性别决定与分化过程中的作用,利用RACE方法克隆淇河鲫cyp19a1b基因cDNA全长序列,采用Real-time PCR分析其在不同组织、胚胎及胚后不同发育时期的表达情况,同时检测芳香化酶抑制剂Letrozole诱导性逆转及腹腔注射人绒毛膜促性腺激素(hCG)后cyp19a1b在脑中的表达情况。结果显示,淇河鲫cyp19a1b cDNA全长2 984 bp(GenBank ID:MF926270),包含132 bp5′非编码区,1 319 bp 3′非编码区,1 533 bp开放读码框,编码510个氨基酸残基;氨基酸序列比对及系统进化分析结果显示,淇河鲫Cyp19a1b与其他鲤科鱼类同源性较高,与哺乳类、爬行类等脊椎动物同源性较低,这与其分类地位一致;组织分布检测结果显示,cyp19a1b基因在淇河鲫脑中表达量最高,在卵巢等其他组织中表达量较低;Realtime PCR结果表明,在胚胎发育过程中cyp19a1b在外源精子刺激后从囊胚期开始上调,神经胚期达到最高,随后降低;出膜后随着发育的进行,该基因在脑中表达量逐步上调,在躯体中一直维持在较低水平;除此之外,伴随着Letrozole诱导的性逆转,cyp19a1b在脑中表达量降低;腹腔注射hCG可以促进cyp19a1b在脑中表达。研究表明,淇河鲫cyp19a1b基因可能通过参与神经系统的形成及神经内分泌活动,在性别决定与分化过程中起到一定的作用。     

淇河鲫IL-8 cDNA克隆及组织表达分析

IL-8是最早发现的趋化因子,属于CXC亚家族,与鱼类非特异性免疫水平关系密切。实验采用同源克隆和cDNA末端快速扩增(RACE)方法,从淇河鲫总RNA反转录产物中获得了641 bp IL-8cDNA序列,其中包含102 bp的5’非编码区,242 bp的3’非编码区和297 bp的开放阅读框。该基因编码由98个氨基酸残基组成的前体蛋白,前22个氨基酸残基为信号肽。肽链中含有4个保守半胱氨酸,前2个半胱氨酸被1个精氨酸分隔,形成CXC结构。第一个半胱氨酸前缺乏ELR基序,其组成是DPR。由氨基酸同源性分析和进化分析可知,淇河鲫IL-8与鲤、鳙、草鱼、鲢等鲤科鱼类的进化关系较近,与鲤IL-8的同源性最高(94%)。通过实时荧光定量PCR检测,淇河鲫IL-8在被检测的8个组织中都有表达,其中在肌肉中的表达量最高,其次为脾脏、头肾和脑等。研究结果对调控淇河鲫非特异性免疫能力,提高淇河鲫健康养殖水平具有一定参考价值。     

淇河鲫肌肉生长抑制素基因的克隆与表达

肌肉生长抑制素(MSTN)是动物肌肉发育和生长过程中的负调控因子。为了明确淇河鲫MSTN基因序列及其在肌肉生长发育中的调控功能,本研究利用RACE方法克隆淇河鲫MSTN全长c DNA序列,q RT-PCR分析其在不同组织和胚胎发育阶段的表达情况。结果显示,淇河鲫MSTN c DNA序列全长2094 bp(no.KC851952.1),包含86 bp 5′非编码区、880 bp 3′非编码区和1128 bp开放阅读框,编码375个氨基酸残基,前22个氨基酸残基为信号肽,34~256位氨基酸残基为TGF-β前肽域,281~375是TGF-β结构域,具蛋白酶水解位点RIRR和C端生物活性区的9个保守半胱氨酸残基。蛋白同源分析发现淇河鲫MSTN与鲤形目鱼类相似性较高,与哺乳动物和鸟类的相似性最低。系统进化分析显示,淇河鲫MSTN与鲫、鲤、鳡等鲤科鱼类亲缘关系较近。实时定量PCR分析表明,淇河鲫MSTN基因在各个组织中均有表达,脑中表达量最高,其次为肌肉和肝脏,肠道表达量最低。淇河鲫胚胎发育的各阶段MSTN基因均有表达,受精卵表达量最高,其次为囊胚期,神经胚期表达量最低。推测MSTN与淇河鲫肌肉发育生长具有一定的相关性,可能参与"双背鲫"特征的形成。     

大黄鱼sox9a/b基因的克隆与表达分析

为探究sox9基因在大黄鱼性别决定与分化过程中的作用,利用RACE方法克隆得到大黄鱼sox9a和sox9b 2个基因,采用实时荧光定量PCR (qRT-PCR)分析其在雌雄个体不同组织和不同发育阶段的表达规律,并检测了其在17β-雌二醇处理后的遗传雄性和17α-甲基睾酮诱导处理后遗传雌性幼鱼中的表达变化。结果显示,大黄鱼sox9a c DNA全长2 442 bp(NCBI登录号:MH996431),包含476 bp 5′UTR、466 bp 3′UTR、1 500 bp ORF,编码499个氨基酸。大黄鱼sox9b cDNA全长为2 199 bp (NCBI登录号:MH996432),包含335 bp5′UTR、415 bp 3′UTR、1 449 bp ORF,编码482个氨基酸。qRT-PCR分析显示,sox9a基因主要在性腺、眼、脑、肝脏中表达,精巢中的表达量显著高于卵巢;sox9b在大黄鱼各组织中广泛表达,但以精巢中表达量最高,而卵巢中只有痕量表达。在鱼苗性腺发育初期,sox9a/b的表达量都维持在较低水平;随着鱼苗长大,sox9a/b的表达量在84 dph、123 dph 2次达到高峰,随后开始下降,10 mph后又逐渐上升。17β-雌二醇处理能够显著下调遗传雄性大黄鱼sox9a和sox9b基因在性腺中的表达,17α-甲基睾酮处理则显著上调遗传雌性大黄鱼sox9a和sox9b基因在性腺中的表达。研究表明,sox9a/b基因与大黄鱼性别发育和分化过程密切相关,对大黄鱼精巢的发育与维持起重要的调控作用,而且两个基因的功能可能具有一定程度的分化。     

淇河鲫雌核发育克隆系鉴定与性状分析

淇河鲫（Carassius auratus）为河南省的传统优质特色水产品种之一,是我国著名的鲫地方品种。本研究利用15个微卫星标记从85尾淇河鲫样品中共鉴定出21个克隆系,在其中6个克隆系中检测到18尾雄性个体。结果表明：淇河鲫是两性型雌核发育三倍体,遗传多样性水平较高。多元统计分析显示：体高、体宽、背鳍基长等3个性状对体质量的影响达到了极显著的水平（P〈0.01）,这一结果与体高背厚的淇河鲫种质较优异的生产经验一致。本研究结果提示：可以借鉴两性型雌核发育方正银鲫育种成功经验来开展淇河鲫品种的选育,在选育过程中应关注淇河鲫体高背厚的形态特点。     

SOST基因在淇河鲫肌间骨骨化过程中的表达研究

为探索硬化蛋白(sclerostin,SOST)基因在淇河鲫肌间骨骨化过程中的调控作用,本研究以淇河鲫仔稚鱼为研究对象,利用整体骨骼染色法对肌间骨的形态发生进行观察,并采用q RT-PCR、Western Blot和免疫组织化学技术检测SOST基因在肌间骨不同骨化阶段的m RNA和蛋白表达变化情况。结果显示,淇河鲫发育至24 dpf(day post fertilization),肌膈中出现纤维束;25 dpf髓弓小骨出现,28 dpf脉弓小骨出现,33 dpf髓弓小骨出现分叉,45 dpf肌间小骨发育完全。SOST基因在肌间骨骨化发生各阶段均有表达,23 dpf的表达量最低(P0.05),随着肌间小骨的骨化发育,SOST基因呈递增趋势,45 dpf表达量显著高于其他骨化阶段(P0.05);SOST蛋白在45 dpf时显著高于23和27 dpf(P0.05),与其他发育阶段无显著差异(P0.05)。SOST m RNA和蛋白变化趋势基本相同,都在23dpf处于最低,肌间骨全部出现后表达量达到最高,与淇河鲫肌间骨的形态发生趋势一致。因此,推测SOST与淇河鲫肌间骨骨化具有一定的相关性,可调控肌间骨的分化和形成。     

半滑舌鳎TRAF6 基因和TAK1 基因的克隆及表达分析

本研究通过同源克隆和RACE技术获得了半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)肿瘤坏死因子受体相关因子6(tumor necrosis factor receptor-associated factor 6,TRAF6)和转化生长因子β激活激酶1(transforming growth factor-β-activated kinase 1,TAK1)的c DNA全长,并分析了其在不同组织和早期胚胎发育时期的表达情况。结果表明,TRAF6 c DNA全长1956 bp,开放阅读框(ORF)为1731 bp,编码576个氨基酸。二级结构预测显示TRAF6具有保守的蛋白结构域:N端的RING结构,两个锌指结构以及C端的环–环(coiled-coil)α螺旋结构和高度保守的MATH同源结构。TAK1 c DNA全长2519 bp,ORF为1731 bp,编码576个氨基酸。TAK1的蛋白结构域包括丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶激活结构域和C端的环–环(coiled-coil)α螺旋结构域。系统进化树分析表明,半滑舌鳎TRAF6和TAK1分别与牙鲆(Paralichthys olivaceus)TRAF6和TAK1聚为一支,亲缘关系最近。荧光定量PCR结果显示,TRAF6和TAK1在所检测的8种组织中都有表达,TRAF6在鳃中的表达最高,肠中也有较高的表达;TAK1在心脏中的表达量最高,其次是肾。TRAF6和TAK1在鳃、肾等免疫器官中的高表达,与其在Toll样受体信号通路中的重要作用是一致的。对TRAF6和TAK1在早期胚胎发育时期的表达情况进行检测,结果显示,在未受精卵中可检测到TRAF6和TAK1,提示了这两种免疫分子的母源性m RNA遗传的可能性。免疫分子母源性m RNA可能参与发育过程,也可能参与构建免疫体系,以保护胚胎或仔鱼免受病原体的侵袭。     

石磺钙调蛋白Os-IP3R和Os-RyR基因的克隆、相对表达量及进化关系

为明确石磺钙通道蛋白1,4,5-三磷酸肌醇受体（IP₃R）基因和蓝尼碱受体（RyR）基因的序列和结构信息,初步研究不同石磺中的Onchidium struma-IP₃R/Onchidium struma-RyR（Os-IP₃R/Os-RyR）基因表达量百分比与石磺系统进化的相关性,实验在瘤背石磺表皮转录组数据库的基础上,克隆得到2条钙通道蛋白基因Os-IP₃R和 Os-RyR,利用生物信息学技术对该基因及所编码蛋白的结构特征进行分析,并通过qRT-PCR技术分析2个基因在瘤背石磺、平疣桑椹石磺和紫色疣石磺各组织中的表达情况。结果显示,Os-IP₃R核酸序列为4 574 bp,包括2 808 bp的开放阅读框,共编码935个氨基酸,预测编码的蛋白有6个跨膜区;Os-RyR核酸序列为1 253 bp,包括1 131 bp的开放阅读框,共编码376个氨基酸,预测编码的蛋白有3个跨膜区。将瘤背石磺IP₃R和RyR的氨基酸序列进行比对,发现位于钙离子通道区的G*R*GGG*GD序列处高度保守;发现3种石磺Os-IP₃R/Os-RyR 的相对表达百分比的高低顺序与各石磺从陆地到浅海的梯度分布趋势相一致,依次为瘤背石磺>平疣桑椹石磺>紫色疣石磺;石磺的陆栖性越强,则Os-IP₃R/Os-RyR 的相对表达百分比越高。不同种石磺的Os-IP₃R/Os-RyR表达量百分比的研究能为分析海洋无脊椎动物由海洋向陆地进化学说提供新的分子生物学线索。     

CYP3A65及上游核受体基因PXR和AHR2在斑马鱼生长发育阶段的表达

为了选择处于最佳生长阶段的斑马鱼用于药物代谢研究,本实验考察不同生长阶段斑马鱼全鱼、肝脏和肠道组织中CYP3A65及其上游核受体基因(PXR、AHR2) mRNA表达水平的变化规律。实验测定CYP3A65、PXR和AHR2相对表达量,并通过比较核受体基因与代谢酶基因mRNA之间的相关性来证实核受体基因的调控作用。结果显示,144 hpf和75 dpf两个生长阶段的斑马鱼中CYP3A65、PXR和AHR2 mRNA表达量最高;斑马鱼生长阶段中代谢酶基因和核受体基因的表达趋势一致,且受肝脏、肠道组织占全鱼比重的影响。研究表明,幼鱼期144 hpf斑马鱼及稚鱼期75 dpf的斑马鱼最适用于CYP3A65代谢研究;CYP3A65与PXR、CYP3A65与AHR2的mRNA表达之间有显著的相关性,与AHR2的相关性更显著。     

半滑舌鳎Dmrt3基因cDNA片段的克隆与表达分析

同源克隆了半滑舌鳎Dmrt3基因的部分cDNA片段,片段长度为228 bp,NJ系统发育树显示,半滑舌鳎Dmrt3基因cDNA片段与红鳍东方鲀、青鳉以及斑马鱼的Dmrt3基因cDNA片段同源性最高,首先聚为一支。实时定量分析了Dmrt3基因在半滑舌鳎雌性和雄性个体的各组织中的表达情况,以及在高温处理和甲基睾酮处理组的雌性、雄性和伪雄鱼的性腺组织中的表达。Dmrt3基因在雌性和雄性的脑、垂体、性腺、肝脏、脾脏、心脏、肾脏7个组织中都有表达,但是表达量有差异,在精巢中的相对表达量高,Dmrt3基因在精巢的表达与其它组织中的表达差异极显著(P<0.01),而在卵巢中的表达很微弱,结果预示Dmrt3基因可能在雄性的性腺发育过程中起着重要的作用。高温处理组的雌性、雄性和伪雄鱼的性腺组织之间Dmrt3的表达无显著差异(P>0.05),但都极显著低于对照组的雄鱼(P<0.01)。高温处理组的伪雄鱼与对照组雌鱼性腺中Dmrt3的表达表达无显著差异(P>0.05)。甲基睾酮处理组的雄鱼和伪雄鱼性腺中Dmrt3的表达都显著高于对照组雄性(P<0.01)。从孵化后43 d到5月龄,Dmrt3的相对表达量很低,7月龄时表达量显著升高,9月龄时达到最高峰,12月龄时表达量下降,这也预示Dmrt3基因在半滑舌鳎性腺的发育过程中起重要作用,可能是促进生殖细胞发育的重要转录因子。     

武汉单极虫生活史中放射孢子虫的发现及鉴定

鲫养殖中粘孢子虫病非常严重,为掌握其病原的感染传播途径,实验通过粘孢子虫生活调查研究,在底栖寡毛类苏氏尾鳃蚓体内发现了一种放射孢子虫。该放射孢子虫的孢子无孢柄;孢体顶面观和侧面观都呈近卵圆形,长(19.8±1.3)μm,宽(18.2±1.1)μm;3个极囊梨形,呈点状聚集分布在孢体顶端,极囊长(4.53±0.4)μm,宽(3.4±0.4)μm;3个尾柄几乎等长,刺状,从孢体基部向下伸展,尾柄间夹角100°,尾柄长(195.0±15.7)μm,宽(11.5±0.8)μm。根据形态特征将其划归为橘瓣放射孢子虫集合类群。18S r DNA序列分析表明该放射孢子虫与鲫体表寄生武汉单极虫为同一物种,序列相似率为99.8%~100%。序列系统发育分析进一步发现单极虫类群中多数种类的放射孢子虫阶段主要寄生在苏氏尾鳃蚓体内。本研究首次发现和报道了鲫寄生武汉单极虫生活史中寡毛类宿主及其放射孢子虫的形态特征,为鲫粘孢子虫病生态防控提供重要的基础资料。     

我国鲫种群遗传多样性及起源进化研究进展

鲫分为指名亚种和银鲫亚种,是我国重要的淡水养殖对象,具有较高的经济价值。鲫适应性较强、分布地区广泛、遗传背景复杂且具有不同的形态和倍型。目前,众多学者运用多种方法对不同鲫的遗传多样性及起源、进化进行了大量研究。但研究方法、研究对象和标准之间的差异,使得结果之间存在较大分歧。本文对我国的鲫资源、遗传多样性及不同鲫的起源进化进行归纳总结,发现我国野生鲫种质资源丰富,不同野生鲫地方群体的遗传变异度较大,遗传多样性处于比较丰富的状态,具有较大的育种潜力。银鲫同一雌核发育系表现出高度的遗传同质性,但不同发育系之间存在丰富的遗传变异,表现出较高的遗传多样性。而按照人类自身喜好选育而成的金鱼,群体遗传多样性则远低于野生鲫群体。本文对于银鲫、彭泽鲫、其他鲫及金鱼的起源与进化也进行了探讨。银鲫的起源虽然存在争议,但大多数的研究结果还是支持"银鲫与鲫属于一级亲缘关系,应归于同一个种,三倍体银鲫是在特殊环境下从鲫中分化出来的种群"这一观点。彭泽鲫可能是从养殖银鲫的池塘中逃逸而进入天然水域的外源鱼,也可能是起源于具有明显生长优势的野生鲫,并因其优良性状而被选育出来。彭泽鲫不同雌核发育系的发现,使得彭泽鲫与银鲫...     

基于微卫星标记的洞庭青鲫倍性鉴定

洞庭青鲫产于湖南省澧县北民湖,因个体大且背部青灰而得名,其快速生长的特性和异于普通鲫的体型令作者怀疑前人报道的"二倍体群体"结果。为此,从银鲫微卫星文库中筛选9个位点构建微卫星鲫倍性鉴定体系,同时采用流式细胞术和染色体核型分析完成了洞庭青鲫倍性鉴定。结果显示,建立的微卫星鲫倍性鉴定体系能够100%区分二倍体、三倍体和四倍体鲫,微卫星基因分型结果显示136尾洞庭青鲫均为三倍体,各位点的等位基因数为1～3,样本基因型包括AAA、AAB/ABB、ABC 3种类型;洞庭青鲫血细胞DNA平均含量为159.42±5.64,与二倍体红鲫的血细胞DNA平均含量(102.43±3.54)比值(DI)为1.56∶1;流式细胞术与微卫星体系判定结果匹配度100%;染色体核型分析显示洞庭青鲫染色体数为3n=156±,核型公式为3n=39m+36sm+81sta,NF=231。建立了适用于鲫倍性鉴定的微卫星标记体系,且系统地证实了洞庭青鲫为三倍体鲫品种。     

金鱼生殖细胞多倍化现象分析

通过精巢染色体制片观察金鱼的生殖细胞染色体数,结合流式细胞仪测定成熟精子DNA含量,探讨了金鱼生殖细胞发生过程中染色体特征及产生的精子的倍性。结果表明,金鱼初级精母细胞大部分行正常减数分裂,形成50个二价体,另外还发现17.0%分裂相的二价体数呈现不同程度的加倍现象,观察到了二价体数为100、150、200、250、300,甚至远远超过300的分裂相,与鲫鲤远缘杂交导致生殖细胞染色体数加倍一致,不一样的是金鱼稳定产生DNA含量减半的精子。结果表明,近缘杂交和远缘杂交都可以导致生殖细胞染色体数加倍,但是否能产生染色体数加倍的功能性配子与杂交亲本亲缘关系的远近有关。     

草金鱼感染拟态弧菌后脾脏和肠黏膜组织的差异蛋白组学

为探讨鱼类感染拟态弧菌后脾脏和肠黏膜组织蛋白差异变化,本研究以拟态弧菌04-14分离株人工感染实验动物草金鱼,利用双向电泳(2-DE)结合质谱技术对感染前后脾脏和肠黏膜组织的差异蛋白组学进行研究。结果显示,感染后脾脏和肠黏膜组织中分别有11个和12个显著差异表达蛋白点,经MALDI-TOF-MS质谱鉴定出19种显著差异表达蛋白,其中上调表达蛋白10种,下调表达蛋白9种,α-淀粉酶、载脂蛋白A-I、β-肌动蛋白和过氧化物还原酶2为两种组织中共同存在的显著差异表达蛋白。GO注释分析表明,显著差异表达蛋白分别定位于细胞外区、细胞质、线粒体和内质网,具有结合、转运、催化、免疫、抗氧化和细胞骨架等分子功能,参与物质与能量代谢、细胞膜转运、补体活化、应激反应、细胞与膜骨架组建、蛋白质折叠、氧化还原及铁离子运输等8个生物学过程。研究结果为进一步研究拟态弧菌的致病机制及其与宿主互作机制奠定了基础。     

鲫皮肤蛋白质组双向电泳与部分蛋白点的质谱鉴定

为了建立鱼类皮肤蛋白质组双向电泳图谱及质谱鉴定,以鲫为实验动物,采用蛋白双向电泳(2-DE)结合基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF/TOF-MS)技术,进行鲫皮肤的蛋白质组学研究。结果表明,当上样量为800μg,采用18 cm、p H3~10 IPG胶条,等电聚焦80 000 Vh,2-DE图谱检测为214个皮肤蛋白点,匹配率达88%;对其中31个蛋白点进行MS/MS鉴定为22种蛋白,包括肌球蛋白、肌动蛋白、角蛋白、锌指蛋白585B、效应蛋白Rab15、卷曲螺旋结构域蛋白168、NCK1相关蛋白,肌酸激酶、烯醇化酶、丙酮酸脱氢酶、腺苷酸激酶同工酶等;进行蛋白功能聚类(GO)分析发现12种生物学过程,主要参与代谢、细胞、有机体、免疫应答、生物调节和信号等过程。本研究首次初步揭示鲫皮肤蛋白质组及分子机制,以期为鱼类病害的预防和治疗提供科学参考。