温度与条锈病菌双胁迫下小麦内参基因的选择

 选择合适的内参基因是采用实时定量PCR研究基因表达获得可信数据的关键。以小麦在条锈病菌及温度双因素胁迫为研究对象,采用实时荧光定量PCR评价了CDC、RLI、ACTIN和26S基因的表达情况,采用geNorm和NormFinder软件进行了比较分析。结果表明,小偃6号小麦在常温(15℃±1℃)未接种条锈病菌,以及接种条锈病菌并培育至花斑期分别在高温(20℃±1℃)、变温(20℃到15℃)条件处理中,基因RLI表达不稳定,基因ACTIN在常温条件下以及在条锈病菌及高温处理条件下的表达量相对稳定,但在变温条件下波动较大。表达最稳定的基因是26S,其次是CDC基因,它们可以作为小偃6号-CYR32-温度互作体系中基因表达实时荧光定量PCR研究的内参基因,26S和CDC是最佳内参基因组合。     

稻粒黑粉病菌实时荧光定量PCR内参基因筛选

 实时荧光定量PCR是一种被广泛应用于基因表达研究的分子技术,内参基因的选择对试验结果的可靠性起重要作用。稻粒黑粉病是一种全球性水稻真菌病害,目前没有关于稻粒黑粉病菌内参基因的报道。本文选择6个常用内参基因,对其在稻粒黑粉病菌不同菌株、不同生活史阶段和不同浓度Basta处理3组生物学样本中的稳定性进行比较分析。经geNorm3.5、NormFinder0.953及BestKeeper1.0软件综合评价,结果显示在不同菌株、不同生活史阶段、不同浓度Basta处理生物学样本中,最稳定的内参基因分别为UBQ、GAPDH和EF1α,最优组合分别为UBQ/GAPDH、UBQ/GAPDH和EF1α/GAPDH。本研究结果为稻粒黑粉病菌基因表达研究奠定了基础,同时对其他真菌内参基因的选择提供了参考。     

龟裂链霉菌M527荧光定量PCR内参基因的选择及其稳定性评估

龟裂链霉菌Streptomyces rimosus M527是龟裂霉素（rimocidin）的生产菌,其对多种植物病原真菌具有较强的拮抗作用。为从转录水平分析菌株M527以及其抗性突变株中龟裂霉素的合成调控机制,荧光定量PCR内参基因的选择与稳定性评估显得尤为重要。本研究选用16S rRNA_sr、hrdB_sr、rpoA_sr、sigF_sr、sigB_sr、gyrB_sr这6个基因作为候选内参基因,使用geNorm、NormFinder、BestKeeper三个软件分析在野生型龟裂链霉菌M527、高产龟裂霉素抗性突变株M527-GR7和低产龟裂霉素抗性突变株M527-GR21中候选内参基因的稳定性,筛选出稳定性最高的内参基因。结果显示,sigB_sr基因在菌株M527及抗性突变株M527-GR7和M527-GR21中表达稳定性最好。通过以基因sigB_sr、16S rRNA_sr、rpoA_sr为内参基因,检测龟裂霉素生物合成基因簇中的结构基因rimG_sr在菌株M527-GR7中不同时间的相对表达量,发现基因sigB_sr作为内参基因时能得到更准确的结果。     

几个常用内参基因在淀粉酶产色链霉菌1628抗药性突变株中稳定性的评估

淀粉酶产色链霉菌Streptomyces diastatochromogenes 1628是一株重要的生防菌株,其代谢产物对多种植物病原真菌具有较强的抑制效果。为了筛选在其不同抗药性高产突变株中均能稳定表达的内参基因,选择16S rRNA、sigB、hrdB、thyA、gyrB和rpoA共6个常见内参基因,分别探究它们在野生型菌株、链霉素抗性突变株、利福平抗性突变株和巴龙霉素抗性突变株中的表达情况,并用geNorm软件和NormFinder软件对结果进行分析。结果表明,使用不同软件分析得出的最佳内参基因略有差异。geNorm软件认为在上述4株菌株中,表达最稳定的内参基因分别是gyrB、gyrB、thyA、rpoA;而NormFinder软件认为rpoA基因在所有菌株的表达都是最稳定的。利用平均等级的算法平衡两个软件的分析差异,最终确定rpoA基因为表达最稳定的内参基因。通过检测toyG基因的表达水平,发现以rpoA作为内参基因能得到更合理的结果。     

茶刺蛾幼虫的发育起点温度和有效积温

为了解温度对茶刺蛾[Iragoides fasciata(Moore)]幼虫发育的影响,在20、24、26、28、30和32℃6种恒温条件下,测定了各龄幼虫的发育历期,计算发育起点温度和有效积温。结果表明,20~30℃时幼虫发育历期随温度的升高而缩短;1~7龄幼虫和整个幼虫期的发育起点温度分别为17.0、5.1、11.3、11.8、11.6、10.3、10.0和10.8℃,有效积温分别为13.3、87.7、60.0、60.8、70.2、81.3、101.5和466.3日·度。     

不同温度对牧草盲蝽种群生长发育和繁殖的影响

应用生命表技术研究了13、18、23、28和33℃温度条件下以菜豆为食物的牧草盲蝽的生长发育和繁殖情况。结果表明:在13~33℃,牧草盲蝽发育速率随着温度的升高而加快,并符合Logistic模型;牧草盲蝽若虫、世代的发育起点温度分别为7.49℃和10.21℃,有效积温分别为323.62日·度和393.7日·度;在试验温度范围内,23℃时牧草盲蝽的若虫期存活率最高(75%),33℃时存活率最低(41%)。18~28℃为最适温区,较低的温度(13℃)和较高的温度(33℃)不利于牧草盲蝽的存活。     

温度胁迫对荒漠昆虫小胸鳖甲(鞘翅目:拟步甲科)幼虫热激蛋白基因hsp70表达的影响

热激蛋白在昆虫响应环境胁迫中发挥作用,然而在准噶尔盆地的拟步甲科特有种小胸鳖甲Microdera punctipennis幼虫对环境的适应过程中热激蛋白如何发挥作用尚不清楚。本研究利用实时荧光定量PCR(qRTPCR)技术测定了高低温处理后小胸鳖甲各龄幼虫热激蛋白hsp70基因的表达变化,以探讨小胸鳖甲幼虫hsp70对温度胁迫的响应方式。结果显示,在6-7龄幼虫中hsp70基因的表达水平是5龄之前幼虫的3-5倍,表明hsp70具有发育阶段性差异表达;各龄幼虫经42℃高温处理1 h后hsp70基因的表达量都迅速增加并达到高峰,其中2-5龄的响应非常强烈,可达对照的一千至数千倍;冷驯化低温5℃和10℃对不同龄期幼虫hsp70表达的影响有所不同,其中1龄和4龄幼虫对5℃和10℃均有上调响应,且1龄的响应程度远高于4龄;而7龄幼虫的hsp70表达则受5℃抑制,在10℃短时间内受到诱导,长时间则受到抑制;耐寒性测定结果显示,1龄和7龄幼虫无冷驯化现象,而4龄幼虫经过5℃或10℃冷驯化2 h可使其在-10℃的存活率提高25%,表明hsp70基因表达与小胸鳖甲耐寒性无直接相关性。本研究结果将有助于全面认识HSP70在荒漠昆虫环境适应性中的作用机制。     

马铃薯甲虫热激蛋白基因Ld-hsp90的克隆及温度胁迫下的表达

马铃薯甲虫Leptinotarsa decemlineata是一种抗逆性极强的世界性检疫害虫,对温度胁迫具有很强的适应性,为进一步明确其对温度胁迫适应性的分子生态机制,采用RT-PCR及RACE技术克隆得到了1个hsp90基因的cDNA全长序列,命名为Ld-hsp90,并利用实时荧光定量PCR技术检测其在温度胁迫后相对表达量的变化。Ld-hsp90全长为2 489 bp,开放阅读框(ORF)长度为2 160 bp,编码719个氨基酸,理论等电点为4.98,分子量约为82.09 kD,5'端与3'端非编码区长度分别为113 bp和216 bp。氨基酸序列中含有HSP90家族的5个签名序列及胞质特征序列MEEVD。实时荧光定量PCR检测结果显示:38℃和44℃高温热激1 h,马铃薯甲虫成虫体内的Ld-hsp90的表达量均显著高于对照组,而0℃与-10℃低温处理1 h后的表达量与对照组均无显著差异。研究表明Ld-hsp90的上调表达在马铃薯甲虫抗高温中起着重要的作用。     

棉铃虫CYP9G5基因的克隆、序列分析及溴氰菊酯胁迫表达

细胞色素P450是超基因家族,属于生物体内重要三大解毒酶系之一,参与内源物和外源物的合成与氧化代谢。本文通过棉铃虫溴氰菊酯短期胁迫转录组数据分析,克隆获得一条P450基因CYP9G5（GenBank：KM016757.1）,编码493个氨基酸,分子量约为57.930 kDa,理论等电点pI 7.16。通过实时荧光定量技术,分析CYP9G5基因在棉铃虫不同组织和溴氰菊酯处理后表达量的变化,发现CYP9G5在头部表达量最高,经过溴氰菊酯处理后CYP9G5表达量也显著升高。推测出CYP9G5极有可能参与棉铃虫对溴氰菊酯的代谢,可能对棉铃虫的耐药性有一定的作用。本研究为进一步探索棉铃虫的抗药性和新农药的开发奠定了基础。     

饥饿胁迫下黑肩绿盲蝽转录组分析及S6K基因功能分析

为扩大黑肩绿盲蝽Cyrtorhinus lividipennis的人工繁殖规模,利用RNA-seq技术对饥饿胁迫2 d的黑肩绿盲蝽雌成虫进行转录组测序分析,筛选参与生殖调控的相关信号通路,挖掘直接或者间接影响生殖的相关基因,采用实时荧光定量PCR（real-time fluorescence quantification PCR,qRT-PCR）对筛选的相关基因进行验证,并通过试验分析沉默S6K基因和饥饿处理对黑肩绿盲蝽生殖的影响。结果显示,与取食褐飞虱Nilaparvata lugens卵（CK）的黑肩绿盲蝽相比,饥饿处理2 d的黑肩绿盲蝽雌成虫有11 675个基因差异表达,其中有4 264个基因表达量上调,7 411个基因表达量下调。共筛选到7条与生殖调控相关的信号通路和6个与生殖调控相关的基因,除TSC2基因表达量上调外,其他S6K、INSR、Akt、HSP70-1、HSP70-2五个与生殖相关基因的表达量在7条生殖相关信号通路中均下调。qRT-PCR检测结果与转录组测序结果一致,说明转录组分析结果可靠。沉默S6K基因后,黑肩绿盲蝽雌成虫脂肪体和卵巢蛋白质含量、Vg基因表达量、雌成虫产卵量和Vg含量较对照显著降低。此外,饥饿处理2 d后黑肩绿盲蝽雌成虫产卵量也较对照显著减少。表明饥饿胁迫后黑肩绿盲蝽雌成虫的生殖相关通路可能受多个信号通路调控,S6K表达量下降显著影响黑肩绿盲蝽的生殖。     

腰果角盲蝽气味结合蛋白基因HtheOBP3的克隆及组织表达分析

为明确腰果角盲蝽Helopeltis theivora气味结合蛋白3(odorant binding protein 3,OBP3)功能及其嗅觉感受机制,利用PCR技术结合c DNA末端快速扩增（rapid amplification of c DNA ends,RACE）技术克隆其cDNA全长序列,利用多个生物信息学软件对其进行序列分析,并通过实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,qPCR)技术检测其在腰果角盲蝽成虫不同组织中的表达量。结果显示,腰果角盲蝽HtheOBP3基因（GenBank登录号为QHI06949）开放阅读框为474 bp,编码157个氨基酸残基,预测蛋白分子量约为17.15 kD,等电点为5.14,无信号肽和跨膜结构,蛋白氨基酸序列中具有6个保守半胱氨酸残基和性信息素结合蛋白-普通气味结合蛋白（pheromone binding protein-general odorant binding protein,PBP-GOBP）家族的保守结构域。HtheOBP3蛋白具有6个α-螺旋和3对二硫键,其中5个α-螺旋形成1个结合口袋。腰...     

高温胁迫下绿豆象内参基因筛选及其Hsp70基因的表达特性

为明确Hsp70蛋白在绿豆象Callosobruchus chinensis高温耐受性中的作用,该研究筛选并克隆β-actin、α-tubulin、β-tubulin、EF1-α、GAPDH、Hsc70、AK和RPL40八个候选内参基因,采用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)技术测定其在绿豆象雌雄成虫体内的表达量,通过geNorm、BestKeeperr和NormFinde软件对这8个候选内参基因的表达稳定性进行评价,选择最适宜的内参基因对不同高温胁迫下绿豆象体内Hsp70基因的表达特性进行测定。结果表明,8个候选基因引物均有良好的特异性和引物扩增效率,引物扩增效率介于91.6%～108.1%之间。高温胁迫下,β-tubulin基因较其他7个候选基因有较小的平均变异度、稳定值和标准差,为最适宜的内参基因。39、42和45℃高温处理1 h后绿豆象雌雄成虫体内Hsp70表达水平较对照显著上调,当处理时间延长至3 h后,Hsp70基因的相对表达量较对照也有不同程度上调,但差异不显著,表明绿豆象Hsp70基因可以响应高温胁迫,Hsp70蛋白在绿...     

梨网蝽触角嗅觉相关基因分析

为阐明梨网蝽Stephanitis nashi对其寄主植物的化学感受机制,本研究采用高通量测序平台对梨网蝽成虫触角进行转录组测序,基于7大数据库对转录组数据进行基因功能注释,筛选获得梨网蝽的主要嗅觉相关基因并进行生物信息学和系统进化树分析。结果表明:共获得28 017条unigenes,长度在1 000 bp以上的unigenes有9 921条;通过与7大数据库进行BLAST比对,梨网蝽触角转录组数据中的17 891条unigenes被成功注释;在已成功注释的unigenes中,鉴定得到12个OBP基因和17个CSP基因,其中OBP基因所编码的蛋白有6个属于Classic家族;而CSP基因所编码的蛋白全部具有4个保守的半胱氨酸位点,符合昆虫CSP基因的结构特征。进化分析结果显示,梨网蝽6个OBP基因的氨基酸序列与其他昆虫OBP基因的氨基酸序列聚为3个分支;梨网蝽16个CSP基因与其他昆虫CSP基因的进化树也聚为3个分支。     

荻草谷网蚜体内杀虫剂抗性相关基因的分析及其功能验证

为了解荻草谷网蚜Sitobion miscanthi体内与杀虫剂靶标和代谢抗性相关的基因信息及其在不同发育阶段的表达情况,通过转录组测序选出不同发育阶段差异性表达的抗药性相关基因,并采用荧光定量PCR和RNA干扰技术对选取的5个抗药性相关基因进行功能验证。结果显示,共获得与杀虫剂靶标和代谢相关基因374个,其中在3龄若蚜体内上调表达基因有129个。CAT-3、CYP6A13-2、CYP4g15-2和nAChR α2-3基因在3龄若蚜、无翅成蚜和有翅成蚜体内的表达量比在1龄若蚜体内的表达量均显著上调。GST1-1基因在3龄若蚜和有翅成蚜体内的表达量比在1龄若蚜体内的表达量显著上调。荻草谷网蚜3龄若虫经吡虫啉处理后,CAT-3、CYP6A13-2、CYP4g15-2和GST1-1的表达量均显著上调,而nAChR α2-3的表达量显著下调。沉默CAT-3、CYP6A13-2、CYP4g15-2及GST1-1后蚜虫对吡虫啉的敏感度增加,而沉默nAChRα2-3后蚜虫对吡虫啉的敏感度降低,表明CAT-3、CYP6A13-2、CYP4g15-2、nAChR α2-3和GST1-1这5个基因均可能与...     

三叶草斑潜蝇hsp70的克隆及其表达量在高低温胁迫下的变化

为了明确高低温胁迫对三叶草斑潜蝇hsp70表达量的影响,采用RT-PCR和RACE技术获得了1条三叶草斑潜蝇诱导型热激蛋白基因hsp70,命名为Lthsp70-1,并利用实时荧光定量PCR技术检测其在温度胁迫后的表达量.该基因的开放阅读框为1923 bp,编码640个氨基酸.氨基酸序列中含有HSP70家族的签名序列IFDLGGGTFDVSIL和IVLVGGSTRIPK、DnaK特征基序IDLGTT(Y)S(C)V、非细胞器基序RARFEEL,以及C末端的保守序列EEVD.实时荧光定量PCR结果显示:成虫在31～33℃范围内,其hsp70表达量随温度升高而上升,33℃时达到最高峰;35～39℃时,hsp70表达量迅速下降;蛹经0℃胁迫0.5～2.0 h,其hsp70表达量随时间延长呈上升趋势.由此可见,高低温胁迫均能诱导三叶草斑潜蝇hsp70的表达.     

饥饿及取食不同植物后莲草直胸跳甲消化酶差异表达基因筛选

为探究莲草直胸跳甲Agasicles hygrophila体内与寄主专一性相关的消化酶基因,利用前期构建的转录组数据库筛选差异表达的消化酶基因,采用实时荧光定量PCR检测饥饿及取食喜旱莲子草Alternanthera philoxeroides、莲子草Al. sessilis、甜菜Beta vulgaris、莙荙B. v. var. cicla后莲草直胸跳甲成虫体内差异表达消化酶基因的表达量。结果显示,转录组分析共搜索到221个与消化相关的基因,主要编码脂肪酶和蛋白酶;进一步筛选到编码蛋白酶、脂肪酶和糖酶3大类的26个差异表达的消化酶基因。与取食寄主植物喜旱莲子草相比,取食不同非寄主植物和饥饿处理后莲草直胸跳甲成虫体内消化酶基因表达量发生显著变化。除β-半乳糖苷酶(β-galactosidase,β-Gal)基因外,取食不同植物及饥饿处理后莲草直胸跳甲成虫体内4个胰蛋白酶(trypsin,Try)、5个氨肽酶(aminopeptidase,Am)、8个脂肪酶(lipase,Lip)、5个β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase,β-Glu)和1个α-葡萄糖苷酶(α-glucosida...     

东亚小花蝽对茶棍蓟马成虫的捕食功能

为明确东亚小花蝽Orius sauteri对茶棍蓟马Dendrothrips minowai的捕食作用和生物防治潜能,于室内系统研究东亚小花蝽3～5龄若虫和成虫对茶棍蓟马雌成虫的捕食行为、捕食功能反应、搜寻效应、自身干扰反应及两者之间的相互干扰效应。结果表明,东亚小花蝽取食单头茶棍蓟马雌成虫的时间随着自身发育阶段的增大而变短,成虫取食时间最短,为7.40 min。在一定的猎物密度范围内,东亚小花蝽3～5龄若虫与成虫对茶棍蓟马的捕食作用均符合HollingⅡ功能反应模型,东亚小花蝽3～5龄若虫与雌成虫的捕食量均随猎物密度的增加而升高。东亚小花蝽雌成虫对茶棍蓟马雌成虫的瞬时攻击率、捕食能力和日最大捕食量均最高,分别为0.459、124.05和250.00头。东亚小花蝽对茶棍蓟马的捕食量与猎物密度呈正相关,但搜寻效应与猎物密度呈负相关,且东亚小花蝽雌成虫的搜寻效应最高。东亚小花蝽对茶棍蓟马的捕食作用同时受自身密度的影响,随着自身密度的增大其平均捕食率降低。东亚小花蝽成虫的捕食作用率随着自身密度和猎物密度的增大而降低。表明东亚小花蝽对茶棍蓟马有较好的生物防治潜能。     

烟蚜热激蛋白Hsp90基因的克隆及在UV-B胁迫下的表达分析

为探讨UV-B胁迫对烟蚜Myzus persicae热激蛋白Hsp90基因表达量的影响,采用RT-PCR与RACE技术克隆了烟蚜热激蛋白Hsp90基因的全长,并对其进行生物信息学分析,利用实时荧光定量PCR技术研究了烟蚜Hsp90基因在不同时长UV-B胁迫下的表达量变化。结果表明,烟蚜Hsp90基因的cDNA全长为2 670 bp,编码728个氨基酸,编码蛋白质的相对分子量为82.6 kD,等电点为4.95,获得的氨基酸序列具有Hsp90蛋白家族的1个签名序列及C末端MEEVD基序,推测其属于胞质型热激蛋白。系统进化树结果显示,烟蚜Hsp90与其它昆虫Hsp90具有很高的相似性。实时荧光定量PCR结果表明,不同时长UV-B胁迫下烟蚜Hsp90均有表达,随着照射时间延长,Hsp90表达量表现为先上升后下降的趋势;与对照相比,照射时间为15、30、60、90和120 min时,Hsp90表达量均显著升高,且在60 min时Hsp90表达量达最大,是对照组的2.05倍。表明Hsp90基因在不同时长UV-B胁迫下差异表达,在烟蚜适应紫外胁迫的分子机制中具有重要作用。     

实时荧光定量PCR法检测十字花科细菌性黑斑病菌

为有效防控我国的检疫性有害生物十字花科细菌性黑斑病菌Pseudomonas syringae pv.maculicola在国内的传播与蔓延,通过设计1对特异性引物3539,利用132株靶标和非靶标菌为模板进行PCR扩增,建立了实时荧光定量PCR法,并进行了模拟种子带菌试验。结果显示,引物3539为只针对十字花科细菌性黑斑病菌扩增出的特异性产物;在模拟种子带菌检测中,常规PCR对菌悬液的检测限为10~5CFU/m L,实时荧光定量PCR的检测限为10~3CFU/m L,其中10~8CFU/m L菌液的Ct值最低,为22.90,10~3CFU/m L菌液的Ct值最高,为35.73,且不同浓度菌液间的Ct值均有显著差异;不同带菌率模拟种子的检测结果表明,常规PCR和实时荧光定量PCR能检测到的带菌率分别为0.5%和0.1%。研究表明,实时荧光定量PCR法不仅可用于病种的检测,也可用于病害的早期诊断。     

温度诱导对星豹蛛热激蛋白hsp70和hsp90基因表达的影响

为探讨温度诱导对星豹蛛的应激反应,运用实时定量PCR法测定了不同温度对星豹蛛热激蛋白hsp70和hsp90基因表达量的影响。结果表明:经过17、20、23、26℃诱导后,星豹蛛hsp70和hsp90基因表达量与对照组差异不显著,当高于26℃时,随着温度的升高表达量呈先升高后降低的趋势,且在38℃时最高,分别为对照组的716.46和10.44倍,差异显著;低于17℃时,表达量随着温度的降低呈逐渐升高的趋势,其中-1℃时最高,分别为对照组的334.53和9.38倍,差异显著;-1~41℃范围内,在相同诱导温度处理下,星豹蛛hsp70基因表达量显著高于hsp90基因。表明当星豹蛛受到温度高于26℃或低于17℃的刺激后,体内hsp70和hsp90基因表达量均增加,且hsp70基因表达量高于hsp90基因。说明热激蛋白只有在极端高温和低温的条件下才充分表达,从而对机体产生保护作用,且这种保护只在一定温度范围内起作用。