家蚕对浓核病毒(镇江株)抵抗性和感受性品种的中肠组织蛋白比较分析

为了探明家蚕对浓核病毒(镇江株)抵抗性和感受性品种间在分子机制上的差异,通过蛋白质双向电泳(2-DE)和基质辅助质量飞行时间质谱技术(MALDI-TOF MS)对两个不同抗性家蚕品种的中肠组织蛋白进行了比较分析。2-DE电泳结果表明,两个品种间的中肠组织蛋白斑点数及位置、形态等差异很小,进一步比较获得了9个差异蛋白斑点,其中感受性蚕品种JS有6个,抵抗性蚕品种NIL有3个。经MALDI-TOF MS鉴定结果显示,感受性品种JS有4个差异蛋白斑点可能分别为氢离子转运ATP合酶β亚基1、氢离子转运ATP合酶β亚基2、组织蛋白酶D或3-羟酰辅酶A脱氢酶;抵抗性品种NIL中有2个差异蛋白点可能是组织蛋白酶。     

家蚕感染浓核病毒(镇江株)晚期的中肠和血液组织蛋白变化

为了进一步探明家蚕浓核病毒(镇江株)对家蚕的致病机制,通过蛋白质双向电泳技术对家蚕感染浓核病毒晚期的中肠和血液组织蛋白进行了分析。结果表明,感受性蚕品种在感染浓核病毒晚期,其中肠、血液组织蛋白量急剧下降,有近30%的蛋白点消失,其余蛋白点的含量也大幅下调达50%以上。由此说明由于浓核病毒侵染破坏了家蚕中肠上皮组织以及中肠的消化吸收功能,阻断了营养物质的输入,进而极大地减少了蚕体自身组织蛋白的合成。     

家蚕品种对细胞质型多角体病毒感染抵抗性的初步研究

家蚕中肠型脓病。是我国养蚕生产上危害最大的蚕病之一。为了从家蚕品种角度给本病防治提供基础资料,作者于1973—1974年初步研究了家蚕品种对细胞质多角体病毒(CPV)感染抵抗性测定方法;先后对50多个家蚕品种纯种和杂交组合的抵抗性作了测定和比较;估算了家蚕品种对CPV感染抵抗性同其他经济性状的相关性。     

家蚕浓核病毒中国(镇江)株基因组的克隆及重组质粒转染家蚕对浓核病毒的拯救

家蚕浓核病毒中国(镇江)株(BombyxmoriDensovirus Zhenjiang Strain,BmDNV-ZJ)包含VD1和VD2共2种基因组DNA。以BmDNV-ZJ感染家蚕中肠总DNA为模板,采用PCR方法扩增得到2种DNA,并将其克隆到质粒pGEM-T构建了重组质粒pGEM-VD1和pGEM-VD2。采用DEAE-dextran转染技术,将2种重组质粒分别导入家蚕幼虫体内,能使家蚕幼虫发病,免疫双向扩散和免疫酶组化法检测都能检出阳性反应,但转染pGEM-VD2重组质粒的家蚕幼虫发病率较低。通过重组质粒转染方法,可以使BmDNV-ZJ感受性品种和抵抗性品种都发病,但感受性品种的发病率较高。将重组质粒转染发病蚕的中肠匀浆,取上清液经口接种健康蚕幼虫,也能使其发病。上述结果表明,携带BmDNV-ZJ DNA的重组质粒在家蚕幼虫体内拯救出了感染性的病毒粒子。     

BmNPV抗性差异蚕品种感染病毒后的中肠蛋白质组变化分析

为了了解家蚕受BmNPV侵染后中肠蛋白质组变化规律,探讨家蚕抗BmNPV的基因。经过对秋丰、白玉等9个不同系统的家蚕品种抗性比较试验,筛选获得BmNPV感染发病率相差72个百分点的抗性品种P50和感性品种306。采用蛋白质双向电泳技术分析比较了P50和306两品种经口接种BmNPV当天（5龄第1天）的家蚕与第4天（5龄第4天）家蚕的中肠组织蛋白质变化图谱,结果发现这两个品种感染病毒当天各有10个互不相同的特异蛋白斑点,感染第4天后306品种发现33个特异蛋白斑点,P50发现14个特异蛋白斑点,两品种的特异蛋白斑点也各不相同。这些蛋白斑点可能分别与抗性品种的抗性和感性品种的易感性有关。     

家蚕中肠细胞与家蚕核型多角体病毒经口感染因子P74的互作蛋白筛选

家蚕核型多角体病毒(Bm NPV)包涵体衍生型病毒粒子(ODV)被家蚕幼虫食下后通过侵染中肠上皮细胞引发全身性感染,这个过程称为经口感染。已知有多种ODV囊膜蛋白在经口感染中发挥关键作用,被称为经口感染因子(PIF)。P74作为最早被鉴定的PIF,与ODV结合中肠上皮细胞有关。为了鉴定宿主家蚕中肠细胞中与P74互作的蛋白质,构建家蚕中肠酵母文库,并以P74作为诱饵进行酵母双杂交筛选。初步筛选到7种互作候选蛋白,分别为U3小核仁核糖核蛋白IMP3、60S核糖体蛋白L5、JAB-MPN结构域蛋白、细胞质肌动蛋白A3、35 k D蛋白酶、富半胱氨酸和组氨酸蛋白1-B和真核翻译起始因子1A。免疫共沉淀实验结果表明JAB-MPN结构域蛋白和P74之间存在强烈互作,该蛋白质可能是ODV结合中肠细胞的关键宿主因子。研究结果为进一步阐明Bm NPV经口感染的详细分子机制提供了新的线索。     

家蚕氨肽酶N家族基因在5龄幼虫中肠组织的表达分析

氨肽酶N(aminopeptidase N,APN)是一种偏好水解蛋白质或寡肽N端中性氨基酸的酶,在鳞翅目昆虫中主要分布于中肠上皮细胞的刷状缘囊膜上,是苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)伴孢晶体(Cry)毒素的重要受体蛋白。为了研究家蚕APN家族基因的表达特征,运用Real-time PCR技术检测分析该家族基因在不同家蚕品种幼虫中肠组织的表达差异以及同一家蚕品种幼虫中肠组织中该家族基因各个成员的表达丰度。在所有供试家蚕品种的幼虫中肠组织均可检测到APN家族基因的表达,但不同化性家蚕品种间APN基因的表达水平存在显著差异(P<0.05),而相同化性品种间的差异较小(P>0.05);在同一家蚕品种幼虫中肠组织中,APN2、APN4、APN5基因的表达量较高,而APN1及APN3基因的表达量较低。研究结果有助于进一步研究家蚕APN家族基因的作用机制,并为家蚕抗Bt品种的选育提供理论依据。     

关于家蚕对CPV感染抵抗性的研究——Ⅱ.与感染病毒前后饲育温度的关系

本试验用桑叶育蚕和人工饲料无菌育蚕为供试材料,分别添食经表面消毒和未经表面消毒的中肠型脓病多角体(CPB)悬浮液,调查家蚕对中肠型脓病病毒(CPV)的感染抵抗性与感染病毒前后饲育温度的关系。证实了:(1)温度对家蚕CPV感染抵抗性的影响主要是感染病毒前的温度,当温度达到33℃时,无论对稚蚕或壮蚕都有一定的影响,而在21—29℃范围内,尚看不到有什么明显的影响。但高温对家蚕CPV感染抵抗性影响程度无笔者以前研究报道的对NPV感染抵抗性影响大;(2)添食病毒后的不同饲育温度,对家蚕感染发病的影响不大,当置于33℃下饲育时,对CPV的感染发病反有明显的抑制作用。但与此同时,却出现不少虚弱的软化症状蚕;(3)4眠眠中用高温保护,则使时间不长,但对家蚕CPV感染抵抗性却有明显影响;(4)4龄起蚕在25℃下经24小时饥饿后对CPV的感染抵抗性明显与饥饿中温度有关,25℃以上随温度的增高而明显下降,21℃与25℃间无明显变化。     

家蚕对病毒感染抵抗性生理生化机制研究综述

本文介绍了近年在家蚕对病毒(CPV、NPV、IFV、DNV)感染抵抗性生理生化机制方面的研究进展。包括家蚕不同品种、不同发育阶段对病毒感染抵抗性的生理生化机制和不同伺育温度、不同叶质影响家蚕对病毒抵抗性的生理生化机制以及绝食饥饿、低温刺激引起家蚕对病毒抵抗性下降的生理机制。     

利用酵母双杂交系统筛选BmNPV PE38的互作蛋白

利用酵母双杂交技术,以家蚕核型多角体病毒(BmNPV)的PE38蛋白为诱饵,从感染BmNPV的家蚕中肠组织cDNA文库中筛选与之相互作用的宿主蛋白编码基因,为探讨BmNPV PE38在侵染家蚕过程中的作用提供线索。将成功构建的酵母诱饵表达载体pGBKT7-Pe38转化到酵母菌Y2HGold中,并将含有感染BmNPV的家蚕中肠组织cDNA文库的Y187酵母细胞与含有pGBKT7-Pe38的酵母细胞共同培养,初筛出8个有匹配结果的候选蛋白基因,经功能搜索后筛选到2个与病毒复制有关的蛋白基因,通过测序和生物信息学分析,这2个基因编码的蛋白质可能是与BmNPV的PE38蛋白有相互作用的候选蛋白,分别为家蚕丝氨酸蛋白酶和过氧化氢酶。     

家蚕氟中毒后中肠NADPH-细胞色素P450还原酶和NADPH-细胞色素C还原酶活性的变化

为了探究家蚕对NaF的代谢机制,以家蚕耐氟品种T6和氟化物敏感品种734为材料,从5龄起蚕开始分别添食50、100、200、400 mg/kg NaF溶液处理后的桑叶,检测蚕体中肠微粒体酶液中的黄素蛋白NADPH-细胞色素P450还原酶(CPR)和NADPH-细胞色素C还原酶(CR)的活性变化。氟物化敏感品种734的4个NaF处理组第3天的中肠CPR活性低于对照组,其余时间几乎都高于对照组,400 mg/kg NaF处理组在第4天的CPR活性最高,且各NaF处理组的CPR活性差异显著(P<0.05);耐氟品种T6 NaF处理组和对照组的中肠CPR活性整体上呈先升后降的趋势,几乎都在第2天达到最高值,各组之间的差异不显著(P>0.05)。氟化物敏感品种734的4个NaF处理组的中肠CR活性呈现先升后降的趋势,而对照组呈下降趋势;耐氟品种T6的50、100、400 mg/kg NaF处理组在第1～2天的中肠CR活性呈明显下降趋势,之后的变化相对较小,对照组的CR活性仅在第3～4天略高于NaF处理组,而其余时间NaF处理组的CR活性较高。2个家蚕品种添食不同浓度NaF后的中肠CR活性差异均不显著(P>0.05)。试验结果显示,耐氟品种T6在NaF作用下中肠的CPR和CR活性变化范围(分别为对照组的0.4～2.0倍和0.3～2.9倍)远小于氟化物敏感品种734这2种酶的活性变化范围(分别为对照组的0.6～9.3倍和0.4～4.6倍)。初步推测CPR和CR与家蚕对氟化物代谢具有一定的关联。     

氟化物对不同抗性家蚕品种的GST和AChE酶活性影响及雌雄个体间的酶活性差异

为了探明家蚕的耐氟性机制以及耐氟性在不同性别蚕体间的差异,以家蚕耐氟品种T6和氟化物敏感品种734为材料,自5龄起蚕开始分雌雄喂食清水和200 mg/kg NaF溶液浸泡后的桑叶,检测幼虫中肠谷胱甘肽-S-转移酶(GST)和头部乙酰胆碱酯酶(AChE)的活性变化。添食氟化物后耐氟和敏感家蚕品种5龄幼虫中肠的GST活力随添氟时间的变化趋势与对照组比较一致,且与对照组相比酶活性均呈增高趋势;敏感品种734添氟组5龄雌蚕的GST平均活力为雄蚕的1.486倍,耐氟品种T6添氟组5龄雌蚕的GST平均活力为雄蚕的1.529倍。敏感品种734对照组5龄幼虫在试验第3天头部的AChE酶活性显著升高,但添氟组雄蚕在试验第2天AChE酶活性即显著升高,而雌蚕的AChE酶活性在整个5龄试验期均呈平缓下降趋势;耐氟品种T6添氟组5龄雌、雄幼虫的AChE活力与对照组差异不大,酶活力随添氟时间的变化趋势也与对照组较为一致,均在第3天出现最低值;2个品种添氟组AChE酶活性的性别差异与GST相反,即雄蚕的AChE平均活力大于雌蚕。推测氟化物处理后耐氟家蚕品种仍然能够保持AChE酶活性水平,从而呈现对氟化物的耐受性;2种类型解毒酶活力在雌雄家蚕间的差异可能暗示同一品种雄蚕的耐氟能力较多涉及靶标抗性,而雌蚕的耐氟能力较多依赖于代谢抗性。     

家蚕近等基因系感染浓核病毒(BmDNV-Z)前后中肠组织蛋白的差异表达分析

家蚕浓核病毒(BmDNV)是危害家蚕的主要病毒之一。为鉴定与家蚕抗病毒相关的蛋白质,以对BmDNV完全不感染的家蚕品种兰10(L10)为供体亲本,将其抗性基因导入家蚕敏感品种菁松(JS)中,构建抗性近等基因系NIL(BC6F2)。对JS及其近等基因系NIL分别用家蚕浓核病毒镇江株(BmDNV-Z)添毒,二者分别表现为高度敏感和完全不感染。对JS和NIL在病毒感染前后中肠组织蛋白双向电泳(2D-PAGE)图谱中的差异蛋白点进行串联质谱(MALDI-TOF-TOF)分析,共鉴定了41个差异表达的蛋白点,其中有35个蛋白点可能与病毒的诱导相关,有6个蛋白点可能与家蚕的组成抗性相关。鉴定的差异表达蛋白包括糖酵解酶类、能量代谢酶类、参与基因表达的蛋白质以及参与其它细胞功能的蛋白质等。选取10个差异表达蛋白点进行基因表达定量PCR分析,进一步确证了这些蛋白质在JS及其近等基因系NIL之间以及在病毒诱导前后的差异表达。例如:精氨酸激酶在NIL和JS中均可被诱导表达;V-ATP合成酶及热激蛋白HSP70只在NIL中被特异性诱导表达;烯醇化酶在NIL中的表达水平显著高于JS,且不能被病毒感染所诱导,是一个典型的组成抗性相关蛋白。鉴定出的41个差异表达蛋白点有可能参与了家蚕对BmDNV-Z的抗性。     

家蚕抗浓核病近等基因系及其RAPD分子标记

用抗浓核病的蚕品种东 3 4 (rr)与感病的品种菁松 (RR)杂交 ,再以菁松作轮回亲本 ,进行回交育种。由于家蚕抗浓核病基因表现隐性 ,因此 ,用测交添毒选择方法保留抗病基因 (r) ,通过回交 5代和自交一代的选择培育获得了抗浓核病的近等基因系菁东。对 2个品系及抗病亲本用 50个随机引物进行了RAPD分析。     

家蚕耐氟与敏感品种乙酰胆碱酯酶的比较研究

用浸叶法添氟以检测氟对家蚕乙酰胆碱酯酶的影响。实验结果显示,添氟后蚕体乙酰胆碱酯酶活性降低,耐氟品种添氟组与对照组差距小于敏感品种;耐氟品种添氟后酶原蛋白含量高于对照组,敏感品种酶原蛋白含量始终低于对照组。研究结果表明,耐氟品种通过乙酰胆碱酯酶基因表达量的增加弥补了氟对乙酰胆碱酯酶活性的影响,使乙酰胆碱酯酶活性总体持平,从而使家蚕产生耐氟性。     

中国野桑蚕抗病毒蛋白基因(Lipase)的克隆与活性鉴定

从中国野桑蚕幼虫中肠细胞克隆获得了抗家蚕核型多角体病毒BmNPV的脂肪酶基因(Lipase)cDNA(GenBank:AY945212)。该基因cDNA大小906 bp,编码301个氨基酸,蛋白质分子质量约为28.9 kD。进一步克隆了其全长基因组,结果表明该基因由2 147 bp组成,包含4个外显子和3个内含子。该基因在野桑蚕体内的表达具有组织特异性,仅限于野桑蚕中肠组织表达,且在幼虫龄中表达水平较高,而在幼虫眠期和熟蚕期几乎没有表达。通过基因体外表达获得的重组蛋白Lipase,能够有效抑制BmNPV病毒对家蚕的感染,说明该蛋白具有较强的抗BmNPV的生物学活性。