重组人白细胞介素-15摇瓶生产工艺优化

通过研究不同类型培养基和培养温度、起始pH值等发酵条件对IL-15产量的影响,初步确认了摇瓶水平发酵各因素的最优条件。优化的发酵条件为发酵起始pH值7．0、培养温度37℃、乳糖诱导浓度1．5g／L、菌体生长密度OD600达到1．0时加入乳糖、诱导时间4h,此时IL-15产量达到最高水平,从而为IL-15批量生产奠定了良好的基础。     

人γ干扰素的高效表达

采用限制性核酸内切酶酶切鉴定含hIFN-γ基因的重组质粒,SDS-PAGE检测不同条件下hIFN-γ基因的表达情况,用Western blot和亲和层析对表达产物进行鉴定和纯化,并对表达条件进行优化。经酶切鉴定和核苷酸序列测定证实重组质粒pET32a（＋）-hIFN-γ含有hIFN-γ基因且阅读框架正确,以IPTG诱导hIFN-γ基因表达的优化条件是：培养基pH7.0,培养温度37℃,IPTG浓度0.8 mmol/L,菌体生长密度OD600达到0.8时加入IPTG,诱导时间5h,此时hIFN-γ蛋白表达量为52%。从而实现了hIFN-γ基因的高效表达并优化了其表达工艺。从而为hIFN-γ的生物活性和生产工艺研究提供了可靠的试验数据。     

猪白细胞介素-15基因的克隆及生物信息学分析

参照GenBank登录的猪白细胞介素-15(IL-15)基因序列自行设计1对特异性引物，运用RT PCR技术从由刀豆蛋白A(ConA)诱导培养的荣昌猪外周血淋巴细胞扩增出猪IL-15基因的完整CDS序列，全长489 bp。同源比对结果表明，荣昌猪IL-15基因与已公布的2个猪种IL-15基因核苷酸同源性均为99.4%,与哺乳动物的同源性较高，与鸡的同源性较低。密码子偏爱性分析显示，荣昌猪IL-15基因在密码子使用上存在一定的偏爱性；分子进化分析结果表明其与人及哺乳动物IL-15基因的进化关系较近，而与禽类鸡的IL-15基因进化距离较远；结构域预测分析显示其与人的IL-15存在很大的相似性，可能在功能上有相似性。     

重组人白细胞介素6表达载体的构建及共在大肠杆菌中的高效表达

本研究合成了两个成熟人ＩＬ－６ｃＤＮＡ引物，采用ＰＣＲ法扩增出了成熟人ＩＬ－６基因片段，并在其５＇端加入了一个ＥｃｏＲＩ部位和ＡＴＧ，３＇端加入了一个ＢａｍＨＩ部位和ＴＡＡ。利用ｐＢＶ２２０质粒构建成功了ｐＢＶ２２０ＩＬ－６表达载体。将重组质粒导入Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５ａ中，经３０℃扩增的４２℃诱导，表达出了分子量为２１０００的预期蛋白。经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析与溥层证明具有明显的ＩＬ－６活性。实验还对     

重组人白细胞介素6表达载体的构建及其在大肠杆菌中的高效表达

本研究合成了两个成熟人IL-6cDNA引物.采用PCR法扩增出了成熟人IL-6基因片段,并在其5’端加入了一个Eeo RI部位和ATG,3’端加入了一个Bam HI部位和TAA.利用pBV220质粒构建成功了pBV220 IL-6表达载体.将该重组质粒导入E.coli DH5α中,经30℃扩增和42℃诱导,表达出了分子量为21000的预期蛋白.经SDS-PAGE分析与薄层扫描测定,重组IL-6的含量约占全菌体总蛋白的27％以上.菌体裂解液用7TD_1细胞测定,证明具有明显的IL-6活性.实验还对工程菌的IL-6表达动态和包涵体提取进行了研究,从而为工程菌发酵与IL-6纯化提供了工作基础.     

白细胞介素15的研究进展

白细胞介素 15 (interleukin 15IL - 15 )是近年发现的一种在分子结构及生物学性质方面与白细胞介素 2 (inter leukin 2IL - 2 )相似的细胞因子。自 1994年发现以来 ,由于其在医学及兽医学上重要的生物学作用而受到研究者们的重视。现对IL - 15及其在兽医学上具潜在应用价值的鸡IL - 15近年来取得的研究进展作一综述。     

白细胞介素-15研究进展

白细胞介素-15(interleukin 15 IL-15)是近年发现的一种在分子结构及生物学性质方面与白细胞介素-2(interleukin 2 IL-2)相似的细胞因子。自从1994年发现以来,由于其在医学及兽医学上的重要的生物学作用而受到研究者们的重视,在各个方面的深入研究已取得了一定的进展。本文对IL-15及其在兽医学上具有潜在应用价值的鸡IL-15(Chickeninterleukin 15 ChIL-is)近年来取得的研究进展作一综述,内容涉及IL-15的结构及受体、产生及基因表达、生物学作用。     

昆明鼠白细胞介素-15基因的克隆与序列分析

参照GenBank登录的小家鼠(Mus musculus)白细胞介素-15基因序列设计引物,利用RT-PCR技术对刚地弓形虫RH株诱导昆明(KM)鼠72 h后的脾细胞进行扩增,克隆得到了KM鼠的成熟IL-15核苷酸序列。经测序分析发现,KM鼠成熟IL-15序列长度为345 bp,编码114个氨基酸,与小家鼠IL-15序列相似性达到100%。序列比对和遗传进化分析表明,KM鼠成熟IL-15序列与挪威鼠亲缘关系较近,核苷酸和氨基酸序列相似性分别为94.2%和95.5%;与土拨鼠、人、灵长类、兔、犬、猫、牛、野猪等哺乳动物亲缘关系相对较远,核苷酸和氨基酸序列相似性分别为71.2%~78.8%和69.5%~74.7%;与珍珠鸟、非洲蟾蜍和斑马鱼亲缘关系最远,核苷酸和氨基酸序列相似性分别为6.1%~50.9%和16.1%~32.5%。KM鼠IL-15基因的成功克隆为进一步研究其功能及免疫增强作用奠定了基础。     

猪白细胞介素-4基因的克隆与表达

利用RT-PCR技术,从被刺激诱导的PBMC中克隆IL-4基因,序列分析表明:克隆的猪IL-4基因序列与GenBank上登录的IL-4基因的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为99%和97.8%.然后用表达型引物从T载体上扩增IL-4基因,双酶切PCR产物后与表达载体pGEX连接,构建重组表达质粒pGEX-IL-4,用IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE分析表明,表达出38 ku融合蛋白,占菌体总蛋白的30%以上,并且以包涵体的形式存在,这为猪重组IL-4规模化生产和疫苗佐剂的研制奠定了基础.     

鸡白细胞介素-15基因克隆、序列分析及表达

根据GenBank上发表的鸡IL-15基因序列设计两对引物,以从鸡脾脏中提取的基因组RNA为模板,采用RT-PCR扩增出鸡白细胞介素-15基因并进行了序列分析。序列分析结果表明,鸡白细胞介素-15基因序列全长580bp,开放阅读框架内564个核苷酸共编码188个氨基酸。所扩增的序列与已报道的序列同源性为99.9%(563/564)。将扩增序列插入大肠杆菌载体pBV220中进行表达,SDS-PAGE显示目的蛋白约为21ku,表达产物经免疫荧光鉴定为阳性。     

猪白细胞介素15基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

本研究通过RT-PCR方法从用ConA刺激的猪外周血淋巴细胞中扩增出猪IL-15(pIL-15)编码序列的cD-NA,将其克隆至T载体pMD18-T后,序列测定表明pIL-15基因长度为489 bp,编码162个氨基酸。进一步通过PCR方法获得缺失其N端48 aa的信号肽序列的成熟pIL-15蛋白基因,将其亚克隆到原核表达载体pET-28a的6×His下游,构建重组表达质粒pET-pIL15,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导,重组菌体裂解物经SDS-PAGE可检测到分子量约为15 ku的重组蛋白,其表达量占总菌体蛋白量的17.5%。Western blot试验也证实表达的重组融合蛋白6×His-pIL15能够很好地与抗6×His单抗发生反应。猪IL-15基因的克隆、表达为进一步研究其功能和应用奠定了基础。     

鸡IL—15基因的分子克隆及其有关特性的研究

实验应用聚合酶链式反应技术从鸡脾淋巴细胞中克隆得到了白细胞介素-15基因，序列分析表明与已发表的鸡白细胞介素-15基因完全一致，核苷酸序列和推导的氨基酸序列与牛的最接近，同源性分别为46%和31%，与哺乳动物白细胞介素-15序列类似，有4个高度保守的半胱氨酸残基，同时本研究也用此方法对鸡脾脏、法氏囊、胸腺、哈德氏腺和盲肠扁桃体等淋巴器官的淋巴细胞中鸡白细胞介素-15mRNA的表达进行了研究，结果表明这些器官的淋巴细胞均表达mRNA。在实验还用有丝分裂原ConA对鸡脾淋巴细胞进行活化，观察活化的淋巴细胞表达白细胞介素-15mRNA的情况，结果发现白细胞介素-15mRNA在活化的脾淋巴细胞中表达量升高。     

重组犬IL-2在原核细胞中的高效表达

应用RT-PCR技术克隆犬IL-2基因，并插入到原核表达载体PJLA605中，构建pRL-CaIL-2表达质粒；采用M9培养基摇瓶发酵，确定诱导时机和诱导表达时间。结果表明：工程菌pRL-CaIL-2在30C培养至对数生长后期（OD600为1．5）42C诱导4h时。菌体收得量湿重达17．8g／L，目标蛋白表达量约占菌体总蛋白的29．7％。外源基因在该基因工程菌中得到了高效表达。     

白介素15对骨骼肌和脂肪组织的调节作用

白介素15(IL-15)是近年发现的一种细胞因子,存在于多种细胞和组织中,具有促进淋巴细胞和NK细胞增殖和增强它们生物活性的功能.近年的研究发现,IL-15还可阻碍骨骼肌蛋白的降解,另外可通过直接作用于脂肪细胞来降低动物体内脂肪沉积.本文从IL-15的结构、受体及对骨骼肌和脂肪组织的调节作用作一综述.     

荣昌猪白细胞介素15成熟肽基因的克隆、表达及其表达产物活性检测

运用RT—PCR技术从由刀豆蛋白（ConA）诱导培养的荣昌猪外周血淋巴细胞（PBMC）扩增出猪白细胞介素15（pIL-15）完整开放阅读框（ORF），共489bp，编码162aa。与已公布的2个猪IL-15基因核苷酸同源性均为99．4％。分子进化分析表明其与人及哺乳动物IL-15基因的进化关系较近，而与鸡的IL-15基因进化距离较远。运用PCR技术从含荣昌猪IL-15开放阅读框序列质粒中扩增其成熟蛋白编码基因，共345bp。将其定向克隆于原核表达载体pET-32a（＋）后在E．coli BL21中诱导表达，SDS-PAGE结果显示表达的融合蛋白约为34ku，重组蛋白以包涵体形式表达，表达产物约占菌体总蛋白的38．7％；Western blot分析表明，在相对分子质量34ku处有一条特异性带；对诱导重组菌进行转录检测得到约356bp的特异性片段。MTT法试验证实，表达产物初步纯化、透析复性后，可明显增强淋巴细胞的增殖。荣昌猪IL-15成熟肽成功在体外表达，获得的高效表达的产物具有一定的生物学活性。     

IBDV VP2基因重组质粒pBV220表达条件的优化

采用三角瓶小量法振荡培养,对含传染性法氏囊病病毒VP2基因的重组质粒pBV220在大肠埃希菌BL21内表达条件进行优化.在37℃时诱导,对起始OD600值(0.40±0.025～0.65±0.025)进行筛选;在42℃时诱导,对起始OD600值(0.40±0.025～0.65±0.025)进行筛选;在37℃和42℃时诱导,分别对诱导时间(5、6、7、8 h)及待选培养基(R1、R2、R3)进行筛选.以菌体湿重和菌体VP2蛋白表达水平两个指标进行统计分析及综合评价.结果表明,37℃时诱导,最适宜起始OD600为0.45±0.025,最佳诱导时间为7 h,最佳培养基是R1;42℃时诱导,最适宜起始OD600为0.40±0.025,最佳诱导时间为5 h,最佳培养基是R2.42℃时的每一诱导时间组菌体湿重和VP2表达水平都显著低于37℃时.因此,以重组质粒pBV220的大肠埃希菌BL21表达IBDV VP2基因,在37℃时诱导表达要比42℃时好.     

人成熟叠朊在大肠埃希菌中高效表达

以含有人叠朊编码基因Prnd的ORF的质粒HoPrnd-T为模板,PCR扩增出成熟叠朊编码基因片段homDpl,并将其插入原核表达载体pGEX-6P-1的EcoRⅠ和XhoⅠ位点之间,构建出重组表达质粒pGEX-homDpl。将pGEX-homDpl电转化到宿主菌株BL21(DE3)中,以1.0 mmol/LIPTG诱导表达,SDS-PAGE结果显示人成熟叠朊被大肠埃希菌高效表达。     

高效表达重组猪IL-10的基因工程菌株的构建

白细胞介素—10(IL-10)是一种Th2细胞等产生的能抑制Th1细胞释放细胞因子的免疫调节因子。从经脂多糖(LPS)活化的猪外周血单核细胞(PBMC)中提取总RNA，用RT—PCR扩增了猪IL-10(poIL—10)编码基因，克隆并测序验证后，将其亚克隆到表达载体pPROEX^TM HTb中，转化DH5α后，用IPTG诱导培养，经免疫印迹和生物活性检测显示，重组菌株表达了具有活性的重组poIL—10，重组poIL-10表达水平达3mg／ml培养液，占菌体细胞总蛋白的30．2％，本研究为poIL-10的功能研究和临床应用奠定了基础。