中国猪瘟C-株(脾淋毒)全长cDNA的分子克隆

应用RT-PCR、Nested PCR和Half-nested PCR技术从实验感染兔脾组织的总RNA中得到了覆盖猪瘟病毒(CSFV)C-株全基因组的7个cDNA重叠片段，分别克隆于pMD18—T或pGEM-T Easy载体后进行测序。运用T-A克隆和多片段一步连接法，将cDNA重叠片段F1、F2、F3、F4与F5、F6、F7分别克隆到pGEM-5Zf( )载体后，得到两个半长cDNA亚克隆重组质粒pGEM-5Zf( )／F1-4和pGEM-5Zf( )／F5-7。再将两个半长cDNA重叠片段连接并克隆到pGEM-5Zf( )载体，构建出了CSFVC-株全长cDNA重组质粒pGEM-5Zf( )／F1-7。全长cDNA的成功构建为进一步研究CSFV分子生物学提供了良好的工具。     

猪瘟病毒C-株(脾淋毒)3′-UTR的克隆和二级结构分析

根据已发表的CSFVC—株序列，设计合成了3′—UTR特异性PCR引物对F—R及半套式上游引物F′。从兔脾组织中提取总RNA，应用RT—PCR及Half—nested PCR，成功地扩增出了C-株3′—UTR，克隆到pMD-18T载体后进行了序列测定。与AID株、Alfort/187株、Brescia株、F114株、Eystrup株、Riems株和Shimen株的相应区段进行了序列比较分析，同源性分别为98．7％、98．2％、98．2％、98．7％、97．8％、97．8％和98．7％。C—株3′—UTR中存在一富含T的插入序列，可能是C—株在兔化致弱时产生的变异标记，对其二级结构具有较大影响。在其它疫苗株的3′—UTR不同位置，亦存在相似的插入序列，该序列可能与病毒的毒力有直接关系。     

猪瘟病毒LOM株的一个感染性的cDNA克隆的建立和特征

典型猪瘟病毒（CSFV）在猪群中具有高度传染性,给世界经济造成重大的影响。典型猪瘟病毒（CSFV）LOM株是1956年从日本分离的低毒力Miyagi株的致弱株毒。用RT—PCR获得了LOM株CSFV基因组的8个基因片段。     

传染性法氏囊病病毒浙江分离株(ZJ2000)基因组A节段全长cDNA的克隆和序列分析

以传染性法氏囊病病毒（IBDV）浙江分离株（ZJ2000）基因组RNA为模板，采用Long-accurate RT-PCR(LA-PCR)一步法扩增并克隆了IBDV ZJ2000株基因组A节段全长cDNA。序列测定结果表明，克隆的A节段全长共3259个核苷酸，包括5'、3'端的非编码区（NCRs）和2个部分重叠的开放阅读框（ORF1和ORF2），与参比的血清1型毒株核苷酸序列的同源性高达95．2％－99．2％。二级结构预测表明，在5'-NCRs存在1个大型的茎环发夹结构。ORF2编码145个氨基酸的VP5，与参比毒株的同源性高达98．6％－100％。ORF1编码1012个氨基酸的VP2／VP4／VP3，在氨基酸水平上VP2、VP3、VP4与参比毒株的同源性分别达到94．9％－98．8、96．1％－98．5％、97．1％－99．2％。ZJ2000共有14－38氨基酸的替代，其中特有氨基酸6个，变异大多数集中在VP2高变区，突变率达2．9％－11％。第2个小亲水区内280位氨基酸由S替代了N、290位M替代了L。这2个突变可能与IBDV的抗原性有关。VP2－VP4剪切位点附近511和540位氨基酸的变异可能使ZJ2000株的毒力增强。分子系统进化树分析表明，ZJ2000与欧洲Cu-1株、P2株、CEF94株和中国Harbin株的有关最近，而与欧洲、香港、日本的超强毒株和美国的变异株相对较远。     

猪繁殖和呼吸综合征病毒GP3蛋白粮基化位点突变株的构建及其生物学特性分析

为研究猪繁殖与呼吸系统综合征病毒（PRRSV）GP3蛋白糖基化位点的作用,在弱毒疫苗株HuN4-F112感染性克隆的基础上,采用点突变的方法对GP3蛋N29、N42、N50、N131位进行单点或多点组合突变糖去基化,     

从全长cDNA克隆恢复猪瘟病毒方法的研究

以携带猪瘟病毒Thiverval株全长cDNA克隆的pAC/F101/T1-7载体质粒为模板,在体外转录病毒基因组RNA,并转染PK-15和BHK-21细胞,通过传代、RT-PCR、免疫过氧化物酶细胞单层试验鉴定,成功地在两种细胞中拯救出具有感染性的病毒粒子。同时,通过2种细胞转染效率的对比试验,成功建立了利用高转染效率的其它真核细胞作为病毒拯救的过渡细胞,然后再在猪肾细胞系上进行增殖的病毒拯救方式,极大提高了猪瘟病毒拯救的效率。     

表达增强型绿色荧光蛋白的报告猪瘟病毒C株的构建及在家兔中生物学特性评价

猪瘟兔化弱毒疫苗C株是我国自主研发的,用于预防猪瘟（CSF）的最好弱毒活疫苗。然而,现阶段的C株不具备标记功能,无法区分野毒感染与疫苗接种。本研究旨在将增强型绿色荧光蛋白（EGFP）编码基因插入猪瘟病毒（CSFV）C株将其构建为报告病毒,为C株的基础研究提供病毒示踪工具,同时提供构建标记C株疫苗的方法。本研究中,笔者在CSFV C株中引入EGFP基因,分别构建了表达增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的报告CSFV rHCLV-EGFP,以及用CSFV强毒Shimen（SM）株N^pro基因替换C株N^pro基因后再引入EGFP基因的嵌合报告病毒rHCLV-N^pro（SM）-EGFP。通过猪瘟抗原ELISA检测,直接观察荧光及Western blot检测EGFP的蛋白表达等方法对拯救的病毒进行鉴定,并在细胞和家兔上评价这两株病毒的生物学特性。结果显示,两株报告病毒的抗原ELISA结果均为阳性;在感染rHCLV-EGFP的细胞中并未观察到绿色荧光也未检测到EGFP蛋白,但在感染rHCLV-N^pro（SM）-EGFP的细胞中观察到EGFP的绿色荧光并检测到EGFP蛋白;细胞试验结果表明,两株报告病毒与亲本病毒具有相似的生长特性且遗传稳定;家兔试验发现,rHCLV-N^pro（SM）-EGFP保留了C株的在家兔体内的生物学特性,但rHCLV-EGFP失去了C株诱导家兔定型热反应的能力。构建的嵌合报告病毒rHCLV-N^pro（SM）-EGFP可以作为C株的报告病毒进行应用：可以对病毒示踪,用于研究C株的复制过程、病毒与细胞的相互作用;同时,该嵌合报告病毒也具备发展为标记C株疫苗的潜力。     

猪瘟兔化弱毒疫苗株基因组的遗传变异分析

参照已发表的猪瘟病毒基因组序列设计了9对引物，用RT-PCR从猪瘟兔化弱毒疫苗株细胞培养物中扩增得到了覆盖猪瘟病毒基因组全长的9个cDNA片段，将所得cDNA片段分别克隆至pMD18-T载体中，经测序和拼接后，获得了猪瘟兔化弱毒疫苗株基因组全序列。序列分析表明，猪瘟兔化弱毒疫苗株基因组全长12310个碱基，其5’非编码区（5＇-NCR）和3＇-NCR分别由373和239个碱基组成，在3’末端有富含T的碱基插入，其间为1个大的开放阅读框架，编码3898个氨基酸残基的多聚蛋白，与国内外已发表的另外7个猪瘟兔化弱毒疫苗株基因组全序列相比，核苷酸同源性为98．7％～99．9％，氨基酸同源性为98．6％～99．9％。基因组全序列比较显示，猪瘟兔化弱毒疫苗株基因组在遗传上相当稳定。     

用生物信息学手段辅助分析猪瘟病毒的基因结构

借助生物信息软件,对猪瘟病毒的分子演化关系、RNA 3'端非编码区(NTR)序列及二级结构、E2基因的亲水性及抗原指数等进行了辅助分析.经检索得到CSFV全长序列23条,序列片段369条.确定了AF352565(LPC)株的碱基缺失在ORF的1174～1176位.采用基因组序列的全长ORF进行了比对并绘制了进化树,对E2基因的亲水谱与抗原指数进行计算,推测E2基因抗原性变化不大,但不同毒株之间可能存在微小差异.比较了CSFV 3'端NTR的序列并预测了3'端NTR的RNA二级结构,表明不同毒株之间存在较多差异.     

犬贾第虫病毒(长春株)全基因组序列分析

根据已报道的人源蓝氏贾第虫病毒序列设计了互相重叠的6对特异性引物，以犬贾第虫（长春株）纯培养滋养体总核酸为模板进行RT—PCR。PCR产物连接到pMD18-T载体进行测序，通过BLAST在GenBank进行同源性搜索，并用DNAMAN分子生物学软件进行分析。结果测得我国犬贾第虫病毒（长春株）基因组全长为6276bp（DQ238861），编码1个有887个氨基酸残基的衣壳蛋白和1056个氨基酸残基的融合蛋白，这2个阅读框被-1核糖体移码框分开，重叠处有220nt。基因组中G＋C占49．62％。其序列与国外报道的人源蓝氏贾第虫病毒（L13218）序列同源性为94．62％，编码的氨基酸同源性为93．50％；与国内人源蓝氏贾第虫病毒（AF525216）序列同源性为98．88％，编码的氨基酸同源性为98．30％。     

猪瘟病毒ELISA抗体检测试剂盒的比较试验

目前国内外的猪瘟ELISA抗体检测试剂盒种类繁多,为了给实际使用提供参考依据,用猪瘟病毒阴性、弱阳性、强阳性血清参考品为标尺,比较了14种国内外猪瘟病毒ELISA抗体检测试剂盒的符合率。结果表明,6种阻断ELISA试剂盒符合率均可达到100%,在敏感性和特异性上整体优于间接ELISA试剂盒。     

Comparison of two real-time RT-PCR assays for differentiation of C-strain vaccinated from classical swine fever infected pigs and wild boars

Classical swine fever is one of the most important infectious diseases for the pig industry worldwide due to its economic impact. Vaccination is an effective means to control disease, however within the EU its regular use is banned owing to the inability to differentiate infected and vaccinated animals, the so called DIVA principle. This inability complicates monitoring of disease and stops international trade thereby limiting use of the vaccine in many regions. The C-strain vaccine is safe to use and gives good protection. It is licensed for emergency vaccination in the EU in event of an outbreak. Two genetic assays that can distinguish between wild type virus and C-strain vaccines have recently been developed. Here the results from a comparison of these two real-time RT-PCR assays in an interlaboratory exercise are presented. Both assays showed similar performance.     

规模化猪场种猪猪瘟免疫方式和剂量的探讨

对福建某公司2010年、2011年"一刀切"免疫(一年春、秋各免疫1次,每头每次免疫剂量1.5头份猪瘟兔化弱毒脾淋苗)的4561份种猪血清样品采用HerdChek猪瘟抗体检测试剂盒进行抗体检测,评价种猪猪瘟免疫效果,保证猪瘟免疫合格率达到80%以上,为规模化猪场种猪进行猪瘟免疫提供科学依据。结果显示:2010年、2011年种猪抗体检测合格率为86.70%、84.32%,对抗体不合格种猪再一次加强免疫后抗体检测总合格率91.28%、89.74%。由此表明:种猪猪瘟全群采用"一刀切"免疫猪瘟兔化弱毒脾淋苗,可以起到良好的免疫效果。