巴西固氮螺菌固氮负调控基因与nifL基因的同源性研究

以棕色固氮菌和肺炎克氏杆菌的nifL基因较保守的N-端区设计了一对PCR引物,对巴西固氮螺菌总DNA进行扩增。序列分析结果表明,扩增片段与棕色固氮菌nifL基因的核苷酸同源性为47.2%,与肺炎克氏杆菌nifL基因的核苷酸同源性为49.1%。由此看来,巴西固氮螺菌与肺炎克氏杆菌和棕色固氮菌的nifL基因同源性很低。     

小麦、水稻、玉米、白菜、芹菜内生固氮菌及其系统发育

【目的】了解小麦、水稻、玉米、白菜、芹菜内生固氮菌的主要类群,确定内生固氮菌的系统发育地位。【方法】样品表面灭菌后采用无氮培养基分离、培养内生固氮菌,乙炔还原法测定菌株固氮酶活性;PCR扩增得到菌株16S rDNA,通过序列测定和相似性分析研究菌株的系统发育。【结果】从大田小麦体内分离到内生固氮菌34株,固氮酶活性在0.30-30.24 nmol C2H4/h•mg蛋白,基于16S rDNA序列最大相似性,这些菌株分属于假单胞菌（Pseudomonas）、根瘤菌（Rhizobium）、芽孢杆菌（Bacillus）、黄杆菌（Flavobacterium）等13属21种,种群分布较为广泛;从大田水稻体内分离到内生固氮菌25株,固氮酶活性在3.12-254.12 nmol C2H4/h•mg蛋白,属于芽孢杆菌、伯克霍尔德氏菌（Burkholderia）、肠杆菌（Enterobacter）、克雷伯氏菌（Klebsiella）等9属16种,伯克霍尔德氏菌、肠杆菌和克雷伯氏菌是水稻内生固氮菌特有种群;从大田玉米体内分离到内生固氮菌9株,固氮酶活性在7.27-59.58 nmol C2H4/h•mg蛋白,属于根瘤菌、鞘氨醇单胞菌（Sphingomonas）等5属6种;从盆栽试验小白菜体内分离到内生固氮菌14株,固氮酶活性在2.33-205.21 nmol C2H4/h•mg蛋白,属于根瘤菌、节杆菌（Arthrobacter）等6属8种;从市售芹菜体内分离到内生固氮菌10株,固氮酶活性在1.23-46.70 nmol C2H4/h•mg蛋白,属于鞘氨醇单胞菌、假单胞菌等5属8种。【结论】在生长期小麦、水稻、玉米和部分蔬菜体内普遍存在内生固氮菌,菌株固氮酶活性差异较大,在0.30-254.12 nmol C2H4/h•mg蛋白,系统发育地位分属于假单胞菌、根瘤菌、芽孢杆菌等25个属的56个种,这些内生固氮菌对于农业生产有巨大潜能。     

玉米内生联合固氮菌的分离与鉴定

试验对玉米内生固氮菌进行分离、鉴定,并研究内生细菌与玉米的联合固氮活性。结果表明,从玉米中分离出5株具有联合固氮活性的菌株,分别为1株弯曲假单胞菌NFR19(Pseudomonas geniculata),2株产酸克雷伯氏菌NFL28与NFSt18(Klebsiella oxytoca),1株节杆菌NFR7(Arthrobacter sp.),1株纤维化纤维菌NFR10(Cellulosimicrobium cellulans)。研究首次分离出具有固氮活性的纤维化纤维菌,并证实节杆菌具有固氮活性。从环境中筛选新的玉米内生固氮菌资源,促进玉米生长,为玉米内生联合固氮细菌的应用奠定基础。     

青藏高原矮火绒草内生细菌多样性及生物功能分析

[目的]探究矮火绒草(Leontopodium nanum)内生细菌的群落结构多样性及其生物学功能,为开发相应功能的生物菌剂提供参考,并为青藏高原生态农牧业生产提供有价值的内生细菌资源.[方法]采用组织分离法对矮火绒草植株内生细菌进行分离纯化,基于16S rDNA序列分析确定分离菌株的系统发育地位;通过平板对峙法检测分离菌株拮抗病原真菌活性;检测分离菌株的产吲哚乙酸(IAA)、溶磷和固氮能力;测定分离菌株除草活性、低温适生性及促种子萌发特性.[结果]从矮火绒草植株根、茎、叶和种子部位共分离获得52株内生细菌,基于16S rDNA序列分析发现52株菌株可归属于4门7纲10目14科18属.其中假单胞菌属细菌为根部优势属,约占根部细菌总数的52.17%;茎中以芽孢杆菌为优势属,约占茎部细菌总数的41.18%;各部位的内生细菌数量分布表现为根>茎>种子>叶.在52株内生细菌中,11株有拮抗病原真菌能力、9株具有产IAA能力、7株有溶磷活性、7株具有固氮活性、20株具有除草活性、13株具有耐低温能力和8株具有促生作用;从植株部位分布来看,7种类型的功能菌在根、茎和种子部位均有分布,拮抗菌和除草菌在根部所占的比例较高,溶磷菌株在各植株部位所占比例均较低;在叶中未分离到拮抗菌、产IAA菌、固氮菌和促生菌.各功能菌株分布在17个属,多样性较高,其中假单胞菌属和芽孢杆菌属中含有多种功能菌株,在植株4个部位所占比例也较高.[结论]矮火绒草植株不同部位内生细菌的数量分布具有差异性,但均可分离到不同类型的功能菌株,功能菌株涵盖17个属,其中以假单胞菌属和芽孢杆菌属居多.     

山西黄芪根际固氮菌的分离与应用

[目的]对黄芪道地产区山西浑源的黄芪根际固氮细菌进行了分离鉴定,并应用于黄芪栽培中以观察其固氮能力,旨在筛选并获得能够促进黄芪生长的固氮菌,为降低黄芪生产成本提供依据。[方法]采用Ashby无氮培养基初筛获得了120个自生固氮菌株;进一步用固氮培养基对初筛所得菌株进行复筛,根据固氮能力、菌落生长速度等特征,获得了2株具有较强固氮能力的菌株t16和t21;通过细菌鉴定系统和16SrRNA序列分析对其进行分类鉴定。另外还用全N差值法检测了t16和t21浸泡黄芪种子后的固氮活性。[结果]t16和t21分别属于Rhizobiumsp.和Sinorhizobiumsp.。经两株菌发酵液浸泡后,培养30d分别能够增加黄芪幼苗含氮量14.23%~18.67%和13.10%~18.77%。其中含菌量为106个·mL-1的t16发酵液和含菌量为108个·mL-1的t21发酵液效果最好,折算每公顷30d的固氮量达2.25kg。[结论]山西黄芪根际固氮菌具有较大的开发利用潜力。     

比较基因组分析斯氏假单胞菌遗传多样性及固氮基因岛进化机制

对5株固氮与11株非固氮斯氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)基因组开展综合比较分析,从基因组水平上研究斯氏假单胞菌种内遗传多样性及其固氮基因岛进化机制。核心与元基因组分析发现,16个斯氏假单胞菌拥有的独特基因数占元基因数的46.37%;基于平均核苷酸相似度分析,这16个菌株被划分为11种不同的基因组变异型,表明斯氏假单胞菌基因组异质化程度高。固氮基因岛及进化树分析表明,5株固氮菌属于3种不同基因组变异型,它们的固氮基因岛及其侧翼序列保守性好,而且固氮酶基因进化树与菌株谱系进化树呈现高度一致性。据此推测,斯氏假单胞菌祖先可能通过水平基因转移的方式获得固氮基因岛,从而转变为固氮菌,但是在后期进化过程中,绝大部分固氮菌株丢失了固氮基因岛。     

水稻根系内生固氮菌的分离鉴定及其促生作用研究

【目的】研究不同生育期水稻根系内生固氮菌的多样性,分离鉴定内生固氮菌并筛选具有促生作用的菌株,为水稻生产中固氮菌的应用提供理论依据。【方法】采用无氮培养基培养方法,从拔节期和抽穗期佳辐占根系中分离内生固氮菌,通过扩增16S rRNA方法进行分子鉴定和系统进化分析;采用透明圈法进行溶磷解钾能力验证;采用乙炔还原法测定固氮酶活性。将分离的内生固氮菌株单独接种盆栽水稻幼苗,测定其对株高、根长、鲜质量的影响;将内生固氮菌混合菌液接种水稻品种佳辐占和台粳8号,于齐穂期测定倒1、倒2和倒3叶片的叶绿素含量（SPAD值）。【结果】从拔节期和抽穗期水稻根系中分别分离出10和20株内生固氮菌,且两个时期水稻根系内生固氮菌群多样性存在差异,拔节期以克雷伯氏菌属为主,而抽穗期以假单胞菌属为主。筛选出7株具有溶解无机磷能力的菌株,分别是J3、J10、J23、H27、H30、H33和H37。乙炔还原法测定结果表明,分离的内生固氮菌均具有弱固氮活性,其中 H33和H40-2菌株固氮能力相对较强。将固氮菌回接水稻幼苗,H40-2和J3菌株对水稻株高、地上鲜质量、根长均有显著影响,可促进水稻生长。将固氮菌混合回接水稻根系,发现佳辐占叶片叶绿素含量与对照差异不显著,而台粳8号显著提高。【结论】分离的内生固氮菌株H40 2和J3在水稻苗期具有明显促生作用,可作为功能性内生固氮菌开发利用。     

禾本科植物内生固氮菌产γ-氨基丁酸特性

采用纸层析法与紫外分光光度法,对来源于禾本科植物的64株内生固氮菌产γ-氨基丁酸的特性进行分析鉴定.筛选到3株γ-氨基丁酸产量较高的内生固氮菌:Y28(0.754 mg·mL-1)、Y21(0.597 mg·mL-1)、W3(0.539 mg·mL-1).菌株Y28的产量比国内同行研究者初筛选到的产γ-氨基丁酸菌的产量(0.55 mg·mL-1)都要高,兼具固氮活性,具有很高的研究及应用价值.     

根际联合固氮菌对小麦生产的效应研究

在盆栽条件下,施用专性小麦根际联合固氮菌,提高了根际土固氮酶活性,植株叶绿素和全氮含量以及小玫生物产量,增加了小麦根际土和根表皮层中联合固氮菌数量;净固氮量比下不施菌增加４５－６０ｋｇ／ｈｍ＾２,与固氮效力较高的巴西固氮螺菌相当,但适应性较优。     

拮抗性苦豆子内生细菌的遗传多样性

[目的]研究了分离自苦豆子,对棉花枯萎病菌和黄萎病菌有较强拮抗作用的48株内生细菌进行遗传多样性,分析并对有代表性的10株菌进行序列测定和系统发育分析。[方法]采用总DNAERIC-PCR方法和16S rRNA基因全序列分析方法对48株内生细菌进行了遗传多样性和系统发育分析。[结果]ERIC-PCR指纹图谱分析表明,在Watson距离为0.31时,48株菌被划分为6个ERIC群和2个独立成群的菌株,从每个群中挑选出代表性的菌株测定其16S rRNA基因,进行系统发育分析,结果表明这些菌株分别属于Bacillus atro-phaeus、Bacillus subtilis、Bacillus cereus、Bacillus megaterium、Bacillus pumilus、Serratia marcescens。[结论]该48株内生菌遗传多样性明显,通过对该48株菌的多样性和系统发育地位的确定,可以为研究棉花枯萎病菌和黄萎病菌的机制研究奠定基础,同时为棉花生产中病害的生物防治提供新的途径。     

云南西盟蔗区发现检疫性病害甘蔗白叶病

研究旨在明确2018年在云南西盟蔗区发现的甘蔗病害是否为植原体引起的甘蔗白叶病。使用植原体16S rRNA基因序列通用引物P1/P7和R16F2n/R16R2对10份采自云南西盟蔗区的疑似甘蔗白叶病样品进行巢氏PCR检测,并将巢氏PCR 产物进行克隆测序和序列分析。巢氏PCR结果表明,所有10份样品均能扩增得到1240bp左右的片段。测序结果表明所有获得的10条16S rRNA基因序列大小均为1247bp,序列间的核苷酸一致性为100%。BLASTN分析表明从病株扩增到的所有核苷酸序列与先前云南临沧甘蔗白叶病植原体分离物LC7和LC9的16S rRNA基因序列(Genbank登陆号：KR020691和KR020692)的核苷酸序列一致性为100%。虚拟RFLP分析表明西盟分离物的16S rRNA基因序列的酶切图谱与16SrXI-B亚组植原体相同。本研究结果表明云南西盟蔗区发现的甘蔗病害为16SrXI-B亚组植原体引起的甘蔗白叶病。     

草鱼细菌性败血症的病原检测

[目的]分离和鉴定草鱼细菌性败血症的主要致病菌。[方法]首先,采集患病草鱼的肝、脾、肾等器官,分别进行病原菌的分离培养;然后,将各自分离菌种进行镜检、生理生化指标鉴定以及16SrRNA基因序列测定;最后进行人工再感染试验。[结果]分离得到的菌株。经菌体形态、致病性、培养性状、生理生化反应和16SrRNA序列分析鉴定为同一种菌种,即嗜水气单胞菌。人工再感染的草鱼出现了与自然感染草鱼相同的症状。[结论]嗜水气单胞菌是引起草鱼细菌性败血症的主要致病菌。     

我国亚热带地区快生型大豆根瘤菌遗传多样性研究

利用16S rDNA PCR-RELP、16S rDNA基因序列分析以及16S-23S rDNA IGS PCRRELP技术,对分离自我国江苏盐城、浙江温州、湖北仙桃及重庆等亚热带地区的31株大豆快生型根瘤茵(fast-growing rhizobia)进行了群体遗传多样性研究.16S rDNA PCR-RELP分析结...     

副猪嗜血杆菌的分离与鉴定及其16S rRNA 生物信息学分析

从湖南省内送检的疑似患多发性浆膜炎与关节炎的猪病料中分离到12株细菌,细菌学试验证明12株细菌均符合副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)形态、培养和生化特性.根据HPS 16S rRNA序列设计引物对12株细菌进行PCR扩增,均得到预期目的条带,将扩增片段测序并运用DNAStar软件与GenBank中不同血清型HPS基因序列进行比对,表明其与Genbank中已公布的不同血清型HPS菌株16S rRNA序列的同源性为90.4%~99.9%,其中与血清5型同源性最高,对所测序列与参考序列进行遗传进化树分析,结果表明其中11株属于血清5型HPS.     

芝麻粕降解菌株的筛选诱变及鉴定

从自然界筛选得到一株能够降解芝麻粕粗蛋白的菌株LQ,对其16S rRNA基因序列进行了测定,构建了分子系统发生树,分析了相关细菌相应序列的同源性。结果表明:菌株LQ的16S rRNA基因序列长度为1 447 bp,与芽孢菌属等细菌的16SrRNA基因序列自然聚类,在检索出的芽孢杆菌序列中,该菌株与解淀粉芽孢杆菌的同源性达99%,为解淀粉芽孢杆菌。对菌株LQ进行紫外诱变,其蛋白酶活力587.3 U/mL。     

rRNA基因间隔区序列用于亲缘关系密切的根瘤菌种群鉴定及系统发育分析

通过rRNA基因内转录间隔区的碱基序列分析,对中华根瘤菌属Sinorhizobium、慢生根瘤菌属Bradyrhizobium和中慢生根瘤菌属Mesorhizobium种间亲缘关系十分密切的菌株进行区分．结果表明,rRNA基因间隔区序列能很好地区分种间亲缘关系十分密切的菌株．用rRNA基因间隔区序列构建的系统发育树与rRNA基因序列构建的系统发育树结果十分相似．     

蓝细菌与福建苏铁(Cycad revoluta)的侵染性重组的研究

将苏铁珊瑚状根及根周围的土壤中分离的蓝细菌分离物与福建苏铁(Cycas revoluta)在实验室条件下进行重组。通过比较重组前后蓝细菌分离物的STRR指纹图谱和16S rRNA的序列得蓝细菌分离物RZHA4能重新侵染苏铁的珊瑚状根。通过NCBI比对,蓝细菌分离物RZHA4的16S rRNA序列与蓝细菌NostocaceaeIL13-1的相似性为99%。     

锦鲤维氏气单胞菌感染症及其病原生物学特性研究

[目的]报道锦鲤的发病情况及其病原的主要生物学性状。[方法]对5尾发病及新鲜病死的锦鲤病变组织进行细菌检查及分离,对分离菌进行形态特征、理化特性等表观分类学指征鉴定;同时择代表菌株进行16S rRNA基因的分子鉴定、健康锦鲤的人工感染试验和药敏试验。[结果]根据2株分离菌的形态特征及理化特性,结合16S rRNA序列测定与系统发育分析结果,判定其为气单胞菌属的维氏气单胞菌,其代表菌株HC050630A-1的16S rRNA基因序列长度为1457bp。人工感染试验表明,HC050630A-1株具有较强的致病作用。药敏试验结果显示,HC050630A-1菌株对供试37种抗菌药物中的头孢拉定等16种高度敏感,对头孢唑啉等13种敏感,对青霉素G等8种药物耐药。[结论]该研究为对该病的有效检验与防制等提供参考。     

嗜热蛋白酶生产菌DPE7的16 S rRNA基因克隆及系统发育

[目的]确定嗜热蛋白酶生产菌DPE7的系统发育地位。[方法]通过PCR方法扩增出嗜热蛋白酶生产菌DPE7的16 S rRNA基因片段,并对其进行了克隆和测序。[结果]对该序列在GenBank中的BLAST结果表明,相似性高于99%的序列中大部分是泥土芽胞杆菌的16 S rRNA基因序列,其中与Geobacillus toebii T1680的16 S rRNA基因序列相似性达99.60%。对菌株DPE7和其他13株泥土芽胞杆菌的16 S rRNA基因序列进行系统发育分析,菌株DPE7与其中的4株泥土芽胞杆菌聚类在一起。[结论]经16 S rRNA基因序列同源性比较和系统发育分析,确定菌株DPE7为泥土芽胞杆菌。     

发病罗非鱼苗沃氏葡萄球菌的分离与鉴定

为检测发病罗非鱼苗中可能存在的潜在病原感染,保证投放鱼苗的健康安全,对海口市发病罗非鱼苗进行了菌种分离.结果发现,在发病鱼苗中存在葡萄球菌,经16S rRNA基因序列测定,显示该菌与沃氏葡萄球菌和巴斯德葡萄球菌高度相似,后经超氧(化)物歧化酶sodA基因PCR分析,确认为沃氏葡萄球菌.