布氏锥虫马媾疫亚种体外培养的研究

用小白鼠腹腔巨噬细胞滋养层系统和无细胞培养系统成功地培养了布氏锥虫马媾疫亚种。开始建立无细胞培养系统培养时,从第6天起每日补种少量滋养层细胞系统培养的虫体,于3周内逐步建立了适应于无细胞培养系统的锥虫群体。长期连续培养两种系统培养物的虫密度均可稳定保持在7—10.O×10~5/ml左右,虫体有规律地呈岛屿状密集分布。培养液内2—ME和马血清的适宜浓度分别为0.3mM和20%,添加0.1mM次黄嘌呤可使培养物虫密度增加1倍左右,用烛罐可取代CO_2培养箱。体外连续培养120天。锥虫仍保持细长形态,具表面被膜,对小白鼠有感染性。     

一起马媾疫的扑灭

20 0 0年 2至 5月 ,兰坪县河西乡玉狮场自然村的马发生了公马阴囊、包皮、阴茎水肿 ,母马阴户、乳房肿胀为主要特征的流行病。经治疗的马匹痊愈 ,诊断为马媾疫。玉狮场 5 4户农户共饲养 4 8匹马属动物 ,畜主杨某从外地购回饲养的 1匹公马出现阴囊水肿 ,用抗菌素治疗无效。随即该村马属动物相继发病 14匹 ,占饲养总数的 2 9 2 %。1　症状病畜大多经过水肿、丘疹和麻痹等过程。在生殖器官引起尖性水肿。公马以阴茎鞘膜的水肿开始 ,逐渐波及至阴囊 ,母马阴户肿胀 ,波及至乳房。随着病情的发展 ,患畜水肿延伸到腹下 ,四肢内侧等部位。肿胀呈面团…     

伊氏锥虫和媾疫锥虫蛋白组分的电泳分析

应用SDS—PAGE和IEF电泳对伊氏锥虫和媾疫锥虫的蛋白组分进行了分析.在SDS—PAGE中,伊氏锥虫有21条带.媾疫锥虫有19条带,两种虫体的蛋白质区带在分子量40000～90000之间存在差异,尤其表现在表面糖蛋白上,伊氏锥虫为43000,媾疫锥虫为60000.在IEF电泳中,伊氏锥虫出现26条带,媾疫锥虫出现33条带,两种虫体的蛋白质区带在等电点4.8～5.6之间相同,而在5.6～7.0之间存在差异.本实验还对马媾疫锥虫的蛋白质进行了双相电泳分析,显示出86个多肽斑点.     

应用质粒PTK探针鉴定锥虫的初步研究

用^32P标记质粒探针PTK1、PTK1.1和PTK1．2，对12株中国伊氏锥虫的斑点杂交试验显示，3个探针均能与8株具有正常动基体的伊氏锥虫杂交，而不与其余4株异常动基体伊氏锥虫杂交，对正常动基体株的敏感度为10^2虫体。探针PTK1亦能与马媾疫锥虫杂交，敏感度为10^2个虫体。但PTK1与布氏锥虫仅发生微弱的杂交反应．敏感度为10^5个虫体。试验表明伊氏锥虫株之间的kDNA微环是同源的，伊氏锥虫与马媾疫锥虫和布氏锥虫的kDNA微环存在着共同序列。     

马媾疫锥虫SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法的建立

为建立一种特异、快速的媾疫锥虫检测方法,本研究通过PCR方法从马媾疫锥虫动基体基因组中扩增得到395 bp的特异的保守序列,将其克隆到pMD-18T载体中构建重组质粒标准品,以10倍倍比稀释的质粒标准品为模板,进行SYBR GreenⅠ荧光定量PCR扩增并制作标准曲线,建立马媾疫锥虫荧光定量PCR的检测方法。结果表明:该方法的检测灵敏度可达到1拷贝/μL,并且与马属动物其他传染病无交叉反应。其组间及组内变异系数分别小于3.183%和3.842%。该方法的建立为快速及特异性检测马媾疫锥虫提供了有效的方法。     

刚地弓形虫18S rDNA基因的克隆与序列分析

采用PCR方法从弓形虫RH株和CN株总DNA中分别扩增到18S rDNA基因，与pGEM-T easy vector连接，并进行DNA测序分析。结果表明，2个虫株均扩增出1745bp的片段，用DNAMAN软件对其与GenBank上2个虫株相应序列进行同源性比较，4个虫株的同源性为99．34％。刚地弓形虫虫株在不同宿主和不同区域上存在着一定的差异。     

火鸡隐孢子虫18S核糖体DNA部分序列测定与系统发育分析

从长春地区鸭的粪便中分离纯化了火鸡隐孢子虫（Cryptosporidium meleagridis）卵囊，根据隐孢子虫18S rDNA基因序列设计合成引物，用PCR扩增了卵囊基因组DNA大小586bp的片段，PCR产物经电泳鉴定后用试剂盒回收纯化，纯化后PCR产物直接测序，将测得的序列用Dnastar软件分析并与国外已发表的相应序列进行了同源性比较，并绘制了系统发育进化树。结果初步建立了火鸡隐孢子虫的PCR检测方法，序列分析显示长春外国语源火鸡隐孢子虫与国外9株隐孢子虫相应序旬同源性在82.7%-99.8%之间，其中与国外火鸡源火允隐孢子虫相应序列同源性为85.3%；与C.felis同源性最低，与C.muris同源性最高。本研究为火鸡隐孢子虫病诊断及该病分子流行病学研究打下了良好基础。     

菲菜氏温扬球虫18S rDNA基因的扩增与克隆分析

菲莱氏温扬球虫是鸭球虫病的重要病原之一,为了寻找种特异性的遗传标记,本研究采集广东省某鸭场的新鲜鸭粪,通过Sheather's蔗糖漂浮法收集球虫卵囊,经形态学鉴定为菲莱氏温扬球虫;提取该球虫DNA样品,经过PCR扩增,首次获得了该虫的18S rDNA基因部分片段;对该基因进行了克隆和测序,比较了该虫株与其他原虫的亲缘关系.结果显示,对菲莱氏温扬球虫序列与艾美耳科其他球虫关系较近,系统进化树分析属于艾美耳科的另一分支.表明18S rDNA基因在鸭菲莱氏温扬球虫的分类鉴定上是一种有效的分子标记.     

肠艾美尔球虫纯种分离及18S rDNA部分序列测定

采用单卵囊分离技术,分离肠艾美尔球虫。根据GenBank中发表的肠艾美尔球虫18SrDNA序列,设计一对引物,建立PCR方法对其基因片段扩增并测序、比对。结果成功分离肠艾美尔球虫,PCR扩增出清晰条带,大小为528bp,最低能检出27个孢子化卵囊。该序列测定结果与Genebank发表的肠艾美尔球虫18SrDNA比对,相似性达98.5%。     

3种兔球虫18S rDNA部分序列测定与系统发育分析

采用单卵囊分离法从河北某兔场分离大型艾美耳球虫、黄艾美耳球虫及肠艾美耳球虫,接种无球虫兔后获得大量纯种卵囊,CTAB法提取孢子化卵囊基因组DNA。利用艾美耳属球虫18S rDNA保守引物,PCR扩增3种兔球虫18S rDNA片段,产物纯化后测序。将3种球虫18S rDNA测序结果与GenBank中发布的兔球虫18S rDNA序列用DNAStar软件进行比对。使用MEGA4.0软件对兔球虫18S rDNA进行同源性比较,并绘制遗传进化树。结果表明,大型艾美耳球虫扩增出大小为1 521bp的18S rDNA片段;黄艾美耳球虫及肠艾美耳球虫均扩增出大小为1 520bp的18S rDNA片段。序列比对结果显示,3种河北株兔球虫与GenBank中相应的3种兔球虫18S rD-NA(EF694016、EF694011、EF694012)相似性分别为99.6%、99.6%和100%。3种河北株兔球虫序列和GenBank中兔球虫18S rDNA序列(EF694007-EF694017)位于一个单系集群。     

家蚕核糖体18S RNA基因的序列分析及分子系统学研究

为研究家蚕18S DNA基因的特点及分子进化,以家蚕丝腺为材料提取家蚕基因组DNA,通过PCR扩增、测序鳞翅目家蚕(Bombyx mori)核糖体小亚基18S RNA基因(18S rDNA)的全序列,将该序列与等翅目、直翅目、衤责翅目、鞘翅目、膜翅目、双翅目、捻翅目、弹尾目、蜉蝣目各一种昆虫的18S rDNA进行了比较。用DNAstav软件分析并进行序列比对,结果表明,昆虫18S rDNA有4段序列较为保守,以18S rDNA比对的第2保守区段构建的分子系统发育树表明鳞翅目和双翅目、膜翅目、鞘翅目进化关系最近,等翅目、直翅目、衤责翅目进化上较为接近,捻翅目昆虫与弹尾目昆虫的亲缘关系较为接近,捻翅目在分类上应是一种古老的昆虫。     

18S rRNA／rDNA序列分析技术在瘤胃原虫分类学研究中的应用

作者指出了反刍动物瘤胃原虫分类学研究中的难点，介绍了原虫分类学中新兴的分子生物学指标(18S rRNA／rDNA序列同源性)，综述了18S rRNA／rDNA序列分析技术在瘤胃原虫分类研究中的应用。     

鸡艾美耳球虫18SrDNA序列与系统进化分析

为了确定鸡艾美耳球虫（Eimeria）不同种以及来自不同地区同种不同株之间的亲缘关系,研究其分类地位,对实验室保藏的柔嫩艾美耳球虫（Etenella）、毒害艾美耳球虫（Eneeatrix）、巨型艾美耳球虫（Emaxima）、堆形艾美耳球虫（Eaaervulina）等4种15株鸡球虫孢子化卵囊的18SrDNA基因进行克隆、测序,并与从GenBank下载的鸡球虫18SrDNA序列一起,使用软件DNAstar 5．0 MegAlign进行系统发育分析。结果显示,4种艾美耳球虫种间同源性在94．6％～99．4％之间,7株柔嫩艾美耳球虫的株间同源性在99．0％-99．9％之间,5株巨型艾美耳球虫的株间同源性在96．9％～99．8％之间。用该4种鸡球虫的18SrDNA序列与GenBank下载的另外4种鸡球虫18SrDNA序列构建系统发育树,显示这8种鸡艾美耳球虫形成2个分支,即堆形艾美耳球虫（EASH）、巨型艾美耳球虫（EMSH）、变位艾美耳球虫（Emivati）、和缓艾美耳球虫（Emitis）、布氏艾美耳球虫（Ebrunetti）、早熟艾美耳球虫（Epraecox）构成1个分支,柔嫩艾美耳球虫（ENSH）、毒害艾美耳球虫（ETAS）构成另1分支。巨型艾美耳球虫、柔嫩艾美耳球虫各株的系统发育树均根据地域关系产生2个分支。柔嫩艾美耳球虫、毒害艾美耳球虫的亲缘关系较近,不同地理区域的同种不同株的亲缘关系相对较远,种间和种内的鉴定结果与普通生物学结果一致。本研究提示18SrDNA基因可用于鸡球虫不同种／株的分类鉴定,为艾美耳球虫分子遗传学鉴定提供了理论基础。     

通过16S rDNA全序列分析及鉴定牛沙门氏菌

通过16S rDNA全序列的DNA同源性分析以及PCR-RFLP分析,对从山东某奶牛场送检的腹泻死亡的犊牛内脏中分离到的一株沙门氏菌进行了血清型鉴定,得到其系统发育树状图。系统发育树分析表明,该沙门氏菌菌株与GENEBANK上发表的27株沙门氏菌的16S rDNA同源性较高,为97-99％,该沙门氏菌菌株与鼠伤寒沙门氏菌LT2（Salmonella typhimurium LT2）的同源性最高,达到了99．7％,表明该沙门氏菌菌株为鼠伤寒沙门氏菌。