绵羊生长激素(oGH)的分子克隆与序列测定

本文旨在新疆绵羊生长激素(oGH)基因的克隆。从阿勒泰×中国美利奴杂交羊脑垂体细胞中提取总RNA,分离得到具翻译活性的mRNA。用RTPCR方法扩增出编码oGH的基因,长度为671bp。将扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后,回收纯化。采用PCR克隆试剂盒将扩增产物连接至pTAdv质粒上,经PstI和XbaI双酶切鉴定正反插入后,筛选正向插入阳性克隆,并进行序列分析。结果表明克隆到的oGH基因序列与国外报道的序列有4个碱基差异,但所推导的氨基酸序列完全一致。oGH基因的开放阅读框架共含654个核苷酸,编码217个氨基酸,其中信号肽26个氨基酸,编码碱基为1～78(78bp);成熟肽191个氨基酸,编码碱基为79～651(573bp);终止密码子TAG(652～654bp)。其蛋白质的氨基酸序列与牛、人和鱼的序列同源性分别为99.08%、26.7%和5.9%。     

水牛白细胞介素-2基因的克隆及其序列分析

根据GeneBank上发表的牛IL-2基因序列,设计一对引物,采用RT-PCR技术,以ConA刺激培养9h、17h的沼泽型水牛外周血淋巴细胞为材料,从总RNA中扩增出水牛IL-2基因.琼脂糖凝胶电泳显示扩增片段约为724bp,分离纯化,克隆到pMD18-T载体.经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切鉴定,以及核苷酸测序结果显示,克隆的水牛IL-2基因与GeneBank上发表的序列同源性为99.8%.     

绵羊PRND基因序列分析

Doppel是一种新发现的朊蛋白样糖蛋白,与PrP相类似,编码Dpl蛋白的基因称作PRND,鼠、人,以及其他哺乳动物的PRND位于PRNP下游16 kb的地方[1].Dpl与PrPC(cellular prion pro-tein)C端的三分之二具有25%的序列同源性;Dpl与PrP在二级结构和拓扑学上具有极大的相似性,均包含3个α螺旋和2个二硫键,但是在N端Dpl则缺乏存在于PrPC中八肽重复区域[2-4].     

猪Toll样受体2基因的克隆和序列分析

本研究从猪肠系膜淋巴细胞中，克隆了猪Toll样受体2基因（pTLR2）。基因序列分析表明，克隆的pTLR2基因ORF为2358bp，编码785个氨基酸，合15．01％的亮氨酸，合有一段21个氨基酸的信号肽序列；与GenBank中登录的pTLR2序列（NM213761）的同源性为99．2％；与牛、马、绵羊和人的同源性较高，与家鼠、中国仓鼠相比次之．而与鱼类的最低。蛋白分子结构预测表明，该分子由胞外区（588个氨基酸）、跨膜区（23个氨基酸）和胞内区（174个氨基酸）组成，其胞外结构域由多个串联重复的LRR基序（XLXXLXLXX）组成，而胞内区合有与人白细胞介素1受体（IL-1R）高度同源的区域即TOLL／IL-1受体同源区（TIR），说明pTLR2分子具有病原分子模式识别和信号传导的作用，这为其结构与功能的进一步研究奠定了基础。     

箭箸豌豆甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因片段的克隆及序列分析

本研究预期通过同源克隆获得了箭菩豌豆(Vicia sativa)甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)基因的部分片段,为研究箭菩豌豆适应高海拔环境的分子机制奠定基础.根据近缘物种GAPDH基因序列设计1对引物,通过RT-PCR技术克隆获得了一段长度1141 bp的序列.生物信息学分析表明,该序列编码的381个氨基酸,与其...     

不同禽源副黏病毒分离株F基因的克隆与序列分析

分别对鸡源、鸭源、鹅源新城疫病毒(NDV)强毒分离株(WF00C、WF00D、WF00G)的F基因进行RT-PCR扩增、克隆和序列测定,并对其核苷酸和推导氨基酸序列进行分析.结果表明,各分离株F基因均含1个完整的开放阅读框(ORF),全长为1662 bp,编码553个氨基酸,有6个潜在的糖基化位点,裂解位点区的氨基酸序列均为112R-R-Q-K-R-F117,与强毒株特征相符,具有第101位的K(赖氨酸)和121位的V(缬氨酸),符合基因VK型NDV特征;WF00C株有13个半胱氨酸(Cys)残基,WF00D株和WF00G株各有12个Cys残基;在限制性内切酶(RE)位点(nt334～1682)的分布上,3个毒株均存在多数鹅源分离株特有的973 nt和1249 nt Rsa Ⅰ位点;WF00D株与WF00C株、WF00G株以及GenBank的15株各基因型代表株的F基因编码区同源性进行比较,其核苷酸序列同源性为84.7 %～99.3%,推导的氨基酸序列同源性为88.4%～98.9%;3个分离株间的同源性较高,其与ZJ1、SF02和NA_1等鹅源毒株之间差异较小,而与LaSota、F48E9等毒株之间差异明显.根据NDV系统发育进化树、酶切位点分析以及基因分型结果,证明它们的基因型均为Ⅶd亚型.     

鹅细小病毒NS2基因的克隆和序列分析

本研究参考CerBank发表的GPV B株全基因序列，设计并合成一对引物，通过PCR技术扩增出GPV H1株NS2基因，目的片段长约1．4kb，将目的片段克隆到pMD18-T载体后进行序列测定和分析，结果表明：GPV H1株NS2基因全长1356bP，编码451个氨基酸，与国外已发表的GPV B株相比核苷酸序列同源性为98．75％，推导氨基酸序列同源性为98．67％。     

鹅细小病毒NS2基因的克隆和序列分析

参照GenBank发表的GPVB株全基因序列,设计并合成一对引物,通过PCR技术扩增出GPVS1株NS2基因,目的片段长约1.4kb,将目的片段克隆到pMD18-T载体后进行序列测定和分析,结果表明:GPVS1株NS2基因全长1356bp,编码451个氨基酸,与国外已发表的GPVB株相比核苷酸序列同源性为98.89%,推导氨基酸序列同源性为98.89%。     

伪狂犬病病毒Min-A株gD基因的克隆及其真核表达质粒的构建

参考GeneBank收录的伪狂犬病病毒gD基因的序列设计了一对引物,对PRV Min-A株进行了PCR扩增,扩增产物克隆于pGEM-T Easy载体.对重组质粒PGTE-gD进行限制性内切酶分析和基因测序,证实了克隆片段的可靠性.测序结果表明目的片段包含一个1203bp的开放性阅读框(ORF),编码400个氨基酸组成的多肽.将gD基因亚克隆至真核表达载体pcDVA3.1-的CMV启动子下游,构建了真核表达质粒pcDNA-gD,为下一步基因免疫奠定了基础.     

鸡白细胞介素-17基因的克隆和序列分析

根据GenBank中收录的鸡白细胞介素-17（ChIL-17）基因的cDNA序列设计了1对特异性引物，以经ConA刺激3h的鸡脾淋巴细胞总RNA为模板，用RT-PCR方法成功克隆了ChIL-17的cDNA。该cDNA全长725bp，其中第2～508位是该基因的阅读框（ORF），共编码169个氨基酸。与已报道的序列相比较，二者核苷酸序列的同源性为99．6％（722／725），共有3个碱基发生变异，其中有2个变异位于阅读框之内。DNAssit软件分析表明，二者推导的氨基酸序列同源性为100％。同时，以鸡脾淋巴细胞DNA为模板，用PCR方法首次扩增获得了ChIL-17的基因组DNA序列，经序列分析，其序列全长1934bp，由2个内含子和3个外显子组成，3个外显子分别位于第2～27、569～815和1484～1720bp处。     

口蹄疫病毒3ABC基因遗传关系分析

参考GenBank中发表的猪源O型口蹄疫病毒3ABC的基因序列。设计一对特异引物,分别以5株猪源O型FMDV流行毒株基因组RNA为模板。通过RT-PCR的方法获得3ABC基因,并克隆到pMD18-T载体中。测序结果显示,5株O型FMDV流行毒株的3ABC基因cDNA均为1281bp。编码由427个氨基酸残基组成的多肽。同源性比较和系统发育树分析表明,5株O型FMDV流行毒株亲缘关系密切,属同一基因型。     

腐败梭菌α毒素基因的克隆与序列分析

应用聚合酶链式反应(PCR)技术,从腐败梭菌强毒株C55-1中,扩增出大小为1327bp的腐败梭菌α毒素全基因(csa1327基因),并将其克隆入pMD18-T载体中.转化至受体菌DH5α后,经Amp/IPTG/X-Gal选择培养,提取质粒,PCR和EcoRⅠ/PstⅠ双酶切鉴定,筛选阳性重组克隆.核苷酸序列分析证实,csa1327基因开放阅读框架由1320bp组成,编码440个氨基酸残基.与GenBank中登录的国外Fukushima 5株、Kagoshima 1株、Mie株和44株的α毒素全基因相比,核苷酸同源率分别为100%、99.47%、99.25%和97.67%,推导氨基酸的同源率分别达100%、100%、99.7%和97.06%.表明本实验所克隆的csa1327基因即为腐败梭菌α毒素基因.     

口蹄疫病毒3ABC基因的扩增与序列分析

参考GenBank中发表的猪源O型口蹄疫病毒(FMDV)3ABC的基因序列,设计一对特异引物,分别以5株猪源O型FMDV流行毒株基因组RNA为模板,通过RT-PCR的方法获得3ABC基因,并克隆到pMD18-T载体中.测序结果显示:5株O型FMDV流行毒株的3ABC基因cDNA均为1 281bp,编码由427个氨基酸残基组成的多肽.同源性比较和系统发育树分析表明:5株O型FMDV流行毒株亲缘关系密切,属同一基因型.     

猪胞内劳森菌16SrRNA基因的克隆及序列分析

胞内劳森菌(Lawsoniaintracellularis,LI)是猪增生性肠炎的病原,本试验设计3条引物,采用半巢式PCR,从猪的回肠粘膜中扩增出长为1 457 bp的胞内劳森氏菌16SrRNA基因,并进行序列比较分析.结果表明,与不同动物源性(鼠、仓鼠、鹿、马、鸵鸟等)的增生性肠炎胞内菌核苷酸同源性在98.4%～100%之间,与脱硫弧菌同源性达到88.6%,与一般弯曲杆菌和螺旋体同源性较低(71.8%～73.9%).     

堪萨斯分枝杆菌α抗原信号肽基因的克隆和序列分析

卡介苗（ｂａｃｉｌｕｓｃａｌｍｅｔｅ－ｇｕｅｒｉｎ,ＢＣＧ）是一种活的减毒性结核菌苗。目前,国内外科学家正致力于运用基因重组技术,将ＢＣＧ发展成一种新型重组活载体疫苗［１,２］。本研究对堪萨斯分枝杆菌α抗原信号肽基因进行了ＰＣＲ扩增、克隆和序列分析,...     

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌毒素Ⅰ基因的克隆、序列分析及表达

参照猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清型Ⅰ菌株序列设计了一对特异性引物，用PCR方法扩增毒素Ⅰ基因，得到约920bp的片段，与参考序列的核苷酸同源性达99．3％，定向克隆到pET32a（＋）中，转化BL21（DE3），经诱导后，毒素Ⅰ基因得到高效表达，Westemblot鉴定呈阳性。