鸭混合感染病例中鸭坦布苏病毒的分离鉴定与E基因序列分析

对山东省滨州某鸭场2013年送检的疑似鸭瘟或鸭坦布苏病毒感染的临床病料,通过PCR检测进一步确诊为鸭瘟与鸭坦布苏病毒混合感染,并分离到了鸭瘟与鸭坦布苏病毒混合感染毒,为获得单一的鸭坦布苏病毒,利用鸭瘟阳性血清对分离病毒连续进行2次中和试验,接种10日龄SPF胚并连续传3代,收获尿囊液,通过PCR鉴定获得了单一的鸭坦布苏病毒。对分离毒进行ELD50及血凝性等相关测定,并RT-PCR扩增全长E基因,进行序列分析。研究成功得从鸭瘟与鸭坦布苏病毒混合感染的病料中分离到鸭坦布苏病毒,为鸭坦布苏病毒的致病机理等基础性研究以及相关疫苗与诊断试剂的研制奠定了基础。     

鸭坦布苏病毒对雏鸭的致病性研究

为研究鸭坦布苏病毒对雏鸭的致病性,对1周龄樱桃谷雏鸭肌肉接种坦布苏病毒FX 2010株,建立雏鸭感染模型,动态观察感染雏鸭的临床表现、病理变化、组织病毒含量及免疫反应。结果显示,雏鸭攻毒后第3天食欲下降,排黄白色稀粪,第5天时出现神经症状,部分雏鸭急性死亡,死亡率高达22.5%(9/40)。剖检病、死鸭可见心内膜出血,脾肿胀、坏死,肝、肾变性肿胀,脑膜充血。感染雏鸭的组织病理学变化主要表现心、肝、肾实质细胞变性、坏死,间质炎性细胞浸润或见出血;脾淋巴细胞局灶性坏死并伴有大量异嗜性粒细胞浸润;大脑呈典型的病毒性脑炎变化。雏鸭感染后第1天各器官就能检测到坦布苏病毒,第3天器官病毒含量除脾外均达峰值,后逐渐下降。雏鸭攻毒后第5天血清中出现微弱的中和抗体,以后逐渐升高,第17天时达峰值。以上结果表明,鸭坦布苏病毒感染雏鸭后能迅速入侵机体各组织器官并大量复制,呈组织泛嗜性特征,造成全身广泛性组织损伤,重症雏鸭死于急性败血症病变。雏鸭接种病毒后能快速产生中和抗体以抵抗感染并迅速清除病毒。     

鸭坦布苏病毒研究进展

2010年以来中国大部分种鸭和蛋鸭养殖地区相继发生了以减料、产蛋下降和伴有一定死淘率为特征的传染病。该病发病急,传播快,死淘率高,给中国的养禽造成巨大的经济损失,仅2010年给中国的养鸭业造成的损失达50亿元。随着研究的深入,该病被确诊为是由一种新型病毒-鸭坦布苏病毒引起的传染病,本文围绕着该病的流行病学、临床症状、病理变化、病毒生物学特性、病毒检测方法及致病力等方面的研究进展进行综述,旨在为鸭坦布苏病的防控提供科学依据。     

鸭坦布苏病毒山东流行株的分离鉴定及其基因组序列分析

为了解山东省鸭坦布苏病毒(duck tembusu virus,DTMUV)的流行与变异情况,对2018年下半年至2019年上半年泰安、济宁和淄博等地送检的临床病鸭样品进行了DTMUV病原学检测,并对阳性病料进行病毒分离鉴定及分离株的全基因组序列分析。结果显示:从102份样品中,共检测到8份DTMUV阳性,阳性率检出率为7.8%,从阳性病料中分离到3株DTMUV分离株;3个分离株基因全长均为10 993 bp,彼此间的氨基酸同源性为99.2%～99.3%,与24个参考毒株的同源性为95.8%～99.9%,均属于中国株I型;与参考毒株相比,分离株的核衣壳蛋白C、囊膜蛋白E和非结构蛋白NS1的同源性相对较低,分别为86.1%～99.2%,95.0%～99.4%和92.3%～99.7%,同时存在数量不等的氨基酸突变位点,但关键的蛋白结构和潜在的糖基化位点无差异。结果表明,DTMUV在山东部分地区仍有流行,但流行毒株基因结构及致病特性与经典毒株相比无明显变化,但应持续关注和深入研究。     

1株鸭坦布苏病毒人工感染雏鸭的病理学研究

7日龄雏鸭经肌肉接种坦布苏病毒BZ株1周后,发病率100%,死亡率为80%。接种鸭全身多数器官出现充血、出血、坏死等症状,病理学变化主要表现在肝实质严重变性、坏死;脾淋巴细胞局部减少;肾小管上皮细胞肿胀;肺淤血,内有大量细胞渗出;胰腺中可见凝固性坏死灶;大脑软脑膜充血、水肿,小脑脑膜上炎性细胞浸润。鸭接种该病毒后,攻毒组的丙氨酸氨基转移酶、天门冬氨酸氨基转移酶、谷氨酰胺转移酶、乳酸脱氢酶水平和血清尿酸的浓度较对照组明显升高。结果表明:坦布苏病毒BZ株可造成全身多器官的病理性损伤以及主要血液生化指标的显著变化,这可能是该病毒致病性的重要机制之一。     

鸭坦布苏病毒分离鉴定及其囊膜蛋白遗传进化分析

【目的】 了解并掌握鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus,DTMUV)流行特点及病毒生物学特性,为DTMUV防治提供理论依据和技术支撑。【方法】 通过细胞及鸡胚接毒试验对河北某鸭场10只具有典型临床症状的发病鸭进行病毒分离,用RT-PCR、透射电镜观察、Western blotting及间接免疫荧光试验(IFA)等方法鉴定,进行动物回归试验测定病毒毒力并对其进行囊膜蛋白遗传进化分析。【结果】 分离到的病毒可在DF-1细胞上稳定增殖产生典型细胞病变效应(CPE)并致死鸡胚;病毒纯化后经电镜观察可见直径30~60 nm的病毒粒子;RT-PCR结果显示,在约270 bp处可见单一条带,与DTMUV预期大小一致;Western blotting结果显示,在60 ku处有特异性条带,与E蛋白大小一致;IFA结果表明,接种病毒的DF-1细胞胞质中可见明亮的特异性荧光,以上结果均表明分离的病毒为DTMUV。将分离到的病毒命名为AX2020株,AX2020株经肌内注射感染北京鸭后感染率高达100%,发病鸭产生神经症状及腹泻等典型临床症状;经序列比对发现AX2020株和GA株(MK907880.1)相似性最高,与SD14毒株(MH748542.1)亲缘关系较远。与商品灭活疫苗毒株HB2010株(MN649262.1)和活疫苗毒株FX2010株(MH414568.1)相比,AX2020株第93、277和487位氨基酸发生了的突变。【结论】 成功分离得到1株DTMUV AX2020株,分离毒株对北京鸭具有较强的致病性,AX2020株的囊膜蛋白与国内疫苗毒株相比,已经发生了氨基酸位点的突变,结果为鸭坦布苏病毒病的流行病学及后续疫苗相关研究奠定了一定的基础。     

鸭坦布苏病毒在雏麻鸭体内的分布及排毒

为了解鸭坦布苏病毒感（Duck Tembusu virus, DTMUV）染麻鸭的组织嗜性和排毒情况,应用RT-PCR方法检测鸭坦布苏病毒在麻鸭体内各组织的动态分布及和泄殖腔棉拭子的排毒情况。结果显示最早在感染第1 d于心脏、脾脏、肺脏、气管、胰腺、直肠可检测到鸭坦布苏病毒核酸的存在;至第7、9 d时,在各组织脏器中均仍能检测到该病毒核酸;至第21 d时,仅能在脑、胰腺和直肠中可检测到病毒核酸。病毒在脑和直肠中时间最长（25 dpi）,胰腺（21 dpi）和肝脏（21 dpi）次之。对不同时间采集的泄殖腔棉拭子检测结果显示,于感染第1 d即能检测到该病毒核酸,25 d后即检测不到该病毒的存在。以上检测结果表明鸭坦布苏病毒感染雏麻鸭后能迅速入侵麻鸭各组织脏器,主要侵染肝、肺、肾、胰腺和直肠,并可通过粪便等途径向外界排毒。     

鸭坦布苏病毒SC2013株的分离鉴定

利用RT-PCR从疑似鸭坦布苏病毒感染的致死产蛋鸭的肝、脾和卵泡膜等组织中扩增出鸭坦布苏病毒E基因,并利用10日龄鸭胚分离出病毒SC2013株。该毒株对氯仿和胰蛋白酶敏感,不凝集鸡红细胞;E基因核苷酸序列与坦布苏病毒GX2013G(Gen Bank:KM275941.1)的相似性在99%以上;对10日龄鸭胚的半数致死量为10-4.59/0.2 m L,人工接种能引起2日龄雏鸭发病死亡并呈现典型的临床症状与病理变化。以上结果表明,分离病毒SC2013株为致病性的鸭坦布苏病毒,在今后养鸭业中除注重鸭坦布苏病毒对产蛋鸭的危害外,也应加强防止幼龄鸭感染。     

鸭坦布苏病毒对雏鸭免疫系统的影响

为研究鸭坦布苏病毒(DTMUV)对雏鸭免疫系统的影响,本试验对5日龄雏鸭静脉接种DTMUV,并于接种后不同时间取雏鸭脾脏、胸腺、法氏囊进行组织病理学、抗原和凋亡检测。结果显示,DTMUV感染雏鸭的脾脏、胸腺、法氏囊均严重受损。接种DTMUV后4d,脾脏淋巴细胞减少,胸腺可见严重细胞崩解和大面积坏死区域,法氏囊滤泡轻度萎缩;接种后6d免疫器官病变最为严重,其中胸腺静脉严重栓塞,淋巴细胞变性坏死,空泡化也更加严重;接种后8d免疫器官病变均有所减轻,至16d,免疫器官结构基本恢复正常。通过免疫组织化学方法在感染雏鸭的脾脏、胸腺、法氏囊中均检测到DTMUV抗原;细胞凋亡试验显示DTMUV能够显著引起脾淋巴细胞凋亡。综上所述,DTMUV可严重损伤雏鸭免疫器官,且这种损伤常发生于感染早期,并于感染后8d出现好转。     

鸭坦布苏病毒SCCD2020株的分离鉴定及其E基因、NS1基因序列分析

为确诊四川某鸭场11日龄樱桃谷雏鸭死亡原因,本研究采集送检鸭只的肝、脾、脑组织,经研磨处理,利用BHK-21细胞及鸭胚成纤维细胞培养及RT-PCR鉴定,从送检的疑似鸭坦布苏病毒感染的病料中分离出一株鸭坦布苏病毒,将其命名为SCCD2020株.利用PCR方法对分离株E基因及NS1基因进行克隆,并对两基因序列进行分析,结果...     

鸭肠炎病毒基因组末端的克隆及序列分析

根据已知的鸭肠炎病毒基因组序列设计2对引物RTLT1、RTLT2,取基因组自连产物进行PCR反应,分别得到全长16071、978 bp的序列。将PCR产物克隆至pMD18-T载体,对重组质粒进行PCR和酶切鉴定,将阳性质粒测序,结果显示2对引物扩增的重叠序列部分完全一致。该段序列G+C含量高达75%,含有大量直接和反向重复序列,并发现4个末端特征序列,分别为具有回文结构的α序列、包含两测末端接合位点的β序列、高度保守序列的γ序列和AnTn序列。将该序列与马疱疹病毒Ⅰ型(EHV-1)、牛疱疹病毒Ⅰ型(BHV-1)、水痘带状疱疹病毒(VZV)、猪伪狂犬病毒(PRV)末端序列进行比较,证实所得到的序列为鸭肠炎病毒基因组末端序列,这些特征序列的发现对进一步了解DEV复制机制有很大帮助。     

鸭坦布苏病毒病的研究进展

鸭坦布苏病毒病是由鸭坦布苏病毒（duck Tembusu virus,DTMUV）引起的一种新发的病毒性传染病,以产蛋鸭产蛋量严重下降和雏鸭或育成鸭出现神经症状为主要特征。自从2010年首次暴发以来,鸭坦布苏病毒给我国养鸭业带来了巨大的经济损失。本文从病原学、流行病学、天然免疫应答以及病毒的诊断与防控等方面对DTMUV进行综述,为今后该疾病的诊断和预防提供科学依据。     

鸭坦布苏病毒E基因的分子特性分析

为给鸭坦布苏病毒（duck tembusu virus,DTMUV）囊膜糖蛋白选择良好的抗原域和宿主表达系统提供参考依据,本研究通过选取DTMUV QD株基因文库中的一个重组质粒并测序,结合NCBI的ORF Finder和BLAST工具发现一个全长为1488 bp完整开放阅读框架（Open Reading Frame,ORF）片段。将该ORF编码蛋白通过NCBI的BLASTP分析和DNAstar进化树分析,确定该蛋白与类黄病毒E基因编码的蛋白具有较高的相似性。随后应用生物信息学分析工具Conserved Domains确定保守结构域、运用SignalP4.1预测信号肽、TMHMM 2.0预测跨膜区。应用在线程序NetNGlyc1.0预测糖基化位点,NetPhos2.0预测磷酸化位点、ProtScale进行疏水性分析。最后运用在线EMBOSS和自动蛋白同源建模数据库进行3D结构预测以及密码子偏爱性分析。结果表明,E蛋白与其它黄病毒衣壳蛋白具有相似的功能,没有信号肽切割位点,在451-468和475-492aa区域含有跨膜区,为相对低表达基因,含有较多种类的稀有密码子,与人密码子使用频率较为接近。这为进一步研究DTMUV E基因的体外表达和宿主选择提供了分子生物学依据。     

鸭坦布苏病毒E基因重组杆状病毒的构建与间接ELISA检测方法的建立

研究旨在建立基于真核表达的鸭坦布苏病毒(DTV)E蛋白的诊断鸭坦布苏病毒病的间接ELISA方法。利用Bac-to-Bac杆状病毒昆虫表达系统,构建含有DTV E基因的重组杆状病毒。用重组病毒感染昆虫细胞后,SDS-PAGE鉴定出55 ku左右的表达蛋白,Western blot检测该蛋白具有很好的反应原性。以重组Bacmid DTV E蛋白作为包被抗原,建立间接ELISA检测方法。利用该方法对135份来自江苏省的樱桃谷鸭血清样品进行检测,发现其血清阳性率达79.3%。表明建立的间接ELISA检测方法特异性强、重复性好、敏感性高,可以用于鸭坦布苏病毒病的临床诊断。     

鸭坦布苏病毒和鸭瘟病毒二重荧光定量RT-PCR方法的建立

The study was conducted to establish the duplex Real-time PCR assay for detecting both duck tembusu virus (DTMUV) and duck plague virus (DPV). According to the sequences of DTMUV E gene and DPV UL6 gene in GenBank, two sets of specific oligonucleotide primers for DTMUV and DPV along with two TaqMan probes were designed. The duplex Real-time PCR assay was developed through optimization of reaction conditions and validation of specificity, sensitivity and repetitiveness of the method. The sensitivity of the assay were both 100 template copies for DTMUV and DPV. There was no specific bands of the same sizes were amplified from other duck pathogens, such as duck Newcastle disease virus, duck hepatitis virus, muscovy duck parvovirus, duck circovirus, H9 subtype avian influenza virus, egg drop syndrome virus. This duplex Real-time RT-PCR assay is a sensitive, quick, specific and quantitative test for detection of DTMUV and DPV, and will be useful for the control of these viruses in ducks.     

鸭坦布苏病毒对产蛋鸡的致病性研究

为探明鸭坦布苏病毒对产蛋鸡的致病性和不同感染途径对其产蛋性能的影响,分别选用罗曼蛋鸡、海兰蛋鸡和淮南麻黄鸡3个品种进行人工接种病毒试验。结果表明,3个品种产蛋鸡接种病毒后均出现产蛋下降,产蛋率最高下降80%以上,除产蛋和早期采食量下降及后期严重脱羽外,感染鸡无其他临床症状,产蛋恢复的速度和程度不同品种间存在一定差异,感染后无鸡只死亡;滴鼻组和同居组鸡群产蛋下降和恢复的程度低于肌肉注射组,重复感染组未发生明显产蛋下降;剖检病变可见一致的卵巢组织出血、变性、坏死和萎缩,其他器官无肉眼可见病变;从感染鸡卵巢组织中可检测到鸭坦布苏病毒核酸。综上所述,鸭坦布苏病毒对不同品种产蛋鸡均具有致病性,主要引发产蛋下降,病毒在鸡群中的传播可能不仅限于吸血昆虫,空气传播感染也是其重要的传播途径;感染康复鸡只对再次感染具有一定的抵抗力。研究结果为产蛋鸡不明原因产蛋下降提供了新的诊断方向,为坦布苏病毒病的有效防控发出了预警信号。     

鸭坦布苏病毒一步RT-PCR检测方法的建立与初步应用

为建立一种鸭坦布苏病毒(DTV)快速检测方法,根据Gen Bank上DTV基因组序列,设计1对特异性检测引物,建立了DTV一步RT-PCR检测方法。该方法检测基因A型鸭甲肝病毒、基因C型鸭甲肝病毒、新城疫病毒、H9亚型禽流感病毒、鸭瘟病毒、减蛋综合征病毒均为阴性。检测的敏感性达3.78 pg RNA。DTV一步RT-PCR检测方法特异性好、敏感性高、重复性好,可用于DTV的分子流行病学调查和临床疾病诊断。