奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌免疫逃避机制研究进展

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus,SA）型奶牛乳腺炎是一种较难控制的慢性、亚临床型传染病,给奶牛养殖业带来巨大的经济损失。多种SA免疫逃避机制在乳腺炎发生、发展过程中起重要作用,且SA的免疫逃避机制多与菌体毒力因子相关。本文对近年研究的奶牛乳腺炎SA的免疫逃避机制进行了综述,以期为SA型奶牛乳腺炎的防治研究提供参考。     

鸡免疫球蛋白G Fc(IgG Fc)片段的分离纯化及其抗血清的制备 Ⅱ.豚鼠抗鸡IgG Fc片段血清的制备

经硫酸铵盐析、DEAE 32-纤维素和Sephadex G 200柱色谱法分离得到纯化的鸡血清IgG。然后用木瓜蛋白酶水解IgG,再经DEAE 32-纤维素柱色谱纯化制得IgG Fc片段,并以IgG Fc片段免疫豚鼠制备豚鼠抗鸡IgG Fc血清。     

FcRn介导Fc与金黄色葡萄球菌毒力因子融合蛋白跨细胞转运至局部免疫触发位点

为了探究奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌毒力因子的重组蛋白能否经上皮屏障被转运至特定的乳腺局部免疫触发位点,本研究对金黄色葡萄球菌毒力因子重组蛋白FnBPB-ClfA和Fc融合蛋白Fc-FnBPB-ClfA的跨细胞转运机制、新生儿Fc受体(FcRn)是否参与此进程进行了验证。原代奶牛乳腺上皮细胞(pbMECs)接种于Transwell嵌套内的多孔膜上,培养至极性状态且细胞屏障完整,用于胞吞转运试验。将pbMECs对重组蛋白的胞吞转运试验设置为温度处理组(37℃和4℃)、蛋白A处理组、胞转途径抑制剂处理组。结果表明,2种重组蛋白均可被转运跨过pbMECs屏障,该转运作用呈温度依赖性,可能与囊泡介导的转运路径及FcRn受体有关,排除了细胞旁路扩散的可能。蛋白A对FnBPB-ClfA的跨细胞转运及亚细胞定位无明显影响,但明显减少了Fc-FnBPB-ClfA的跨细胞转运及其在细胞膜蛋白、骨架蛋白中的数量,说明Fc-FnBPB-ClfA的Fc与FcRn的结合在胞吞转运作用中发挥重要作用。LY294002、非律平以剂量-效应关系分别降低了FnBPB-ClfA、Fc-FnBPB-ClfA的跨细胞转运。结果表明,Fc融合蛋白Fc-FnBPB-ClfA能经胞吞转运作用跨过pbMECs屏障至局部免疫触发位点,且FcRn参与并促进了Fc融合蛋白的胞吞转运作用。     

大鼠IgG Fc片段与金黄色葡萄球菌黏附素FnBPB-ClfA的融合表达及其免疫学特性

为提高金黄色葡萄球菌(S.aureus)串联表达的黏附素重组蛋白(r Fn BPB-Clf A)的免疫效力,本研究将RT-PCR扩增的大鼠Ig G Fc段基因与本实验室已构建的S.aureus Fn BPB-Clf A基因串联,采用SOE-PCR进行扩增,制备Fc-Fn BPB-Clf A融合基因,并将其克隆于p ET-32a(+)载体中进行原核表达。将表达的重组蛋白(r Fc-Fn BPBClf A)经乳头管注射(200μg/只)免疫哺乳期Wistar大鼠,并于加强免疫2周后,以1×109 cfu S.aureus经乳头管攻毒。结果表明,在加强免疫7 d后,与r Fn BPB-Clf A免疫组相比,r Fc-Fn BPB-Clf A免疫组血清和乳清中的抗体水平明显增高,而且Ig G水平动态检测结果表明,其特异性抗体上升趋势明显高于r Fn BPB-Clf A免疫组。攻毒保护试验证明,r Fc-Fn BPB-Clf A和r Fn BPB-Clf A免疫组对S.aureus清除率均显著高于对照组(p0.01)。本研究结果表明,r Fc-Fn BPB-Clf A对S.aureus乳房炎的免疫效果更佳,为进一步研制有效防治S.aureus乳房炎疫苗提供了实验依据。     

金黄色葡萄球菌性奶牛乳房炎多价疫苗的研制和免疫效果评价

为研制用于预防金黄色葡萄球菌性奶牛乳房炎的免疫疫苗,使用4株血清型为外膜多糖336型(336PS)、荚膜多糖5型(CP5)和荚膜多糖8型(CP8)强毒力金黄色葡萄球菌试制出金黄色葡萄球菌多价疫苗,并通过抗体水平监测、攻毒保护试验以及两个牧场的田间试验对免疫效果进行了评价。抗体水平监测显示,首免后30 d即可产生较高的抗体水平,二次免疫后有效抗体水平可持续到产后210 d;人工攻毒保护试验显示,疫苗对金黄色葡萄球菌引起的临床型乳房炎的保护率为89%;田间试验结果表明,该疫苗对奶牛临床型乳房炎的保护率在75.2%～83.3%之间,对隐性乳房炎的保护率在49.9%～52.2%之间,免疫组日产奶量较对照组平均提高1.26 kg以上。上述结果表明,所试制的疫苗可以显著降低泌乳牛金黄色葡萄球菌引起的临床型和隐性乳房炎发病率并提高产奶量。     

乌苏里貉IgG Fc片段克隆表达及免疫交叉源性分析

为研究乌苏里貉IgG Fc与犬IgG间的免疫交叉源性,本研究采用斑点酶联免疫吸附法(dot-ELISA)初步确定犬与乌苏里貉血清抗体间存在较强免疫交叉反应源性;通过RT-PCR成功克隆乌苏里貉IgG Fc片段基因,构建pcDNA3.1-IgG(Fc)真核表达质粒,转染HEK293T细胞,借助间接免疫荧光试验(IFA))证实该蛋白成功表达(大小约为22 000),免疫印迹(Western blot)试验证明该蛋白与抗犬IgG存在免疫结合反应。结果表明,乌苏里貉IgG Fc与犬IgG间存在强烈的免疫交叉源性,应用犬源高免血清或犬免疫球蛋白治疗貉犬瘟热具有可行性,同时为今后构建特定抗原基因与IgG Fc基因融合表达载体,研究DNA疫苗及Fc的生物佐剂提供了理论依据。     

奶牛乳腺炎源金黄色葡萄球菌噬菌体P82的分离及特性研究

【目的】 为开发噬菌体"鸡尾酒"制剂防治奶牛乳腺炎提供生物学材料。【方法】 以实验室分离的奶牛乳腺炎源金黄色葡萄球菌82为宿主菌,通过点滴法和双层平板法在奶牛场的污水、弃奶和粪便混合物中分离并纯化其噬菌体,通过噬菌斑及透射电子显微镜对该株噬菌体的形态特征进行观察。利用核酸酶处理分析该噬菌体核酸类型,并对其裂解谱、最佳感染复数、一步生长曲线、热稳定性、pH稳定性进行研究。【结果】 分离筛选出金黄色葡萄球菌82的裂解性噬菌体P82,电镜下观察其头部为二十面体,大小约为120 nm×83 nm,有一条带可伸缩尾鞘的长尾,长约126 nm,属于有尾噬菌体目,肌尾噬菌体科。通过琼脂糖凝胶电泳鉴定其核酸类型为双链DNA （dsDNA）。噬菌体P82的最佳感染复数为0.001,对奶牛乳腺炎源金黄色葡萄球菌裂解率为36.51%（23/63）,宿主谱较广;其生长潜伏期约为25 min,爆发期约为45 min,裂解量约为74 PFU/cell;在pH 4.0~12.0时活性稳定,在pH 2.0和13.0时则完全失去活性。噬菌体P82热稳定性较高,在70 ℃作用60 min后仍有裂解能力,在80 ℃作用40 min时则失去裂解能力。【结论】 本研究分离的噬菌体P82效价较高、裂解能力强、增殖速度快、噬菌谱广,对不同温度和pH均有较好的耐受度,能作为专一性裂解奶牛乳腺炎源金黄色葡萄球菌的噬菌体候选株,可与其他噬菌体混合制成噬菌体"鸡尾酒"制剂用于防治奶牛乳腺炎,为奶牛乳腺炎的噬菌体疗法提供材料。     

奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌FnbpB-D基因的表达及其抗血清活性

纤维素结合蛋白B(FnbpB)是金黄色葡萄球菌(S.aureus)最主要的黏附因子之一,它能够介导S.aureus结合于细胞表面的纤维连结素(Fn)和纤维蛋白原(Fg)。FnbpB基因中D区为主要活性部位。本实验利用pET-32a表达载体表达了S.aureus FnbpB-D重组蛋白(34.7ku),并通过动物实验对重组FnbpB-D蛋白的抗血清活性进行了初步研究。采用ELISA对抗血清进行抗粘附性检测,结果显示实验组与对照组差异极显著(p0.01),抗血清具有较强的抑制S.aureus黏附纤维连结素的作用。此外,调理吞噬实验结果显示,免疫兔全血对S.aureus有较强的调理作用。这些实验结果将为制备奶牛乳房炎S.aureus黏附素疫苗的研制提供参考。     

牛源金黄色葡萄球菌铁离子调控蛋白保守性和免疫效果研究

为评价金黄色葡萄球菌铁离子调控蛋白B(IsdB)作为奶牛乳腺炎疫苗抗原的可能性,对我国分离的不同克隆复合群(CCs)3株菌的isdB基因进行序列测定、比对分析,并对XJ43(CC97)菌株的isdB基因进行原核表达、纯化,通过小鼠主动和被动免疫试验评价了其免疫保护效果。Blast分析显示,来源于不同克隆复合群菌株的isdB基因序列的同源性大于95%,说明isdB基因高度保守;IsdB蛋白主动免疫能显著降低攻毒菌对免疫鼠的损伤或免疫鼠的死亡率,而被动免疫不能降低小鼠的死亡率;用活的强毒力菌刺激产生的血清则能极显著地增加小鼠的存活率。本研究表明,虽然IsdB蛋白的主动免疫可以显著减弱金黄色葡萄球菌的致病作用,但以此单一成分为抗原的金黄色葡萄球菌疫苗的免疫保护效果具有很大的局限性。     

甘肃省部分地区奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌的分离鉴定及耐药性分析

通过对甘肃省部分地区奶牛场的323份乳腺炎乳样进行金黄色葡萄球菌的分离及对分离株进行耐药性分析,旨在为临床合理用药提供科学依据。采用血平板培养基、选择性培养基(Baird-Parker培养基),营养琼脂培养基,结合革兰染色、镜检,对可疑菌落分离纯化后进行血浆凝固酶试验,确定分离株是否为金黄色葡萄球菌;选用临床常用的10种抗生素对分离株进行药敏试验。结果表明,170株分离株对青霉素、头孢曲松钠、四环素、克林霉素表现出明显耐药,耐药率分别为75.29%、60.59%、63.53%、61.76%,而对左氧氟沙星、环丙沙星、氯霉素高度敏感,敏感率分别为72.94%、74.71%、71.76%。     

奶牛金黄色葡萄球菌性乳房炎研究进展

奶牛乳房炎是对世界奶牛业造成经济损失最大的疾病之一,它不仅直接导致乳品工业的经济损失,而且由于患乳房炎的奶牛其乳汁中经常含有大量的毒素、病原微生物以及治疗后残留的抗生素,使得该病日益引起公众的关注。金黄色葡萄球菌是奶牛乳房炎的主要病原,由于其极易产生耐药性,使得治疗变得相当困难,因此使用预防或治疗性疫苗防治乳房炎就成为首选。金黄色葡萄球菌对上皮细胞的黏附和侵袭力被认为是奶牛金黄色葡萄球菌性乳房炎的主要致病机制,金黄色葡萄球菌的致病力涉及到许多不同的毒力因子,如黏附素、荚膜、各种毒素和酶类等。研究表明,以这些毒力因子为靶位进行疫苗研究,可能是预防奶牛金黄色葡萄球菌性乳房炎的有效途径。     

奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌新型疫苗研究进展

病原微生物感染是导致奶牛乳腺炎发生的最主要原因,其中金黄色葡萄球菌的带菌率最高。疫苗被认为是当前预防疫病传播并最终根除传染病的最有发展前景和最经济有效的方法和措施。随着基因工程、分子生物学、遗传学及免疫学等学科知识的迅猛发展,多种新型疫苗因为具有安全可靠、容易进行质量控制等优点正引起更多研究者的广泛关注,金黄色葡萄球菌新型疫苗的研究取得了长足进步,本文针对金黄色葡萄球菌新型疫苗加以综述。     

奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌荚膜多糖研究概况

金黄色葡萄球菌是引起奶牛乳房炎的一种主要致病菌,其中94%～100%的金黄色葡萄球菌都含有荚膜多糖.荚膜多糖共分11个血清型(CP1～CP11),而5型和8型占临床分离株的70%～80%,为优势血清型;由于荚膜多糖的抗吞噬作用和黏附作用,决定了金黄色葡萄球菌的致病性和免疫原性.因此,基于荚膜多糖的疫苗可能是更有效的抗奶...     

治疗奶牛乳腺炎蒙药复方提取物抗大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌作用研究

对两种蒙药复方进行乙醇回流提取,然后分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取,得到石油醚层浸膏、乙酸乙酯层浸膏、正丁醇层浸膏和水母液浸膏,并分别对各种提取物进行奶牛乳腺炎两种主要致病菌大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌的体外抑菌和体内抗菌作用,用牛津杯法测定提取物对大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌抑菌圈直径,用二倍稀释法测定了其在体外的最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)。又以两种致病菌的混合菌感染小鼠,灌服蒙药复方提取物以测定其体内抗菌效果。结果表明,两种蒙药复方的体外抑菌成分主要集中在乙酸乙酯层浸膏和正丁醇层浸膏内,抑菌环直径均大于16.88 mm,最大达到21.61 mm;对两种致病菌的MIC和MBC最低可达到0.031 5 g/mL和0.062 5 g/mL;两种蒙药复方提取物的体内抗菌成分重要集中在石油醚层浸膏和水母液浸膏内,对小鼠死亡保护率明显高于阴性对照组,可达87.5%。     

奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌的分离鉴定及药敏试验

[目的] 了解泰州市某奶牛场乳房炎中金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）感染情况及其对常用药物的敏感性。[方法] 试验选用Baird-Parker培养基分离、生化鉴定、PCR检测等方法,对采集的9份奶牛乳房炎奶样进行分离鉴定和药敏试验。[结果] 共分离到6株葡萄球菌,进一步通过凝固酶试验和16S rDNA测序等方法鉴定其中3株为金黄色葡萄球菌。药敏试验结果显示,3株金黄色葡萄球菌对青霉素G均耐药,2株对四环素耐药,2株对红霉素和苯唑西林表现为中介。[结论] 该次分离的金黄色葡萄球菌主要对青霉素G和四环素耐药,对其他常用抗生素表现为敏感。     

Research Progress on the Staphylococcus aureus Immune Evasion in Bovine Mastitis

Staphylococcus aureus(SA)bovine mastitis is a chronic and subclinical infectious disease, which is hard to control. It brings unpredictable losses to dairy-farming industry. Immune escape effect of SA plays an important role in the occurrence and development of mastitis, and some virulence factors are mostly associated with the immune evasion of bacteria. In this paper, some important immune evasion mechanisms of SA in recent researches were reviewed in order to provide theoretical reference for further prevention and treatment of mastitis in dairy cows.     

奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌疫苗研究进展

奶牛乳腺炎是由多种因素引起的严重影响奶牛业发展的重要疾病,金黄色葡萄球菌是引起奶牛乳腺炎的主要病原,至今还没有有效的方法预防金黄色葡萄球菌所致的乳腺炎.虽然已经研制了许多金黄色葡萄球茵疫苗,但是试验表明,这些疫苗的免疫效果并不理想,因此仍将继续搜索有效疫苗.目前,亚单位疫苗和DNA疫苗成为研究热点,研究集中在金黄色葡萄球茵的表面抗原上.利用金黄色葡萄球茵分泌的免疫原性蛋白而制成的疫苗可能具有高免疫效力,这些抗原将成为高效疫苗的候选者.同时,应用低毒的金黄色葡萄球菌突变株,也可能成为预防乳房炎的一种新工具.     

奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌TH-16S 733330株荚膜多糖免疫原性研究

从新疆分离的奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌,经TH-16S系统鉴定,选取鉴定结果为733330的优势生化株。毒力测定试验表明,1×108CFU/只的接种量会使小白鼠在24 h内死亡。菌株接种Columbia Broth Modified 37℃摇床100 r/m in培养24 h后,用0.05%戊二醛灭活。灭活培养物经4℃30 m in 17 000 g离心去除细胞碎片,上清用PBS(pH 7.2)4℃透析48 h,PEG20000浓缩10倍,透析,加入终浓度为10 mg/mL的蜂胶-乙醇浸液,作为荚膜多糖免疫原。先分别用荚膜多糖免疫原0.1、0.2、0.4 mL免疫小白鼠,再用组合免疫原(荚膜多糖+109CFU/mL菌体)0.1、0.2、0.4 mL免疫小白鼠。6组小鼠于免疫后14 d连同对照小鼠2组攻击金黄色葡萄球菌2×108CFU/(0.2 mL.只)。结果表明,荚膜多糖免疫原组保护率分别为0、25%和50%,(荚膜多糖+菌体)组保护率分别为25%、75%和100%。