基于18S rRNA和HSP70基因序列的隐孢子虫种系发育分析

为阐明河南区域隐孢子虫分子流行病学特点,用PCR技术扩增分离虫株的18S rRNA基因全序列和HSP70基因序列,并对扩增片段进行测序。用PAUP 4.0和TREEPUZZLE 4.1构建进化树,试图从分子水平证明河南省不同地区不同宿主来源隐孢子虫的遗传特征,以阐明隐孢子虫病的分子流行病学特点。通过18S rRNA基因全序列和HSP70基因序列分析,其结果：河南人源隐孢子虫分离株为Cryptosporidium parvum鼠基因型;河南鹿源隐孢子虫分离株为C. parvum鹿基因型;河南猪源隐孢子虫的2个分离株均为C. parvum猪基因I型,即C. suis;河南鹌鹑源的隐孢子虫2个分离株分别为C. baileyi和C. meleagridis;河南乌鸡源隐孢子虫和鸵鸟源隐孢子虫分离株均为C. baileyi;河南牛源隐孢子虫分离株为C.andersoni。     

云南省蛋鸡源隐孢子虫鉴定及18S rRNA生物信息学分析

为了了解云南省规模化蛋鸡场腹泻病鸡隐孢子虫的感染情况,试验采用卢戈氏碘液和改良抗酸染色镜检、巢式PCR扩增隐孢子虫18S rRNA基因、BLAST程序测序及遗传进化分析等方法对2020年12月份从云南省多个规模化蛋鸡场采集的71份腹泻蛋鸡的粪便样品进行研究。结果表明：经卢戈氏碘液染色后可见呈棕色近似香蕉形的子孢子,经改良抗酸染色后可见呈红色近似球形的卵囊和近似香蕉形的子孢子。巢氏PCR扩增得到大小为821 bp的目的片段,将获得的虫株命名为YX202106虫株。YX202106虫株与GenBank中已公布的火鸡隐孢子虫的同源性最高,为99.14%～99.51%,且在进化树上处于同一个分支,该虫株还与能引起人畜共患的五种主要隐孢子虫——人隐孢子虫、微小隐孢子虫、火鸡隐孢子虫、猫隐孢子虫、犬隐孢子虫在进化树上构成一个大分支,具有重要的公共卫生学意义。说明云南地区蛋鸡群中存在火鸡隐孢子虫感染,应加强蛋鸡隐孢子虫病的防治。     

用CPN60基因序列研究隐孢子虫种系发育关系

本试验以编码线粒体功能性蛋白Chaperonin 60(CPN60)的核基因作为研究对象,对隐孢子虫分离株CPN60基因进行扩增测序,用Clustal X1.81对扩增序列与GenBank相关参考序列进行比对,然后用PAUP4.0程序中邻接法(Neighbor-joining,NJ)、最大简约法(Parsimony,MP)构建基因树,同时用TREEPUZZLE程序Version4.1构建最大似然树(Maximum likelihood,ML),以确定不同隐孢子虫虫株之间的进化关系,并以18S rRNA和HSP70基因构建的进化树作参照,评价CPN60是否更适合作为隐孢子虫基因分型和进化关系的分子标记。结果显示:基于CPN60构建的进化树将隐孢子虫分为两大类:C.baileyi和C.meleagridis处于一个分枝,C.hominis、C.suis、C.parvum牛基因型和C.parvum鼠基因型处于另一个分枝上。不同隐孢子虫之间的同源性介于96%~100%,能有效区分隐孢子虫不同基因型。因此,CPN60基因序列也可作为隐孢子虫分离株种系发育的遗传标记。     

18S rRNA基因巢式PCR-RFLP鉴定吉林、大庆地区断奶前奶牛隐孢子虫分离株

利用18S rRNA巢式聚合酶链反应(Nested PCR)-限制片段长度多态性(Restriction fragment length polymorphism,RFLP)鉴定吉林、大庆地区牛源隐孢子虫分离株.采取吉林、大庆地区断奶前犊牛粪便,提取DNA后经18S rRNA基因巢式PCR扩增,扩增产物测序后用Blast和MEGA4.0软件进行同源性和系统发育树分析.同时扩增产物分别用Ssp Ⅰ、Vsp Ⅰ和Mbo Ⅱ酶切后进行RFLP分析.通过18S rRNA基因PCR-RFLP分析和测序比对分析表明,吉林分离株包括2种隐孢子虫,分别为C.bovis和C.ryanae,大庆分离株包括3种,分别为C.boris、C.ryanae和C.andersoni.     

陕北黑山羊隐孢子虫种类鉴定及遗传进化分析

为了阐明陕北黑山羊隐孢子虫(Cryptosporidium)的感染情况、种类及其遗传进化关系,本研究利用形态学和分子生物学方法,分析了107份不同年龄段黑山羊粪便样品中的隐孢子虫的感染状况、种类以及遗传进化关系。结果发现,黑山羊存在隐孢子虫感染,感染率为14%(15/107)。序列比对分析表明,7份阳性样品为牛隐孢子虫(C.bovis)感染,6份为肖氏隐孢子虫(C.xiaoi)感染,2份为C.bovis和C.xiaoi混合感染。系统进化树显示9个分离株与C.bovis位于同一分支,而与C.xiao位于同1个分支的有8个分离株。结果为陕北黑山羊乃至其他山羊的隐孢子虫病分子流行病学研究及防控提供了理论基础。     

水源中隐孢子虫种类和基因型鉴定技术研究进展

目前，隐孢子虫有效种有20个。隐孢子虫的分子流行病学研究表明，隐孢子虫具有宿主特异性。目前，感染人的隐孢子虫种和基因型有C．horninis、C.parvum、C．meleagridis、C.felis、C.canis、C.nuris、C．suis genotype和C．cervine genotype等。水源性隐孢子虫暴发，具有重要的公共卫生意义。分子鉴定技术已广泛应用于检测水中隐孢子虫，水中检测到的隐孢子虫有9个。通过分析其分子组成特性表明，成年牛可能是水污染的主要根源，除了居民用水和农业污染外，鹿、麝鼠、田鼠、鸟和其它野生动物可能也与水污染有关。隐孢子虫分子基因型鉴定工具可能为水源保护性研究提供一个更有力的溯源追踪工具。     

猴源人隐孢子虫的分离与鉴定

为了解感染不同灵长类动物的隐孢子虫种类以及与感染人的人隐孢子虫(C.hominis)之间的遗传差异,本研究采用形态学和分子生物学方法对猴源隐孢子虫进行分离和鉴定。利用常规方法分离猴粪便中的隐孢子虫卵囊,通过改良抗酸染色和荧光显微镜观察对其进行形态学鉴定;并采用PCR方法扩增其卵囊壁蛋白(COWP)基因和18SrRNA基因,扩增产物克隆至pMD-18-T载体中,对阳性克隆进行测序并作进化树分析。结果表明:抗酸染色和荧光检查结果与所报道的人隐孢子虫的结果一致。PCR扩增产物经电泳检测,明显地出现554bp和370bp大小的片段,与预期结果一致;两种基因的序列分析结果显示该猴源隐孢子虫与C.hominis的相似性均为100%。由此可认为本次分离的隐孢子虫为C.hominis。     

新疆南疆某规模化绵羊养殖场腹泻羔羊隐孢子虫感染情况及其分子鉴定

[目的]了解新疆南疆某规模化绵羊养殖场腹泻羔羊隐孢子虫感染情况和基因亚型分布特点。[方法]采集新疆维吾尔自治区某规模化绵羊养殖场4个品种1月龄以内腹泻羔羊新鲜粪便样本60份,使用饱和蔗糖溶液漂浮法检查隐孢子虫卵囊,进行种类初步鉴定;全部粪便样本提取基因组DNA后,基于隐孢子虫SSU rRNA基因位点和微小隐孢子虫gp60基因位点,对其进行PCR扩增、测序和序列分析,鉴定隐孢子虫种属和基因亚型,构建遗传进化树解析其分子遗传特征。[结果]经显微镜观察,发现38份样本呈隐孢子虫卵囊阳性,形态学初步鉴定为微小隐孢子虫;基于SSU rRNA基因位点,采用PCR方法检测出52份样本呈隐孢子虫阳性,感染率为86.67%(52/60),经序列比对分析,均为微小隐孢子虫;基于微小隐孢子虫gp60基因位点,PCR扩增后成功获得49条序列,经比对分析均为ⅡdA19G1基因亚型。[结论]该养殖场腹泻羔羊普遍感染微小隐孢子虫,其基因亚型均为ⅡdA19G1。调查结果为新疆南疆绵羊隐孢子虫种属鉴定与遗传进化研究提供了基础数据。     

野生动物隐孢子虫的种类和基因型

隐孢子虫病（Cryptosporidiosis）是一种全球性的人兽共患原虫病,具有广泛的宿主范围,可以感染鸟类、哺乳类、鱼类、爬行类、两栖类以及人在内的240多种动物。野生动物隐孢子虫做为人隐孢子虫病感染的重要传播来源,对其进行生物学研究具有重要的公共卫生意义。本文分别叙述了野生动物隐孢子虫的种类及基因型,为进一步研究野生动物的隐孢子虫病提供了有效的参考。     

猪源隐孢子虫卵囊的分离及基因型鉴定

应用RT-PCR方法对南京、上海和合肥猪源隐孢子虫卵囊SSU rRNA部分序列进行扩增,产物测序后提交GenBank,收录号为DQ855266、DQ855267;用BLAST和DNAStar软件与GenBank参考序列进行比较,分析其同源性,绘制系统发育进化树,结合卵囊形态学观察和对小鼠、大鼠、兔、山羊和鸡的传染性试验确定隐孢子虫种类或基因型。结果表明,3地区猪源隐孢子虫分离株与微小隐孢子虫(C.parvum)同源性达94%~100%,与C.parvummouse型有99.8%~100%的同源性,并处于进化树的同一分支。因此,3地区猪源隐孢子虫是C.parvummouse型,提示猪和鼠之间存在交叉传播的可能。     

PCR方法检测奶牛粪便中鼠隐孢子虫

从含有鼠隐孢子虫卵囊的奶牛粪便中,直接提取 Ｄ Ｎ Ａ 用作 Ｐ Ｃ Ｒ 模板,用 １ 对人工合成的寡核苷酸作为 Ｐ Ｃ Ｒ 引物,扩增大小为 ５４０ ｂｐ 的特异片段。 Ｐ Ｃ Ｒ 产物经电泳鉴定,表明可从含隐孢子卵囊的奶牛粪便标本 Ｄ Ｎ Ａ 抽提物中扩增出目的片段,而其他几种寄生虫及阴性对照均不能扩增出特异片段。本方法的敏感性最低可检测到含卵囊 ４００ 个／ｍ Ｌ 的样本,具有敏感性高、特异性强的特点。     

基于粪便样本的野生犬科动物物种鉴别与棘球绦虫感染调查

旨在探索粪便样本分析对犬科动物物种鉴别的方法及其可行性,同时对野外犬科动物棘球绦虫感染情况进行调查。采用哺乳动物线粒体DNA控制区通用引物对101份采集自野外环境的犬科动物粪便DNA进行PCR扩增和测序,通过核苷酸位点变异分析、BLAST相似性比对、遗传距离分析和系统进化树构建,对粪样来源物种进行分子鉴别。同时,采用粪-抗原ELISA检测,对粪样棘球绦虫感染情况进行调查。结果表明：粪样来源物种鉴别的检测成功率为73.27%,获得的74条序列共定义单倍型20个,所有单倍型序列均可在GenBank数据库中匹配到单一物种,序列相似度为98.52%~100%。单倍型根据序列差异可分为4个单倍型集,各单倍型集间平均碱基差异为17.83~70.10,各单倍型集内单倍型碱基差异在1~10个之间。各集合间遗传距离为0.068~0.342,远大于各集合内单倍型间遗传距离0.009~0.022。系统进化分析结果显示,同一集合的单倍型以高自展值聚集成一支。综合各项分析结果,可推测所检测粪样宿主来源分别为犬、灰狼、赤狐和红狐。粪-抗原ELISA检测发现阳性样本11份,样本棘球绦虫抗原阳性率为10.89%。综上表明：线粒体DNA控制区序列分析可用于犬科动物的分子鉴别,可结合核基因等其他分子标记进一步提升检测准确率。研究区域野外犬科动物棘球绦虫粪抗原阳性率较高。     

圈养滇金丝猴粪便可培养菌群的分离鉴定及药敏试验

本试验采用选择性培养基分离了滇金丝猴新鲜粪便5种优势菌,生化反应法进行菌落鉴定,K-B药敏纸片法测定细菌药物敏感性。结果显示,从滇金丝猴粪便中分离鉴定出了7种好氧细菌:埃希大肠杆菌(Escherichia coli)、志贺菌(Shigella)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、伪产碱假单胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes)、摩氏摩根菌(Morganella morganii)、屎肠球菌(Entercoccus faecium)、肠球菌PNS-E3(Entercoccus PNS-E3);3种厌氧菌:粪便拟杆菌(B stercoris)、乳杆菌(Lactobacillus brevis)、双歧杆菌(Bifidobacterium)。药敏试验结果表明,10种肠道菌对红霉素、青霉素G、头孢唑啉、呋喃妥因、磺胺甲噁唑/甲氧苄啶(复合)、克林霉素、氯霉素、头孢他啶、环丙沙星呈现出不同程度的药物敏感性。     

套式PCR检测奶牛粪便中隐孢子虫

为了检测样品中的微量隐孢子虫，从含有不同数量隐孢子虫卵囊的奶牛粪便中，直接提取DNA用作初始PCR（Initial-PCR）模板，以稀释的初始PCR的产物为模板进行套式PCR（Nested-PCR），用两对人工合成寡核苷酸分别作为两PCR的引物，扩增大小分别为540pb、258pb的特异片段。PCR产物经电泳鉴定，可从阳性粪便标本DNA抽提物中扩增出目的片段，而阴性对照不能扩增目的片段；初始PCR、套式PCR的敏感小生最低可分别检测到含卵囊100、5个／g粪便。初步应用结果表明某奶牛场的奶牛自然感染率为16.4％。试验表明套式PCR的敏感性比普通PCR约高100倍，能用于奶牛隐孢子虫感染情况的调查。     

四川某奶牛场粪样中寄生虫的调查研究

为了解四川某奶牛场奶牛寄生虫感染情况,进而制订合理有效的防治措施,本调查对该场奶牛粪样做了寄生虫检查。采集了犊牛、育成牛、泌乳牛的新鲜粪样共90份,分别采用饱和盐水漂浮法、离心沉淀法和斯陶尔氏计数法对粪样中虫卵进行定性检查和定量检查。结果显示,在粪样中检出了球虫卵囊、线虫卵、吸虫卵和绦虫卵,其中球虫卵囊的阳性率为14.44%(13/90),线虫卵的阳性率为57.78%(52/90),绦虫卵和吸虫卵只在泌乳牛的粪样中检出,泌乳牛阳性率分别为2%(1/50)、12%(6/50)。该奶牛场混合感染率为33.33%(18/54)。结果表明,该奶牛场寄生虫感染普遍,总感染率为60%(54/90),主要为线虫,其次是球虫和吸虫,混合感染情况普遍。     

Identification of novel Cryptosporidium genotypes in kangaroos from Western Australia

A total of 763 faecal samples were collected from western grey kangaroos (Macropus fuliginosus) in Western Australia and screened for the presence of Cryptosporidium by PCR at the 18S ribosomal RNA (rRNA) locus. Samples that were positive at the 18S locus were also amplified at the actin locus. The overall prevalence was 9.3% (71/763). At the 18S rRNA locus, sequences were obtained for 28 of the 71 positives. Sequence analysis identified four species; Cryptosporidium fayeri in seven isolates, Cryptosporidium marcopodum in four isolates, Cryptosporidium xiaoi in six isolates and a novel genotype (kangaroo genotype I) in eleven isolates. Analysis at the actin locus confirmed the genetic distinctness of the novel genotype. The results of the present study indicate that in addition to C. fayeri and C. marcopodum, kangaroos may be capable of being infected with a wider range of Cryptosporidium species and genotypes including livestock species such as C. xiaoi. The novel genotype identified in the kangaroos most likely represents a cryptic species that requires further analyses to confirm its species status.     

Fecal shedding of Cryptosporidium oocysts in healthy alpaca crias and their dams

Objective-To determine the apparent prevalence of shedding of Cryptosporidium spp in healthy alpaca crias and their dams on 14 farms in New York and 1 farm in Pennsylvania. Design-Cross-sectional study. Animals-110 alpaca crias and their 110 dams. Procedures-Fecal samples were obtained from 220 alpacas at 14 alpaca farms in New York and 1 farm in Pennsylvania. For each animal, age, sex, and health condition were recorded. A fecal score (1 = normally formed; 2 = soft or loose; 3 = diarrhetic) was recorded for each cria. Cryptosporidium oocysts were identified in fecal samples by a direct immunofluorescence assay. Results-Apparent prevalence of fecal shedding of Cryptosporidium oocysts was 8% (95% confidence interval, 4% to 15%) in dams and was 7% (95% confidence interval, 3% to 13%) in crias. There was no significant difference in age between dams with positive fecal test results for Cryptosporidium oocysts (median age, 4 years; range, 3 to 8 years) and dams with negative results (median age, 4 years; range, 2.5 to 19 years). No significant difference was found in age between crias with positive fecal test results (median age, 20 days; range, 7 to 53 days) and those with negative results (median, 36 days; range, 2 to 111 days). No significant difference in fecal scores was found between crias with positive versus negative fecal test results. Conclusions and Clinical Relevance-A higher than previously reported apparent prevalence of fecal shedding of Cryptosporidium oocysts in healthy alpacas was found. A zoonotic risk should be considered, especially for Cryptosporidium parvum.     

Nosocomial Transmission of Cryptosporidium in a Veterinary Hospital

An outbreak of cryptosporidiosis occurred at a veterinary hospital, involving multiple species, including humans. The index case was an infected dairy calf that presented with diarrhea. Several other cases of Cryptosporidial diarrhea subsequently developed during a 1-month period. The key features of this outbreak were the multiple species affected, the increased morbidity in immunocompromised neonates, and the failure of implemented control measures to contain the disease