大肠杆菌乙酰-CoA羧化酶基因异源表达对变铅青链霉菌次级代谢的影响

克隆组装了大肠杆菌的乙酰-CoA羧化酶基因acc,以研究其异源表达对变铅青链霉菌中2种“沉默”抗生素放线紫红素和十一烷基灵菌红素合成的影响。大肠杆菌ACC由4个基因编码,通过PCR扩增4个基因,并通过重叠延伸PCR加上ermE启动子,构建得到4个重组基因;再将重组基因依次组装得到异源表达质粒pHLZ11,接合转移到变铅青链霉菌中进行异源表达。结果显示：含有异源表达质粒的变铅青链霉菌接合转移子能合成放线紫红素而十一烷基灵菌红素产量提高。表明大肠杆菌acc基因异源表达能够激活变铅青链霉菌沉默抗生素的合成,并提高已有抗生素产量。     

透明颤菌血红蛋白基因在吸水链霉菌NND-52-C中的克隆与表达

将透明颤菌血红蛋白基因(vgb基因)克隆至链霉菌的质粒载体pIJ702中，构建成表达载体pLY702，并将pLY702质粒转化阿扎霉素B的高产菌株——吸水链霉菌NND—52—C的原生质体，获得转化子H。经发酵实验表明，在限氧的条件下，可以使NND—52—C菌株的生物量提高14．4％，阿扎霉素B的产量提高30．8％。     

一个链霉菌中微型转座子系统的构建

针对链霉菌中现有转座子系统的一些缺陷,构建了一个链霉菌中的微型转座子质粒pHL265,它携带的转座酶基因tnpA在转座子mini-Tn4560A外部,降低了发生二次转座的可能性,并带有大肠杆菌与链霉菌进行属间接合转移的起始位点oriT,可通过接合转移的方式将其从大肠杆菌导入到链霉菌中.利用该转座子系统转座筛选得到天蓝色链霉菌M145的约1 000株转座突变株.选取其中的8株,经Southern杂交验证可知,该转座子的转座基本具有随机性,并在宿主DNA中稳定存在.此系统为链霉菌功能基因组的研究提供了新的技术手段.     

过表达根瘤血红蛋白基因对活跃链霉菌那西肽产量的影响

[目的]采用过表达根瘤血红蛋白基因改善活跃链霉菌的溶氧表达,以提高那西肽的产量。[方法]通过全基因组合成的方法得到根瘤菌血红蛋白基因(sm),连接到整合型质粒p IB139上,构建表达载体p IB139-sm。通过大肠杆菌-链霉菌结合转移的方法将sm基因整合到活跃链霉菌基因组上,通过PCR验证各转化子目的片段已整合到活跃链霉菌基因组上,并进行大量筛选得到重组菌株。[结果]经SDS-PAGE和CO结合差示光谱分析,结果显示,目的蛋白均已成功表达且具有相应的蛋白活性。摇瓶培养结果显示,Smf Hb表达对菌体生长和那西肽产量有明显的促进作用,过表达Smf Hb的重组菌株那西肽产量达1 245.7μg/m L,比原始菌株提高39.6%。[结论]过表达sm基因提高那西肽产量的作用优于vhb。     

加纳链霉菌接合转移体系的建立与优化

加纳链霉菌(Streptomyces ghanaensis)是动物饲料添加剂黄霉素的主要生产菌。建立高效稳定的遗传操作系统是对该菌进行分子生物学研究和构建高产黄霉素基因工程菌的基础。以含有基因整合型重组质粒pIJ8630-nsdA的Escherichia coli ET12567/pUZ8002为供体、加纳链霉菌ATCC 14672为受体进行接合转移,通过单因素试验与正交试验对接合转移过程中的关键影响因素进行优化。结果表明,WL50培养基为接合转移最适培养基,当受体加纳链霉菌ATCC 14672孢子在50 ℃条件下热激10 min、37 ℃预培养3 h后,与供体按细胞数比例1∶15混合后涂布于接合转移平板上,30 ℃培养14 h后覆盖50 μg·mL^-1安普霉素和500 μg·mL^-1萘啶酸时,接合频率最高,比优化前提高20.3倍。     

吸水链霉菌TetR基因的克隆与表达

根据吸水链霉菌“应城变种10—22”的一个文库质粒pHZ1392的测序结果设计了1对引物,聚合酶链反应扩增编码TetR的663bp基因,利用T载体和蓝白斑筛选构建了克隆质粒T-TetR,经序列测定确认扩增序列正确后克隆至pET24a,构建了表达质粒pET24a—TetR,再经序列测定确认未发生移码后转化表达宿主菌E.coli D1521(DE3),IPTG诱导后的SDS—PAGE分析显示蛋白表达获得成功,并进一步利用Ni—NTA树脂纯化了TetR蛋白。     

固氮链霉菌Streptomyces chartreusi WZS021接合转移系统的建立及优化

[目的]建立和优化固氮链霉菌Streptomyceschartreusi WZS021(简称菌株WZS021,下同)的接合转移体系,以丰富固氮链霉菌基因片段转移技术.[方法]以大肠杆菌Escherichiacoli ET12567(pUZ8002)为供体菌,携带整合型质粒pSET152的菌株WZS021为受体菌,进行菌株WZS021接合转移.[结果]选择高氏一号培养基为菌株WZS021接合转移培养基,50℃热激10 min,供受比为1:10,涂布20.0 mg/L安普霉素、接合转移12 h后覆盖抗生素,添加MgCl2终浓度为5.0 mmol/L时接合转移效率最高,达3.24×10-6.[结论]通过确定适用于菌株WZS021接合转移条件建立的菌株WZS021遗传转化体系,有助于今后插入标记基因确定该菌的固氮定殖位点及导入外源基因的操作.     

生防链霉菌gCLA4遗传转化体系的建立与优化

【目的】建立生防菌淡紫灰链霉菌(Streptomyces lavendularectus)gCLA4的遗传转化体系,为定向改造基因、提高基因表达水平及其生防分子机制研究奠定基础。【方法】以具有安普霉素(Apramycin)抗性基因标记的整合型质粒pSET152为出发质粒,Escherichia coli ET12567(pUZ8002,pSET152)为供体,淡紫灰链霉菌gCLA4为受体进行接合转移试验,并对影响接合效率的培养基、热激温度、接合转移时间和筛选转化子培养基等因素进行优化。【结果】成功地将质粒pSET152转入到了生防链霉菌gCLA4中,明确了可用于筛选链霉菌gCLA4转化子的抗生素为安普霉素或四环素;链霉菌gCLA4孢子50℃热激时转化效率较高,接合效率在16,18,20h下没有明显差异,MS培养基作为接合转移培养基时转化效率最高,接合产物涂布到高氏一号抗性培养基上进行阳性转化子筛选的效果最好。【结论】建立了生防链霉菌gCLA4的遗传转化优化体系。     

链霉菌769接合转移体系的建立

本研究确定了质粒pSET152从大肠杆菌(Escherichia coli)ET12567(pUZ8002)转移到链霉菌769中的接合转移的条件。在MS培养基上得到了最高的接合转移效率;孢子在50℃下热激10 min,供体菌和受体菌的比例为1:10,16～18 h后进行抗生素覆盖的情况下结合转移效率为1.03×10-6～1.23×10-5。经过连续5代的选择压力和PCR验证,表明质粒pSET152已经整合到受体菌株的染色体中。本研究首次建立了链霉菌769接合转移系统。     

转燕麦噬酸菌蛋白激发子基因flagellin的链霉工程菌株构建及鉴定

利迪链霉菌A01可以产生大量的抗生素——纳他霉素,其通过结合病原真菌细胞膜上的甾醇分子而起到抑制病原菌生长的作用.燕麦噬酸菌的鞭毛蛋白组分FLAGELLIN可以诱导植物抗性,激发活性氧及水杨酸防御反应途径.本研究将燕麦噬酸菌蛋白激发子基因flagellin克隆,接合转移入利迪链霉菌A01中,使工程菌增加诱导植物抗性的功能.PCR验证表明:成功获得了含flagellin基因的阳性工程菌株,证明通过链霉工程菌构建可实现抗生与诱抗的协同作用,预计会提高防治植物病害的效果.     

犬新孢子虫NcSRS2基因片段的克隆及原核表达

以含有犬新孢子虫NcSRS2基因的质粒pMD18-NcSRS2为模板,应用PCR方法扩增Nc-SRS2基因,将该基因片段克隆至原核表达载体pGEX-4T-2,构建了重组表达质粒pGEX-Nc-SRS2,转化大肠杆菌BL21中并诱导表达。结果显示,克隆的基因片段长1100bp,SDS-PAGE、Western blotting分析显示,重组质粒pGEX-NcSRS2在大肠杆菌中得到了高效表达。     

金黄色葡萄球菌FnBP配体结合区基因的克隆及其原核表达(英文)

[Objective] The study aimed to clone the FnBP ligand binding gene of Staphylococcus aureus and run prokaryotic expression by constructing a prokaryotic expression vector. [Method] The gene encoding FnBP ligand binding gene was amplified from S.aureus chromosomal DNA by PCR technique. After T-A cloning, plasmid pMD18- FnBP was constructed. pMD18- FnBP and pET28a(+)were digested by BamH Ⅰ and EcoR Ⅰ double enzymes, then the purified FnBP ligand binding gene was subcloned into the expression vector pET28a(+), and the prokaryotic expression vector pET28a-FnBP was thus constructed. The constructed plasmid pET28a-FnBP was transformed into Escherichia coli BL21(DE3) competent cells. The bacterium was induced by IPTG and the expressed products were analyzed by SDS-PAGE and Western blot. [Result] The gene fragment with the length of 370 bp was amplified by PCR approach. One approximately 30 kD exogenous protein was observed in SDS-PAGE analysis. Western blot analysis indicates the protein has antigenicity of S.aureus. [Conclusion] The FnBP ligand binding gene of S.aureus was successfully cloned and expressed in prokaryotic cells.     

eGFP标记狂犬病病毒G基因与EgM123基因重组融合蛋白的表达与鉴定

【目的】反向遗传学技术构建EgM123基因重组狂犬病SRV₉病毒疫苗株,研究狂犬病病毒G基因、细粒棘球绦虫EgM123基因、eGFP基因重组质粒在真核细胞中的蛋白表达效果与蛋白免疫原性,为通过反向遗传学拯救eGFP标记EgM123基因重组狂犬病病毒,制备狂犬病-包虫病二联基因重组疫苗提供研究基础。【方法】将已构建的携带eGFP增强型绿色荧光蛋白的狂犬病病毒G基因重组细粒棘球绦虫EgM123基因重组质粒(3033 bp)利用脂质体转染方法转染BHK-21细胞,使其在BHK-21细胞中表达出融合蛋白,并通过荧光显微镜观察、SDS-PAGE聚丙烯酰氨凝胶电泳、Western blotting试验鉴定融合蛋白的荧光蛋白表达、融合蛋白分子量,鉴定其免疫原性。【结果】在转然后48 h可见绿色荧光蛋白的表达;通过SDS-PAGE聚丙烯酰氨凝胶电泳结果显示,重组质粒在BHK-21细胞中表达获得分子量约为120KDa的融合蛋白;Western blotting结果显示,将蛋白凝胶转移PVDF膜分别经狂犬病病毒G蛋白单克隆抗体、EgM123多克隆抗体、GFP单克隆抗体分别孵育,均在120KDa处可见抗原抗体结合条带。【结论】eGFP标记的狂犬病病毒G基因重组细粒棘球绦虫EgM123基因重组质粒在真核细胞中成功表达出融合性蛋白,且具有免疫原性,     

柔嫩艾美耳球虫F2杂交株Rhomboid基因在大肠杆菌中的表达

根据ET-Rhomboid基因开放阅读框,插入有利于表达的酶切位点设计引物,以虫体DNA为模板扩增并克隆了ET-Rhomboid基因,并将该基因与PET-28a(+)质粒载体连接,构建成了原核表达载体PET-ET-Rhomboid.将构建好的表达质粒转入大肠杆菌DE3,经IFTG诱导表达后,用SDS-PAGE检测表达产物,用蛋白印迹(Western blotting)检测其反应原性.结果表明:含重组质粒的工程菌有明显的表达产物为31 kD的融合蛋白,与推测的融合蛋白的分子量吻合,蛋白印迹检测具有反应原性.     

猪肺炎支原体DnaK基因的表达及ELISA方法建立

猪肺炎支原体(Mhp)是猪气喘病的主要病原体。利用Mhp NJ株的DnaK基因通过SOE-PC(splicing withoverlap extension PCR)R扩增和突变,获得了目的片段并插入表达载体pET-28a(+)中,然后转入宿主菌BL21(DE3)。重组质粒经1 mmol/L IPTG在37°C温度下诱导5 h,目的蛋白可达到总蛋白的14.1%。Western Blotting证明表达的重组蛋白具有猪肺炎支原体反应原性,用该重组蛋白建立的ELISA方法可检测到猪肺炎支原体抗体。此为该病基因工程疫苗抗原的筛选和ELISA诊断试剂盒的研制奠定基础。     

利用E.coli表达猪圆环病毒2型Cap蛋白生产病毒样颗粒疫苗

【目的】研究利用大肠杆菌可溶性表达PCV2b亚型ORF2基因,利用重组Cap蛋白制备PCV2 VLP疫苗的可行性。【方法】 根据大肠杆菌密码子使用频率表优化合成PCV2 NJ株ORF2基因,将其插入原核表达载体pQZ1,鉴定阳性后转入表达宿主菌BL21,利用原核表达平台CVC1102对重组菌进行诱导表达。利用SDS-PAGE与Western blotting对目的基因的表达及产物的可溶性进行分析;利用电镜分析技术鉴定重组Cap蛋白VLP组装;利用BCA试剂盒测定重组大肠杆菌破碎后上清中总蛋白量,利用薄层扫描分析确定目的蛋白百分比,得出目的蛋白量,将重组Cap蛋白的浓度调整为1 mg·mL^-1。使用不同剂量的重组蛋白与206佐剂乳化,免疫2-3周龄抗原抗体双阴性的仔猪,同时设含免疫增强剂CVC1301、CVC1302的试验组、同类制品免疫对照组与空白对照组,免疫后14 d与21 d所有试验猪采血,分离血清,利用武汉科前生物科技有限公司的猪圆环病毒2型抗体ELISA检测试剂盒检测试验猪血清中PCV2抗体水平;免疫后28 d试验猪按照兽用生物制品质量标准汇编中公布的PCV2攻毒程序,利用PCV2 NJ株F₆代进行强毒攻击试验,肌肉注射与口服PCV2 NJ株各10^5.0TCID₅₀,同时利用乳化的钥匙孔血蓝蛋白及硫酸巯基乙醇培养基进行免疫刺激,攻毒后25 d,对所有试验猪进行解剖检测,通过攻毒过程中试验猪体温变化、试验猪平均相对日增重、解剖时试验猪肺部与相关淋巴结的大体变化及攻毒后PCV2核酸检测等4个方面评价大肠杆菌表达制备的PCV2 VLP的免疫效力。【结果】SDS-PAGE结果表明PCV2 NJ株优化的ORF2基因在大肠杆菌中得到了高效表达,表达产物以完全可溶性形式存在于菌体超声波破碎后的上清中;Western blotting分析结果显示表达的重组Cap蛋白能够与PCV2阳性血清发生反应;电镜下观察可见大量直径在17 nm左右的PCV2病毒样颗粒存在于超声破碎后的上清中;500 μg/头重组VLP疫苗免疫猪产生较高的抗体水平,单次免疫后21 d抗体100%达到合格,对PCV2强毒的攻击提供完全保护。【结论】实现了PCV2 Cap蛋白在大肠杆菌中高效可溶性表达,重组Cap蛋白体外自我组装成病毒样颗粒,且具有良好的免疫原性,可用于制备PCV2亚单位疫苗。     

猪细小病毒YL株序列分析及其 VP2基因原核表达

为对猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV)进行分子生物学研究,将该病毒YL株基因组分为4个重叠片段进行PCR扩增,并将扩增产物克隆到pGEM-T载体中,测定病毒基因组全长序列。另外,应用其中1对引物,通过PCR方法扩增出一段包含VP2主要抗原区域的片段,构建重组质粒pET-VP2,IPTG诱导表达。序列分析结果表明,PPV YL株和国内外PPV分离毒株NS1基因核苷酸同源性为97.8%～99.4%,氨基酸同源性为96.7%～99.5%,与国内外主要毒株VP2基因核苷酸同源性为98.7%～99.7%,氨基酸同源性为97.4%～99.8%。进化树分析表明,PPV YL株与BQ株(EU790641)毒株处在同一分支上,遗传距离最近。SDS-PAGE结果显示,表达产物分子质量为56ku,经Western blotting检测具有生物学活性。     

山羊PHGPx基因干扰质粒构建及其抑制效应评价

为了构建高效的靶向山羊PHGPx基因的干扰质粒,并在山羊共培养生精细胞中验证其抑制效应,利用Am-bion在线软件设计4对针对山羊PHGPx有潜在干扰效果的siRNA,体外退火后形成具有发夹结构的shRNA,将其与线性化的pGPU6/GFP/Neo载体相连形成质粒,然后经Pst I和BamH I酶切和测序鉴定;利用脂质体将其转染到体外共培养生精细胞中,用RT-PCR和Western印迹方法检测其PHGPx基因的抑制效应。结果表明:经Pst I和BamH I酶切和测序确定了150、182、214和248共4种pGPU6/GFP/Neo-PHGPx-shRNA的阳性克隆质粒;Lipo-fectamine 2000TM脂质体瞬时转染的共培养生精细胞的Real-time PCR结果表明,pGPU6/GFP/Neo-PHGPx-150、214和248质粒能够显著降低共培养细胞PHGPx mRNA的表达,蛋白免疫印迹结果图像分析免疫条带的平均光密度结果表明,pGPU6/GFP/Neo-PHGPx-214质粒极显著降低了共培养生精细胞PHGPx蛋白表达(P<0.01)。pG-PU6/GFP/Neo-PHGPx-shRNA质粒载体构建成功,pGPU6/GFP/Neo-PHGPx-214质粒瞬时转染共培养生精细胞后可以明显抑制PHGPx基因表达,可用于进一步PHGPx基因功能的研究。