基于重组NS1蛋白猪细小病毒野毒抗体间接ELISA诊断方法的建立与应用

本研究以原核表达的重组NS1蛋白作为诊断抗原,建立了检测猪细小病毒(PPV)野毒抗体的NS1-ELISA诊断方法。该方法检测猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型、猪流行性腹泻病毒5种常见猪病病毒的阳性血清均为阴性;检测灵敏度为1:12800;批内、批间重复性试验的变异系数分别小于5%和10%;与血凝抑制试验(HI)符合率为100%。本研究建立的PPV NS1-ELISA检测方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,为PPV的野毒抗体检测及PPV流行病学调查等快速诊断提供了一种技术手段。     

猪细小病毒在PK细胞中的增殖过程

将猪细小病毒南京毒株1（NJ-1）、南京毒株2（NJ-2）和7909毒株接种于PK-15细胞，用免疫荧光检测方法研究了猪细小病毒增殖的基本特性与规律。在PK-15细胞中，3个毒株的增殖规律基本相似，均在感染后12h即可检测到荧光，表明其子代病毒粒子产生，随后逐渐增多，在感染后48h荧光几乎遍布所有细胞，随后荧光开始衰减，在84h时病毒引起细胞大面积崩解，荧光呈现岛屿状分布。通过绘制其一步法生长曲线可知，在病毒感染后12h，细胞培养液中的病毒TCID50／ml。为2．0左右，随后逐渐增高，感染后60h3种毒株的TCID50／mL均达到最高，子代病毒粒子向细胞外释放也达到高峰，其后TCID50逐渐下降。培养液中病毒粒子的丰寿期为7h。     

猪细小病毒(PPV)SC1株非结构蛋白NS_1基因的克隆和序列分析

本文根据GenBank中PPV NADL-2株病毒基因组序列用Oligo6.0设计了一对引物,以抽提的PPV-SC1 RF-DNA为模板,通过PCR扩增出长约2.2 kb的片段,将其插入克隆载体质粒pMD 18-T的EcoRV酶切位点处,构建了重组质粒pPNS1并测序。密码子偏向性分析结果表明PPV-SC1 NS1基因在同一氨基酸的不同密码子的选择上存在一定的偏向性,主要是以A结尾的密码子;用Bioedit和swiss TMPRED软件预测PPV-SC1 NS1的跨膜区,并没有得到有显著意义的跨膜区的存在;根据基于motif数据库的结构域预测,PPV-SC1 NS1的第393~415位氨基酸残基存在潜在的ATP/GTP结合位点,该蛋白还存在16个蛋白激酶磷酸化位点,21个酪蛋白激酶2磷酸化位点,3个cAMP-/cGMP依赖蛋白激酶磷酸化位点,PPV-SC1 NS1蛋白与POX-D5(痘病毒D5蛋白)具有一致的保守结构域,推测NS1可能与POX-D5有类似的功能。     

2010—2011年猪场中猪源新型甲型流感病毒流行情况调查

为深入了解猪源新型甲型流感病毒的流行情况,本研究对山东省9个地市40个猪场进行了猪源新型甲型流感病毒的感染情况调查。在养猪场采集有流感症状猪的血液样品(263份)和鼻咽拭子(235份),分别用HI试验来检测血清抗体滴度和荧光定量PCR技术检测鼻咽拭子中的流感病毒的含量。结果表明,血清阳性率为23.07%～63.33%,总阳性率为41.6%;荧光定量PCR检测鼻咽拭子阳性率为10.0%～64.28%,总阳性率为30.63%。这为了解山东省猪源新型甲型流感病毒的发生和分布,并采取相应的公共卫生措施提供了依据。