卡那霉素在小麦愈伤组织遗传转化中的应用

为建立利用卡那霉素筛选的小麦遗传转化的有效体系,采用不同浓度的卡那霉素对小麦品种的幼胚愈伤组织进行处理,系统地研究了不同品种、不同愈伤组织诱导培养基、不同诱导培养时间下愈伤组织对卡那霉素筛选的反应。结果表明,不同小麦品种的愈伤组织对卡那霉素的抗性存在显著差异;同一品种不同培养条件下产生的愈伤组织对卡那霉素的反应存在显著差异;小麦品种河农827在N培养基上诱导培养14d得到的愈伤组织在含有15mg.L-1卡那霉素的分化培养基上筛选,效果较好。基因枪介导转化河农827的愈伤组织,用卡那霉素筛选得到的抗性再生苗经PCR检测,检测出12.5%的阳性株。     

Cu^2＋浓度对啤酒大麦幼胚组织培养与植株再生的影响

为了提高大麦幼胚胚性愈伤组织和植株再生频率,本试验以引进的4个啤酒大麦品种为材料,在诱导、分化与生根培养基上分别进行了不同浓度Cu2+处理.结果表明,MS诱导培养基中增加Cu2+浓度对啤酒大麦愈伤组织的诱导无明显影响,但对胚性愈伤组织的形成有明显的促进作用;在分化与生根培养基中不同浓度Cu2+处理的各品种再生率也存在显著差异,都表现为在5.0～10.0μmol@L-1的浓度下明显提高了出愈率和再生率,而且每个胚性愈伤组织的平均再生率也有显著提高.通过切片技术证明Cu2+浓度主要影响胚性愈伤组织的发生.供试品种在出愈率和再生率上也存在一定的差异,同时Cu2+浓度和基因型之间表现出正互作效应.     

小麦成熟胚组织培养再生体系的优化及高再生率基因型的筛选

为了优化小麦成熟胚组织培养再生体系,并从优良小麦品种中筛选出高再生率基因型,选用20个小麦品种为材料,研究了4种胚的不同处理方式对成熟胚脱分化率及形成愈伤组织质量的影响,6种不同激素配比对愈伤组织分化再生的影响及2种生根培养基的生根效果;并对参试品种中的高再生率基因型进行了筛选。结果表明,用纵半切的全胚进行愈伤组织诱导形成的愈伤组织质量最好;小麦成熟胚愈伤组织在以下3种激素配比,即：B.IAA 1.0 mg.L-1＋ZT 2 mg.L-1;E.2,4-D 0.1 mg.L-1＋ZT 10 mg.L-1;F.6-BA 1 mg.L-1＋NAA 0.3 mg.L-1＋KT 4 mg.L-1的培养基上分化再生成苗率较高;再生苗在不加生长素的1/2MS培养基上生根效果很好。在供试的20个小麦品种中,有12个小麦品种的再生成苗率达到20%以上,其中西农928、宁春16和西农889的再生成苗率分别高达77.6%、52.7%和36.9%。B分化培养基对大部分基因型愈伤组织的分化培养具有比较好的通用性。本研究从黄淮麦区推广的小麦品种中筛选出的一些高再生率的基因型可以用作该地区小麦转基因研究的受体材料。     

大麦成熟胚培养高再生率品种的筛选

为了对大麦遗传转化受体进行筛选,本文比较分析了30个大麦品种的成熟胚在改良过的培养基上的培养效率。结果表明,大麦成熟胚在组织培养中,品种间愈伤组织的出愈率的差异非常显著。Morex的出愈率高达94.95%,短芒紫青稞的出愈率则低于6%。在成熟胚形成愈伤组织的时候,将胚刮碎相比整胚接种,可以获得出芽少、相对较好的诱导效果;不同品种的大麦愈伤组织,其分化率也有显著差异,浙秀22的分化率高达97.6%,驻大麦5号的分化率则较低,仅为11.85%。在再生率方面,不同的品种间具有显著的差异,Goldenpromise的再生率较高,达到了44.7%,垦啤麦9号的再生率较低,仅为1.4%。扬农啤9号白化苗的发生率较高,达到13.25%,有23个品种的白化苗发生率均不超过10%。综合分析,Golden promise、浙皮8号、浙秀12、Metcalfe、Franklin、浙大8号六个大麦品种具有良好的成熟胚培养效果以及较高的再生能力,可以作为大麦遗传转化的受体进行利用。     

西北地区特色大麦品种成熟胚离体培养的初步研究

为筛选组织培养特性优良的大麦品种并建立高效的再生体系,选用西北地区主栽品种甘啤3号、甘啤4号、甘啤6号及德国引进品种玛俐、博乐共5个大麦品种,分别研究了基因型、培养基成分、种子处理方式等因素对大麦成熟胚组织培养的影响.结果表明,不同大麦品种的出愈率、绿点率和绿苗率均存在极显著差异,其中博乐的综合效应最好.脱分化培养基A3、分化培养基C2是适合进行再生体系构建的培养基.胚刮碎与纵切处理的愈伤组织诱导率显著高于横切.甘啤3号、甘啤4号、博乐的愈伤组织诱导频率和分化绿苗率均较高,是适合进行遗传转化的受体材料.     

马铃薯品种‘并薯6号’遗传转化体系的建立

以马铃薯品种‘并薯6号’无菌试管苗茎段作为外植体,通过对遗传转化过程中预培养时间、植物激素的种类及配比、筛选剂浓度和抗生素的种类及浓度进行研究,初步建立了马铃薯品种‘并薯6号’的愈伤再生转化体系。结果表明,预培养时间为2 d时,愈伤组织诱导率、出苗率及转化频率最高。最适外植体愈伤组织诱导的培养基配方为MS+2.0 mg/L 6-苄氨基嘌呤(6-BA)+0.5 mg/L 2,4-二氯苯酚代乙酚(2,4-D)+0.4 mg/L激动素(KT),愈伤组织的诱导率为86.7%,愈伤组织形态较紧密,为深绿色,茎段两端膨大呈哑铃状,表面的白色须状物和毛状根较少。最适愈伤组织分化的培养基配方为MS+1 mg/L 6-苄氨基嘌呤(6-BA)+1 mg/L赤霉素(GA_3)+1 mg/L玉米素(ZT),幼苗比较粗壮,长势良好。最适的植株再生及生根筛选剂为10 mg/L的潮霉素(Hygromycin B,Hyg),转化频率较高,为20.3%。农杆菌抑制剂的最适浓度为200 mg/L的特美汀(Timentin,TMT),且在愈伤组织诱导、分化及生根阶段都需要加入TMT。综上所述,通过对农杆菌介导的愈伤再生转化过程中各个因素的研究,初步建立了‘并薯6号’的遗传转化体系,为马铃薯分子育种发展提供一定的基础。     

农杆菌介导的小麦成熟胚转化的影响因素

为了研究农杆菌介导的小麦成熟胚转化的影响因素,以6个小麦品种成熟胚为外植体进行离体培养,以EHA105和LBA4404农杆菌为供体(含有pCAMBIA1305双元载体)材料,研究了诱导培养基、分化培养基、农杆菌菌株、愈伤组织诱导培养时间、农杆菌菌液浓度和侵染时间对小麦成熟胚愈伤组织诱导、分化、再生的影响。结果表明:(1)以小麦品种小偃22的成熟胚为材料,获得最佳的诱导培养基方案(MS+2mg.L-1 2,4-D+0.5mg.L-1 KT+500mg.L-1水解酪蛋白+150mg.L-1天门冬酰胺)和分化培养基方案(MS+2mg.L-1 ZT+0.5mg.L-1 KT);(2)6个小麦品种中,洛阳8176和张掖春小麦具有较强的再生能力,筛选培养后较多的愈伤组织分化出小绿点;(3)洛阳8716和张掖春小麦的成熟胚,经愈伤组织诱导培养6-7d,农杆菌侵染后愈伤组织再生能力强;(4)农杆菌侵染后愈伤组织的再生能力与农杆菌菌株的关系不明显,而与小麦品种基因型、侵染时间和菌液浓度有较明显的关系;(5)以小麦洛阳8716和张掖春小麦成熟胚愈伤组织为受体,黑暗条件下诱导培养6-7d,在24±1℃黑暗条件下共培养3d和500mg.L-1羧苄青霉素(Cb)除菌及10mg.L-1潮霉素筛选处理后,共得到分化植株23株,其中以洛阳8716为受体材料,由农杆菌LBA4404和EHA105转化得到的植株分别为11株和4株,植株分化率分别为3.57%和1.31%;以张掖春小麦为受体材料,由农杆菌LBA4404和EHA105转化得到的植株分别为5株和3株,植株分化率分别为1.57%和1.14%。     

发根农杆菌介导抗菌肽Shiva1基因转化马铃薯的初步研究

利用已构建载体530Shiva,转化马铃薯普通栽培种甘农薯1号、澳布、HLS和夏波蒂的试管苗及块茎盘的研究。结果表明,以Kan50mg·L-1和100mg·L-1作为筛选转基因细胞和植株的剂量。对于发根农杆菌侵染马铃薯试管苗应采用新鲜菌落直接涂抹伤口进行侵染,这种方法诱导生根率高且易于操作,根诱导率、成愈率及分化率远高于浸泡法;发根农杆菌转化试管苗,后期愈伤组织分化产生5个幼苗。发根农杆菌菌液侵染甘农薯1号和夏波蒂两品种的块茎盘,7d后就有很小的毛状根突起产生,2周后即有大量毛状根产生,3周后毛状根产生量有所减少,产生的毛状根3周时其成愈率分别为31.0%和27.0%,愈伤组织分化成苗比较困难,分化出3个幼苗,分化率分别为6.45%和3.70%。转化材料进行冠瘿碱检测表明,分化苗均为胭脂碱阳性反应。环腐病菌接种试管苗结果表明,分化植株与对照相比抗性明显增强。     

马铃薯品种‘陇薯11号’再生体系的构建

采用L_(16)(4~5)正交试验设计,以马铃薯品种‘陇薯11号’为试验材料,分别选用4种植物激素(诱导愈伤的GA_3、6-BA、NAA、2,4-D和诱导分化的GA_3、NAA、IAA、KT)的4个水平对其茎段的离体再生进行了研究,筛选适合‘陇薯11号’的愈伤和芽分化诱导培养基。结果表明,适合‘陇薯11号’的茎段愈伤诱导培养基为MS+GA_3(7.5 mg/L)+6-BA(2.5 mg/L)+2,4-D(0.5 mg/L),诱导率达98.72%,生长状态最好;诱导芽分化的最佳培养基为MS+NAA(0.25 mg/L)+IAA(0.1 mg/L)+KT(3.0 mg/L),不定芽诱导率为95.83%,分化苗健壮。     

发根农杆菌介导抗菌肽Shival基因转化马铃薯的初步研究

利用已构建载体530 Shiva,转化马铃薯普通栽培种甘农薯1号、澳布、HLS和夏波蒂的试管苗及块茎盘的研究.结果表明,以Kan 50 mg·L-1和100 mg·L-1作为筛选转基因细胞和植株的剂量.对于发根农杆菌侵染马铃薯试管苗应采用新鲜菌落直接涂抹伤口进行侵染,这种方法诱导生根率高且易于操作,根诱导率、成愈率及分化率远高于浸泡法;发根农杆菌转化试管苗,后期愈伤组织分化产生5个幼苗.发根农杆菌菌液侵染甘农薯1号和夏波蒂两品种的块茎盘,7 d后就有很小的毛状根突起产生,2周后即有大量毛状根产生,3周后毛状根产生量有所减少,产生的毛状根3周时其成愈率分别为31.0%和27.0%,愈伤组织分化成苗比较困难,分化出3个幼苗,分化率分别为6.45%和3.70%.转化材料进行冠瘿碱检测表明,分化苗均为胭脂碱阳性反应.环腐病菌接种试管苗结果表明,分化植株与对照相比抗性明显增强.