R4杂交瘤细胞株分泌的抗锥虫单克隆抗体对伊氏锥虫感染的影响

我们曾经应用杂交瘤技术研制并分离到多株分泌抗伊氏锥虫单克隆抗体的杂交瘤细胞株。其中2-C-7、R_4等株具有较高的抗体阳性滴度(ELISA法)。对2-C-7,我们已做过多方面的研究,而对R_4了解尚少。为了进一步了解R_4单抗对伊氏锥虫感染的抑制活性,我们进行了本研究。     

抗伊氏锥虫表膜单克隆抗体的研究Ⅰ.杂交瘤细胞株的建立与鉴定

利用淋巴细胞杂交瘤技术,建立了3株抗伊氏锥虫表膜抗原的McAb杂交癌细胞株1C_2、2A_3、5B_7,对其鉴定的结果;①杂交瘤细胞所诱生的腹水效价,1C_2为2×10~(-4)、2A_3 4×10~(-4)、5B_7 64×10~(-4);培养上清效价,1C_2为1/512、2A_3 1/512、5B_7 1/1024。②3株细胞所产生的McAb均为IgM。③杂交瘤细胞的染色体数,1C_2 82条、2A_3 96条、5B_7 106条。④用McAb作抗原定位,均结合于伊氏锥虫虫体表面。⑤McAb与伊氏锥虫表膜以外的其它抗原成分反应较弱,与锥虫属以外的病原体不发生反应,与泰氏锥虫、路氏锥虫有部分交叉反应。⑥3株McAb对虫体均无抑制作用。     

抗水牛伊氏锥虫变异表面糖蛋白抗原单克隆抗体的研制

用纯化的伊氏锥虫变异表面糖蛋白（variant surface glucoprotein, VSG）免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,经过3次克隆和间接ELISA方法筛选,获得3D7、5B9 2株稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,用间接ELISA方法检测杂交瘤细胞培养液上清效价和小鼠腹水效价,其中细胞培养上清效价分别为1∶6400和1∶12800,腹水效价分别为1∶105和1∶106。单抗的亚型鉴定结果表明,3D7、5B9分泌的抗体都为IgG1亚类κ链。     

水牛伊氏锥虫人工感染抗体规律及其广西地区自然感染状况的初步调查

通过实验感染,研究伊氏锥虫在水牛体内抗体及虫体消长的规律.ELISA检测结果表明,水牛感染伊氏锥虫后第6 d检出抗体,而且在2个多月的监测时间里,抗体都维持在较高水平(OD450nm>0.3),因此可利用ELISA方法对水牛感染伊氏锥虫进行早期诊断和监测;水牛感染伊氏锥虫后,即出现一个2～3周左右的虫血症峰期,然后虫血症峰期迅速下降,在虫血症峰期下降后1个多月的监测时间里,虫血症维持在一个很低的水平(≤1条虫体/视野),水牛感染伊氏锥虫后这种峰期短无明显症状、虫血症水平低的现象,给临床诊断和血液镜检虫体造成了一定的困难.对广西部分地区79份血清样品水牛检测的结果表明,伊氏锥虫抗体阳性率达到29.1%,说明广西各地水牛感染伊氏锥虫的现象普遍存在,而且感染率比较高,为了保证本地区水牛产业的健康发展,有必要对水牛伊氏锥虫感染进行有效的监测.     

分泌抗伊氏锥虫单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

按katendel氏法用伊氏锥虫JG株制备全虫抗原,以其免疫BALB/C小鼠。以50％PEG(MW4000,pH8.0)作融合剂。使免疫鼠脾细胞与S P2/0 Ag14(简称S P2/0)骨髓瘤细胞融合。经系统筛选和克隆化,建立了9个分泌抗伊氏锥虫抗体的杂交瘤细胞株。他们分泌的McAb,4株为IgG1、1株为IgG3、另4株为IgM。9株McAb在琼脂免疫双扩散试验中均不形成沉淀线。用ELISA检测,这些细胞系培养上清和腹水与同源伊氏锥虫虫株抗原的滴度分别为1:64-1:1024和1:6.4×103-1:6.4×105;与泰氏锥虫和弓形虫抗原则全为阴性。用2个异源伊氏傩虫虫株抗原检测时,8株无任何交叉反应,8株与2个异源株均有交叉反应,另3株则只与1个异源株有交叉反应。用增值反应检查了5株IgG类McAb识别抗原决定簇的特异性,除2株共同识别一种抗原决定簇外,另8株各自识别不同的抗原决定簇。     

抗伊氏锥虫变异表面糖蛋白单克隆抗体的初步研究

应用淋巴细胞杂交瘤技术制备了2个抗伊氏锥虫变异表面糖蛋白的McAb。特异性实验结果表明,2个McAb只与伊氏锥虫同一变异型表面抗原发生特异反应,而不与同种异株或同株不同变异型伊氏锥虫发生交叉反应,亦不与路氏锥虫等不同种抗原反应。运用正辛酸与硫酸铵二步沉淀法纯化了腹水MeAb,纯化后的McAb活性没有明显降低。应用2个McAb,以ELISA抑制试验检测了4份伊氏锥虫血清,结果均未出现明显的抑制作用,表明血清样本间很少或完全没有与McAb相类似的抗体,进而说明伊氏锥虫存在多个血清型亦即变异抗原型。     

用DEAE—纤维素柱分离伊氏锥虫

本文报道了用国产DEAE—纤维素从人工感染伊氏锥虫的小鼠、大鼠和犬的血液分离伊氏锥虫的具体方法,测定了压积DEAE—纤维素对小鼠、大鼠和犬的血液吸附值分别为0.25～0.41、0.23～0.39、0.33;伊氏锥虫的回收率,小鼠为83.19～98.19％,大鼠为84.87～93.85％。分离的锥虫形态正常,运动活泼,离心浓集后呈炼乳状,镜检无任何血细胞。此外,对用DEAE—纤维素分离伊氏锥虫的有关技术问题作了讨论。     

筛选伊氏锥虫单克隆抗体检测方法的建立—ELISA

首先采用DEAE纤维素柱层析法从感染动物血液中分离获得纯净的伊氏锥虫,通过超声乳化结合离心得到可溶性锥虫抗原,作为免疫接种及检测用:通过免疫大白鼠获得鼠抗伊氏锥虫阳性血清,用辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG血清获得酶标抗体,经测试,抗原工作浓度为1:80(原浓度为2.57mg/ml),酶标抗体工作浓度为1:400,从而建立了酶联免疫吸附试验(ELISA),作为筛选抗伊氏锥虫单克隆抗体的检测手段。实践证明该方法灵敏度高,特异性强,使用方便。     

应用单克隆抗体检查伊氏锥虫抗原变异

用广西骡株伊氏锥虫可溶性抗原免疫的BALB/C小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(SP_2/O)融合,获得了在ELISA中能与广西骡株伊氏锥虫可溶性变异表面糖蛋白反应的2个分泌IgG_1的单克隆抗体(McAb)。用McAb于ELISA抑制试验对四份不同期的广西骡株伊氏锥虫阳性血清的抗体成分进行了分析,结果四份锥虫阳性血清对于McAb与相应抗原决定簇的结合均未出现明显的抑制作用。表明血清样本间很少或完全没有与McAb相类似的抗体。这证明伊氏锥虫存在多个血清型亦即变异抗原型。     

印度尼西亚犊牛的伊氏锥虫感染

出生于西部爪哇伊氏锥虫流行区不同农场的15头黄牛和11头水牛犊,每间隔一个月检测其伊氏锥虫和抗体的存在,直到12月龄,50％的黄牛和83％的水牛犊在出生后一个月内抗体为阳性,这种抗体被认为来自初乳。以后抗体的持续形成,并在12月龄时最高,认为此现象是对伊氏锥虫感染的应答。母源抗体对其并没有保护作用。     

媾疫锥虫、伊氏锥虫差异抗原的分离鉴定

以50％饱和硫酸铵沉淀的兔抗伊氏锥虫高免血清球蛋白制备琼脂糖-4B免疫吸附柱,对马媾疫锥虫超声全虫可溶性抗原进行反亲和层析免疫吸附。当抗原量在抗体吸附范围内时,最先洗脱下来的成分即为媾疫锥虫特异性抗原(差异抗原)。该抗原与媾疫锥虫血清抗体反应较强,与伊氏锥虫血清抗体反应较弱,经SDS-PAGE检测,其为分子量大于68000的大分子蛋白。     

应用酶联免疫吸附试验检测伊氏锥虫循环抗原的实验研究

本文介绍一种检测伊氏锥虫循环抗原的双抗体夹心酶联免疫吸附试验。这种试验敏感性和特异性高,检查实验室制备的伊氏锥虫可溶性抗原,可检出的阈值为0.049—0.195微克蛋白/毫升(0.122±0.066微克蛋白/毫升);检查泰氏锥虫和龚地弓形体抗原,即使抗原浓度分别高达180微克蛋白/毫升和200微克蛋白/毫升,亦为阴性。用此法观察了7只实验感染家兔血清中伊氏锥虫循环抗原的动态,实验兔于感染后4—8天首次呈现抗原血症,滴度于感染后8—10天达高峰,持续仅4—12天,于感染后14—28天转为阴性,而实验感染前和用拜耳205治疗后的血清则全部阴性。将治疗前已转阴的15份血清和治疗后的28份血清标本按Bout等介绍的方法解离免疫复合物再检循环抗原,前者10份阳性,后者全部阴性.此结果证明,实验感染兔于感染后2—4周血清中出现伊氏锥虫抗原-抗体免疫复合物,复合物的产生影响循环抗原的检出。     

猪胸膜肺炎放线杆菌单克隆抗体的制备与鉴定

目的:建立抗血清1型猪胸膜肺炎放线杆菌(APP-1)脂多糖(LPS)的单克隆抗体杂交瘤细胞株,为今后建立该菌的免疫检测技术奠定基础。方法:腹腔注射APP-1标准株的甲醛固定抗原免疫BALB/c小鼠,ELISA检测血清中LPS抗体滴度并选择值最高的小鼠用于细胞融合,且于融合前3天加强免疫1次。常规方法进行融合,HT、HAT培养液选择培养融合后的细胞,ELISA检测细胞培养上清中的LPS抗体,阳性杂交瘤细胞用有限稀释法克隆传代。结果:获得2株稳定分泌抗APP-1LPS抗原的单克隆抗体杂交瘤细胞株,其小鼠腹水单克隆抗体效价132000～164000。结论:已成功建立2株稳定分泌抗APP-1LPS抗原的单克隆抗体杂交瘤细胞株,为今后建立该菌的免疫胶体金分型诊断技术奠定基础。     

分泌抗伊氏锥虫单克隆抗体的杂交瘤细胞株的建立

通过3次sp2/0骨髓瘤细胞与免疫小鼠脾细胞间的融合试验,筛选出7株分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。对其中2G_6细胞株作了进一步的检定分析,用2G_6上清液对T.e抗原进行ELISA试验,显示出高度的特异性,与血吸虫、弓形虫均未出现交叉反应。效价为1∶5.1×10~3,诱生腹水抗体的效价为1∶1.6×10~7,免疫球蛋白类型属IgG_1亚美。该细胞株在外培养下,稳定地分泌特异性抗体已达6个月之久,在液氮冻存近8个日之后仍深持分泌抗体的能力。     

间接荧光抗体试验诊断马骡伊氏锥虫病的研究

以人工感染伊氏锥虫的小鼠血液涂片为抗原,建立了IFA试验检测马骡伊氏锥虫抗体的方法,并对伊氏锥虫病马、同群马、健康马、非伊氏锥虫病马血清作了检测。伊氏锥虫病马和无症状同群马的抗体阳性率分别为97％(33/34)和12％(18/150);25匹健康马血清伊氏锥虫抗体均为阴性;84份非伊氏锥虫病马血清的IFA试验均为阴性,未出现交叉反应。多数病马发病一周内的血清IFA试验即为阳性。3匹病马血清抗体消长动态观察结果表明,病马于治疗后110天,血清IFA试验仍为阳性。本试验表明,IFA试验检测马骡伊氏锥虫抗体,敏感性高、特异性强,对无症状的感染马也能检出,可用于本病的早期诊断和血清流行病学调查。     

应用质粒PTK探针鉴定锥虫的初步研究

用^32P标记质粒探针PTK1、PTK1.1和PTK1．2，对12株中国伊氏锥虫的斑点杂交试验显示，3个探针均能与8株具有正常动基体的伊氏锥虫杂交，而不与其余4株异常动基体伊氏锥虫杂交，对正常动基体株的敏感度为10^2虫体。探针PTK1亦能与马媾疫锥虫杂交，敏感度为10^2个虫体。但PTK1与布氏锥虫仅发生微弱的杂交反应．敏感度为10^5个虫体。试验表明伊氏锥虫株之间的kDNA微环是同源的，伊氏锥虫与马媾疫锥虫和布氏锥虫的kDNA微环存在着共同序列。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒M蛋白单克隆抗体制备及抗原表位鉴定

为制备猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)M蛋白单克隆抗体，将PRRSV类NADC30毒株FJ1402的M蛋白胞外区基因与TAT穿膜肽基因融合，密码子按大肠杆菌偏嗜性优化，构建了大肠杆菌表达质粒，制备获得重组M蛋白。取6周龄雌性BALB/c小鼠免疫重组蛋白，将脾脏淋巴细胞和SP2/0细胞融合，用间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞株，获得4株分泌M蛋白抗体的杂交瘤细胞株。其中1E7、2F7、3A12的细胞上清液抗体效价为1∶3 200,3G7的细胞上清液抗体效价为1∶800,传至第15代均能稳定分泌抗体。单抗经亚型鉴定可知1E7、2F7、3A12的重链类型为Ig2a, 3G7的重链类型为IgG1,轻链类型都为κ型。经间接免疫荧光试验(IFA)和Western blot鉴定，4株单克隆抗体均可与PRRSV产生特异性反应，鉴定出2个抗原表位，为PRRSV诊断和疫苗研制奠定了基础。     

牛初乳免疫球蛋白IgG单克隆抗体的制备

为了制备牛初乳免疫球蛋白IgG单克隆抗体,试验利用标准IgG蛋白作为免疫原,免疫6周龄Balb/c雌性小鼠,运用淋巴细胞杂交瘤技术,通过间接ELISA法筛选,采用有限稀释法,经过3次克隆筛选,获得2株稳定分泌抗IgG蛋白的杂交瘤细胞株,分别命名为E7和D9,并进行了亚类鉴定.结果表明:该杂交瘤细胞培养上清液抗体效价抗体...     

克隆伊氏锥虫对安锥赛抗药性的培育

为了深入观察伊氏锥虫对安锥赛抗药性的形成,将伊氏锥虫浙江水牛株克隆,克隆繁殖后的虫体一部分作为原种对照组,即C01组;一部分虫体连续经环磷酰胺免疫抑制的小鼠,再用安锥赛亚治疗剂量治疗该小鼠,使其伊氏锥虫对安锥赛产生7个不同程度的抗药性组,即C1～C7组;另一部分虫体也连续经环磷酰胺免疫抑制的小鼠,作为伴随C7的同步繁殖组,即不用药物的C02组.结果C01、C02、C1～C7组所用安锥赛剂量依次为0、0、6、16、40、80、196、406、638mg/kg,它们经小鼠传代数依次为0、28、1、3、6、9、15、22、28代.用体外生长繁殖抑制法测得它们的ICs0值依次为0.015 50、0.016 87、0.082 60、0.102 37、1.409 29、1.922 90、9.923 30、23.563 00、43.84000.结果表明,安锥赛亚治疗剂量与伊氏锥虫抗药性的IC50值呈曲线关系,从C1到C4的IC50值上升较缓慢,从C4后的ICs0值上升较快,并且几乎呈直线上升;伊氏锥虫所经小鼠的代数与它们的IC50值的关系呈抛物线型,从C1到C4的ICs0值上升很慢,C4以后的IC50值上升很快.用体内试验测试C01～C4组的CD100值,每个组感染35只小鼠,每只小鼠接种1.0×104条锥虫,其中30只小鼠分为安锥赛的3个剂量治疗小组,另5只小鼠为不治疗对照组.结果C01组和C1组的CD100值分别为7.0、13.0 mg/kg,这表明C1组只经1代免疫抑制小鼠,注射安锥赛剂量3×2 mg/kg,就使该组伊氏锥虫对安锥赛的抗药性提高了6 mg/kg,并且它们的IC50值C1是C01的6.6倍.C2、C3和C4组由于抗药性程度过高均不能治愈,因此尚未测到它们的CD100值.这些结果表明,伊氏锥虫经免疫抑制小鼠对安锥赛产生抗药性的速度是非常快的.     

基于18S rRNA基因测序基础上的锥虫分子分类学

利用18S rRNA基因序列分析方法,对我国湖北、广西、新疆和浙江4省的伊氏锥虫及1株布氏锥虫进行分子分类学研究.用分离的锥虫感染实验动物,自感染小鼠的红细胞或全血中提取基因组DNA,根据GenBank中已发表的雏虫18S rRNA序列设计1对锥虫通用引物,通过PCR扩增目的基因片段,将扩增产物连接到pGEM-T载体中,经酶切、PCR确定,进行序列测定.结果显示,7个锥虫分离株的18S rRNA基因大小为2 188 bp.利用DNAS-tar对试验所获得的这7株锥虫和GenBank中部分锥虫的18S rRNA基因进行比较分析,建立2个进化系统发生树.核苷酸同源性比较及系统发生树显示:自我国上述4省分离的伊氏锥虫来源于同一株系,布氏锥虫和广西分离的伊氏锥虫株的18S rRNA核苷酸与其他锥虫分离株仅有较小差异,与国外的6株锥虫的同源性为99%～100%,与另外7株的同源性为62%.