枇杷SSR反应体系的建立及优化

为探索适宜枇杷的SSR反应体系,利用正交设计对Mg2＋、dNTPs、引物、Taq酶和模板DNA等5种因素4个水平进行筛选和优化。结果表明：20uL反应体系中,Mg2＋、dNTPs和引物的最适浓度分别为1．5mmol．L-1、0．15mmol·L-1、0．2umol·L-1,Taq酶最适用量为1U,模板DNA最适用量为20ng;引物的最佳退火温度为51．0～60．0℃。利用该反应体系对17份枇杷种质进行扩增,电泳结果显示,不同品种间DNA谱带多态性丰富,证实该体系稳定可靠。     

山梨SSR反应体系的建立及其稳定性验证

以山梨为试材,提取基因组DNA,运用5因素5水平正交实验设计,对SSR反应体系中的DNA模板、Mg2+、Taq酶、dNTPs和引物用量进行优化试验,确立适宜的SSR反应体系。结果表明:20μL反应体系中,模板DNA 10ng、Mg2+(20mmol/L)2.5μL、Taq酶1.25U、dNTPs(10mmol/L)1.0μL、引物(10μmol/L)1.5μL、10×PCR buffer 2.0μL;应用该SSR体系,在引物筛选试验及山梨×"幸水"后代群体中进行扩增,扩增效果较好,证实了该体系的适用性和稳定性。     

甜樱桃SSR体系的建立、优化及应用

为摸索适宜甜樱桃的SSR反应体系,利用正交设计对Mg2+、dNTPs、引物、Taq酶和模板DNA等5种因素4个水平进行筛选和优化,20μL反应体系中,Mg2+、dNTPs和引物的最适浓度为1.5mmol/L、0.2mmol/L、0.4μmol/L,Taq酶宜加入1U,模板DNA应加入10～40ng;引物的最佳退火温度为56.0～62.8℃。用10对引物及建成的反应体系对10个供试品种扩增,6%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,品种间DNA谱带多态性丰富,共有29个等位位点,证实该体系稳定可靠。     

辣椒SSR反应体系的优化

本试验研究了辣椒SSR-PCR反应体系的主要成分对扩增结果的影响,同时进行了退火温度梯度和循环次数试验。优化后的反应体系为:总体积20μL,1.5μL模板DNA(25ng/μL)、1U Taq酶、0.375μmol.L-1引物、1.875mmol.L-1Mg2 、0.2mmol.L-1dNTPs、1XPCR buffer。扩增程序为:94℃预变性4min,94℃变性45s,58℃(以SSR005为例)退火45s,72℃延伸90s,35个循环,最后一个循环延伸增加为8min,4℃保存至电泳。     

苹果品种的SSR分析

 利用SSR方法对苹果25个品种进行了基因组多态性分析, 从20对引物中筛选出10对多态性引物用于正式扩增, 一共扩增出97个位点, 平均每对引物扩增出917个位点, 扩增条带的多态性百分率在56.4%～100%之间。用两对引物(GD142和02b1) 即可区分全部供试品种。根据SSR 分析结果, 应用NTSYS软件进行相似性系数计算, 利用UPGMA法构建聚类树状图。其结果表明, 供试苹果品种分为4个类群, 与传统系谱基本一致。     

仁用杏SSR反应体系的建立与优化

采用正交设计结合单因素分析,建立并优化了仁用杏SSR反应体系。结果表明:20μL反应体系中,Mg2+、Taq DNA聚合酶、dNTPs和引物的浓度分别为1.5 mmol/L1、.5 U、0.2mmol/L、0.25μmol/L,引物退火温度为52℃。应用该体系对24份仁用杏资源进行SSR分析,DNA谱带多态性丰富,将为仁用杏资源的SSR分析提供技术支持。     

苹果果皮颜色性状的SSR标记

以24个苹果品种以及来自3个不同杂交组合的60个F1代结果单株为试材,对与苹果果皮颜色性状相关的DNA分子标记进行了研究。通过采用集群分类法(Bulked Segregant Analysis,BSA)对当前定位于苹果基因组图谱LG9上的所有SSR引物的分析,筛选到了一个与苹果果皮红色/非红色性状相关的SSR标记CN444542-156,该标记在红色表型上表现为隐性,在非红色表型上表现为显性。进一步分析表明,该标记对F1代单株性状预测的正确率为93.3%。     

菊花SSR-PCR反应体系的建立和优化

为快速确定菊花SSR反应体系,利用正交实验设计L16(45)对菊花基因组SSR-PCR反应体系的5个因素(模板DNA、Mg2+、dNTP、引物和Taq酶)在4个水平上进行正交设计,筛选出适合菊花的最佳SSR-PCR反应体系,进一步利用单因素完全随机试验筛选各反应因素的最佳水平。结果表明:建立菊花基因组DNA SSR-PCR反应体系为25μL:60ng模板DNA、2.0mmol/L Mg2+、0.1mmol/L dNTP、0.3μmol/L引物、1UTaq酶。并对菊花引物进行梯度退火试验,其最佳退火温度在53.1℃;扩增程序是:95℃预变性5min;32个循环的94℃变性50s、53.1℃退火50s、72℃延伸50s;72℃延伸8min,4℃保存。该体系的建立为今后菊花SSR分析奠定了基础。     

苹果SRAP-PCR反应体系的建立

以苹果(Malus domestica Borkh.)品种Telamon及Telamon×Fuji的F1代为试材,采用改良的CTAB法提取苹果叶片的DNA,利用正交设计L16(45)和直观分析以及方差分析相结合,探讨了Mg2+、dNTPs、Primer、Taq聚合酶、模板DNA用量对苹果SRAP-PCR反应的影响。建立了总体积为10μL的苹果SRAP-PCR反应体系,Mg2+浓度为2.0mmol.L-1,dNTPs浓度为0.8 mmol.L-1,Primer浓度为0.2μmol.L-1,Taq DNA聚合酶含量为0.6 U,DNA含量为60 ng,并含1μL 10×buffer(Mg2+free)。应用该反应体系,用不同的引物组合对48份苹果样品DNA进行SRAP-PCR扩增,结果显示反应体系具有较高的稳定性。     

利用苹果SSR引物分析山楂属植物遗传关系

SSR引物在不同物种间具有通用性,从141对苹果属(Malus spp.)SSR引物中筛选出10对适合于山楂属(Crataegus spp.)植物的SSR引物,并对8个种37份山楂种质资源的遗传关系进行了分析。10对SSR引物共检测到91个多态性谱带,每个位点的等位基因数为3～13个,平均为9.1个。位点杂合度为0.432～0.790,平均为0.688。10对SSR引物可以将20份山楂资源区分开,17份不能区分的资源分为3组,第1组为3个伏山楂品种,第2组和第3组分别包括大果山楂的2个和12个品种。基于SSR标记构建的聚类树状图将供试37份山楂资源分成2个类群,第1类群包括6个山楂野生种,第2类群包括供试的所有伏山楂、山楂和大果山楂资源。该聚类结果与传统形态学分类一致。     

无融合生殖苹果砧木F_1代实生苗的流式细胞术倍性分析及SSR鉴定

早期快速、准确地鉴定出无融合生殖苹果砧木F1代实生苗的有性杂种,可以减少土地使用面积,提高育种效率。SSR是鉴定果树杂种实生苗快速有效的分子标记技术之一。研究对青砧二号(A1)和宁8(N8)组合F1代杂种实生苗的22个单株进行了倍性分析及SSR鉴定,并对亲本和F1各单株的植物学特征进行了调查,倍性分析表明,有3株表现为四倍体;SSR分析表明,13株表现为母本带型,为母本的无融合生殖后代;9株表现为杂合带型或父本带型,为母本与父本的有性杂种。SSR鉴定结果和杂交实生苗的田间表现高度吻合。SSR标记技术可以准确地对无融合生殖亲本的有性杂种后代进行早期鉴别。     

板栗SSR和RAPD技术体系的建立

主要从板栗DNA提取、PCR条件的优化等环节对SSR和RAPD的反应条件进行了优化。结果表明,采用PVP和β-巯基乙醇联合除酚,用多次洗涤和高盐相结合进行除糖提取高质量板栗基因组DNA,所获得的DNA完整,无降解,分子量在23kb以上,可扩增、可酶切,D260nm/D230nm在2.0以上,D260nm/D280nm为1.8～2.0,产率为40～300μgDNA/g叶组织,完全满足SSR、RAPD、AFLP等分子标记技术分析的需要。采用单因素对PCR反应体系中各个影响因素进行优化,结果表明对PCR结果影响最为明显的是退火温度和Mg2+浓度的变化。对退火温度和Mg2+浓度进行优化,确定RAPD的PCR反应体系Mg2+浓度为2.0mmol/LMgCl2,退火温度38℃;SSR反应体系Mg2+浓度为2.0mmol/L,退火温度56℃。建立了一套完善的适用于板栗的SSR和RAPD分析的稳定技术体系。     

两类生态型区苹果器官内源激素含量及生长发育的变化

采用酶联免疫法（ＥＬＩＳＡ）测定了南亚热带干热多日照河谷（Ｅ１）和北亚热带湿热少日照河谷（Ｅ２）两类生态型区的金冠苹果７种器官内源激素ＩＡＡ、ＧＡ、ＺＲ、ＡＢＡ含量和不同生长时期叶片各激素的含量变化。结果表明,Ｅ２型区苹果茎尖和叶片ＩＡＡ、ＧＡ、ＺＲ含量,幼叶和芽的ＧＡ含量以及伸长中的茎、幼叶、叶、根的ＺＲ含量均显著高于Ｅ１型区,而各器官ＡＢＡ含量则显著低于Ｅ１。两类生态型区苹果的生长结果状况也呈现相应的变化。     

核桃SSR反应体系的优化

以清香、香铃、爱米格为试材,利用CTAB法提取基因组DNA,将PCR体系的主要成分设定5个梯度,根据每个成分的变化引起的PCR-SSR的效果差异,探讨了核桃SSR技术中PCR体系的主要成分对扩增结果的影响,并对引物WGA321的适宜退火温度进行优化。最终确定了引物WGA321的最适退火温度为48～52℃,PCR反应体系的最佳条件为:15μL体系中,Mg2+1.0mmol/L,dNTPs浓度0.40mmol/L,TaqE用量为0.5U,DNA模板1.0ng/μL,引物浓度为0.4μmol/L。利用此反应体系对部分核桃品种进行PCR扩增并电泳检测,扩增结果清晰且有较高的多态性,表明该体系适合核桃的亲缘关系分析。