山羊生长分化因子9基因FecTT突变检测

本研究采用PCR-RFLP方法检测生长分化因子9(growth differentiation factor 9, GDF9)基因FecTT突变在济宁青山羊、贵州白山羊、大足黑山羊、陕南白山羊、古蔺马羊、马头山羊、波尔山羊、成都麻羊、萨能奶山羊、文登奶山羊、板角山羊、金堂黑山羊、关中奶山羊、川东白山羊、安哥拉山羊、辽宁绒山羊、内蒙古绒山羊等17个山羊品种中的分布。结果表明,在17个山羊品种中都未检测到FecTT突变,提示,GDF9基因影响Thoka绵羊高繁殖力的FecTT突变对以上17个山羊品种的繁殖力均没有显著影响。     

绵羊和山羊BMP15基因FecXR突变的检测

为了检测骨形态发生蛋白15(BMP15)基因在绵羊和山羊中的突变,本研究采用PCR-SSCP方法在高繁殖力绵羊品种(小尾寒羊和湖羊)、山羊品种(济宁青山羊和波尔山羊)和低繁殖力绵羊品种(多赛特和特克塞尔)、山羊品种(内蒙古绒山羊和安哥拉山羊)中检测BMP15基因FecXR突变,并对小尾寒羊和济宁青山羊扩增片段进行核苷酸和氨基酸序列分析.结果表明,这8个羊品种均没有发生与Rasa Aragonesa绵羊相同的FecXR突变;小尾寒羊核苷酸序列与GenBank中绵羊BMP15序列(AF236079,NM_001114767)完全一致,济宁青山羊与小尾寒羊相比存在3处碱基不同(T529G、C530G和T576C)和2个氨基酸差异(V155G和S171P).可见BMP15基因影响Ra-sa Aragonesa绵羊高繁殖力的突变FecXR对小尾寒羊、湖羊、济宁青山羊和波尔山羊的繁殖力均没有显著影响.     

山羊BMP15基因FecX-L突变的检测

采用PCR-SSCP方法在高繁殖力山羊品种（济宁青山羊、波尔山羊和文登奶山羊）和低繁殖力山羊品种（内蒙古绒山羊、安哥拉山羊和辽宁绒山羊）中检测骨形态发生蛋白15(bone morphogenetic protein 15,BMP15)基因的FecX-L突变,同时研究该基因突变对济宁青山羊高繁殖力的影响。结果表明这6个山羊品种都没有发生与Lacaune绵羊相同的FecX-L突变（C53Y）。可见BMP15基因中影响Lacaune 绵羊高繁殖力的突变位点对济宁青山羊的高繁殖力没有显著影响。     

绵羊GDF9基因mRNA、DNA和调控区序列克隆及其在11个品种中遗传多态性检测

本研究旨在克隆绵羊生长分化因子9(Growth differentiation factor 9,GDF9)基因mRNA、DNA和调控区全序列,并检测其在11个绵羊品种中的遗传多态性,探究GDF9基因与绵羊多羔性状的关系。首先应用RACE和PCR技术克隆GDF9基因全长序列,其次利用SNaPshot分型技术检测11个绵羊品种GDF9基因遗传多态性。结果显示,克隆获得GDF9基因mRNA全长1 852bp(GenBank序列号:KR063137),编码区两侧翼分别具有5′-UTR58bp(1~58nt)和3′-UTR 432bp(1 421~1 852nt)。进一步克隆获得长为2 898bp的DNA序列和2 304bp的调控区序列,分析发现调控区序列比数据库序列(NC_019462.1)多两个长片段。序列比对发现了已知突变G260A(G1)和调控区新突变-2078CG。分型结果显示,11个绵羊品种均不含FecGE、FecGH、FecGT、FecGF、FecGV突变,而G260A和-2078CG广泛存在于除草原型藏羊外的各绵羊品种中,G260A表现3种基因型(AA、BB和AB),首次在小尾寒羊和山谷型藏羊中检测到BB型突变纯合子。-2078CG也存在3种基因型,基因型结果表明该位点与G260A完全连锁。关联分析结果显示,小尾寒羊AB型产羔数显著高于AA型(P0.05)。本研究完善了绵羊GDF9mRNA、DNA和调控区全长序列,为进一步研究GDF9基因功能奠定了基础。同时在不同绵羊品种中发现了G260A和-2078CG突变,其中G260A作为潜在的有效遗传标记可用于提高绵羊的产羔数。     

济宁青山羊多羔性候选基因BMP15的研究

根据绵羊骨形态发生蛋白15（bone morphogenetic protein 15,BMP15）基因序列设计2对引物（P1和P2）,分别扩增随机选取的安哥拉山羊和济宁青山羊各5个个体的BMP15基因外显子1、2并克隆测序。测序结果与绵羊BMP15基因外显子1（AF236078）相比,山羊BMP15基因外显子1在第268-270位插入3个核苷酸CTT（268insCTT）,导致编码的氨基酸第12位插入亮氨酸（12insL）;山羊BMP15基因外显子2序列长度与绵羊（AF236079）一致,但存在7处核苷酸不同,引起4个氨基酸变化,济宁青山羊与安哥拉山羊相比在963位存在核苷酸变化（A963G）。依据A963G变异设计引物P3,利用PCR-SSCP方法检测BMP15基因外显子2在高繁殖力品种（济宁青山羊）、中等繁殖力品种（波尔山羊）和低繁殖力品种（安哥拉山羊和内蒙古绒山羊）中的单核苷酸多态性,分析该基因对济宁青山羊多羔性的影响。结果在济宁青山羊中检测到AA、AG和GG基因型,在波尔山羊中检测到AG和GG基因型,在安哥拉山羊和内蒙古绒山羊中仅检测到AA基因型;测序分析发现GG与AA基因型相比存在1个突变（A963G）,导致第300位的丝氨酸变为甘氨酸（S300G）;济宁青山羊AA、AG和GG基因型频率分别为0.008、0.059和0.933;高繁殖力山羊品种与中、低繁殖力山羊品种之间BMP15基因型分布存在显著（P〈0.05）和极显著（P〈0.001）差异;GG基因型济宁青山羊产羔数最小二乘均值比AG和AA基因型的分别多0.71只（P〈0.05）和1.57只（P〈0.05）,AG基因型比AA基因型的多0.86只（P〈0.05）。本研究结果初步显示BMP15基因可能是影响济宁青山羊多羔性的一个主效基因或是与之紧密连锁的一个标记。     

BMPR-IB、BMP15、GDF9基因作为福清山羊高繁殖力候选基因的研究

以控制部分绵、山羊品种高繁殖力的BMPR-IB、BMP15和GDF9基因为候选基因,采用PCR-RFLP方法分析福清山羊BMPR-IB、BMP15和GDF9基因多态性与繁殖性状的关系。结果表明:多胎品种福清山羊及南江黄羊在BMPR-IB基因的相应位置上并未发生与Booroola Merino羊相同的突变,同时也未检测到BMP15的FecXI、FecXH、FecXB基因及GDF9的FecGH基因,因此排除了这5个突变位点存在控制福清山羊高繁殖力主效基因的可能性。     

蒙古羊BMP15和GDF9基因多态性与其产羔性能相关研究

以控制Belclare 和Cambridge 绵羊高繁殖力的骨形态发生蛋白15 (bone morphogenetic protein 15 ,BMP15) 基因和生长分化因子9 (growth differentiation factor 9 , GDF9)基因为候选基因,采用PCR-SSCP 技术检测BMP15和GDF9 基因在蒙古羊中的单核苷酸多态性,同时研究这2个基因对蒙古羊繁殖力的影响.结果表明在蒙古羊品种中都没有检测到GDF9 基因的G8 突变(C →T) ,也没有检测到BMP15 基因的B4 突变(G →T),在所检测的116个蒙古羊个体中,BMP15 基因在B1位点均呈现多态性,具有++、+A和AA 3种基因型.测序分析表明:该段DNA序列中存在3个碱基的缺失,即编码区第28,29,30位碱基缺失,使其10号氨基酸残基亮氨酸(L)缺失,变成了突变基因型(AA),形成B1突变体;群体遗传学分析表明,B1突变在双羔系中的发生频率高于单羔系中发生的频率,χ2适合性检验结果表明两品系在该位点具有中度多态性并处于Hardy-Weinberg平衡状态(P>0.05);与产羔性能关系分析表明B1突变对蒙古羊产羔数无显著影响(P>0.05).     

BMPR-IB、BMP15、GDF9基因作为闽东山羊多胎性能候选基因的研究

以控制部分绵、山羊品种高繁殖力的BMPR-IB、BMP15和GDF9基因为候选基因,采用PCR-RFLP方法分析闽东山羊BMPR-IB,BMP15和GDF9基因多态性与繁殖性状的关系。研究发现：多胎品种闽东山羊及南江黄羊在BMPR-IB基因的相应位置上并未发生与Booroola Merino羊相同的突变,同时也未检测到BMP15的FecXI,FecXH,FecXB基因及GDF9的FecGH基因,因此排除了这5个突变位点影响闽东山羊高繁殖力性状的可能性。然而,由于闽东山羊的BMPR-IB、BMP15、GDF9的全基因序列信息的缺乏,尚不能完全断定3个基因对闽东山羊高繁殖力性状没有影响。     

云南黑山羊新品种和龙陵黄山羊高繁基因的研究

为了分析云南黑山羊新品种和龙陵黄山羊中骨形态发生蛋白受体IB(BMPR-IB)、骨形态发生蛋白15(BMP15)和生长分化因子9(GDF9)基因的多态性与产羔数的关系,采用PCR-SSCP与测序相结合的技术检测204个山羊样品的多态性,同时研究这3个基因对山羊繁殖力的影响。结果显示:龙陵黄山羊和云南黑山羊新品种中并未检测到FecB、FecX~I、FecX~H、FecX~L、FecX~G、FecX~B、FecG~H位点上的突变,碱基序列分析证实BMP15基因编码序列808位上C→G的突变,导致了氨基酸序列第270位由谷氨酰胺到谷氨酸的改变;云南黑山羊新品种和龙陵黄山羊在该位点都检测到了AA、AB和BB 3种基因型,基因频率分别为0.785/0.169/0.046和0.514/0.324/0.162,不同基因型的山羊产羔数最小二乘均值之间无显著差异(P0.05),表明BMPR-IB、BMP15和GDF9基因中8个突变位点对云南黑山羊新品种和龙陵黄山羊产羔数并无显著影响。     

奶牛性别鉴定的研究与应用

 以控制部分绵、山羊品种高繁殖力的BMPR IB、BMP15和GDF9基因为候选基因,采用PCR RFLP方法分析闽东山羊BMPR IB,BMP15 和GDF9 基因多态性与繁殖性状的关系。研究发现：多胎品种闽东山羊及南江黄羊在BMPR IB 基因的相应位置上并未发生与Booroola Merino 羊相同的突变,同时也未检测到BMP15 的FecXI, FecXH , FecXB基因及GDF9的FecGH 基因,因此排除了这5个突变位点影响闽东山羊高繁殖力性状的可能性。然而,由于闽东山羊的BMPR IB、BMP15、GDF9 的全基因序列信息的缺乏,尚不能完全断定3个基因对闽东山羊高繁殖力性状没有影响。     

绵羊BMP15基因外显子单核苷酸多态性研究

以控制Belclare和 Cambridge绵羊高繁殖力的骨形态发生蛋白15( Bone morphogenetic protein 15,BMP15)基因为候选基因,采用PCR-SSCP技术检测BMP15基因在中国部分绵羊品种 (蒙古羊、内蒙古细毛羊、呼伦贝尔羊、中国美利奴羊)中的单核苷酸多态性,同时研究突变位点对绵羊繁殖力的影响.结果表明:在4个绵羊品种中均检测到BMP15的突变,检测到的BMP15突变在4个绵羊品种中均呈现3种基因型.这表明BMP15基因外显子Ⅰ中虽然存在突变位点,但这一突变位点对绵羊繁殖力高低没有显著影响.     

ESR和PGR基因在5个山羊品种中的多态性分析

为了检测贵州白山羊、河北绒山羊、河南槐山羊、美姑黑山羊、承德黑山羊5个品种的单核苷酸多态性(SNPs),试验采用PCR-SSCP技术和DNA测序技术分析雌激素受体(ESR)、孕酮受体(PGR)基因外显子的多态性,并分析其山羊产羔率的关系。结果表明:ESR基因在这5个山羊品种中不存在多态位点,保守性高。PGR基因在146 bp处有C→G的突变,产生3种基因型,即AA基因型、AB基因型、BB基因型。贵州白山羊AA基因型比BB基因型多0.03只,AB基因型比AA基因型多0.49只;河北绒山羊AA基因型比AB基因型多0.07只,BB基因型只有1只产羔数为2.00只;河南槐山羊AB基因型比AA基因型多0.27只,但不同基因型对3个品种的产羔数影响没有达到显著水平。     

促黄体素β基因多态性及其与济宁青山羊产羔数的关系

为了解促黄体素β基因多态性与济宁青山羊产羔数的关系,采用PCR-SSCP技术检测促黄体素v亚基(Luteinizing hormone beta-subunit,LHβ)基因5'调控区和3个外显子在高繁殖力(济宁青山羊)、中等繁殖力(波尔山羊)和低繁殖力山羊品种(辽宁绒山羊和安哥拉山羊)中的单核苷酸多态性,同时研究该基因对济宁青山羊高繁殖力的影响.结果表明:山羊与绵羊的LHB基因核苷酸序列相似性为98%.6对引物中,仅引物P1和P5扩增片段存在多态性.对于P1扩增片段,在4个山羊品种中均检测到AA、AB和BB 3种基因型;测序分析发现BB与AA基因型相比在5'调控区存在2处突变202C→A和210C→T;济宁青山羊3种基因型之间产羔数差异均不显著(P>0.05).对于P5扩增片段,在济宁青山羊中检测到CC、CD和DD 3种基因型,辽宁绒山羊中检测到CC和CD2种基因型,波尔山羊和安哥拉山羊中都只检测到CC基因型;测序分析发现DD与CC基因型相比在外显子2存在单碱基突变1124C→T;济宁青山羊CC、CD和DD基因型频率分别为0.38、0.44和0.18;DD和CD基因型济宁青山羊平均产羔数分别比CC基因型的多0.99(P<0.01)和0.87只(P<0.01).济宁青山羊在P1、P5两个座位上都处于哈迪-温伯格平衡状态(P1座位:X2=1.66,P=0.437;P5座位:X2=1.22,P=0.544).     

贵州白山羊GDF9基因外显子2的多态性研究

生长分化因子9(GDF9)是卵母细胞分泌的生长因子,对早期卵泡的生长和分化起重要的调节作用。采用RFLP和SSCP方法检测贵州白山羊GDF9基因外显子2的单核苷酸多态性,结果表明:在所有检测样本中均未发现GDF9基因的FecGH突变;在高繁殖率(3羔以上/胎)母羊和公羊中检测到8个杂合的AB基因型,其中5个为高产的母羊,3个为公羊。碱基序列分析证实GDF9基因编码区第1189bp位点的碱基由G突变为A,该位点位于外显子2中,导致活性肽第79位缬氨酸突变为异亮氨酸(V79I),但在低繁殖率(1~2羔/胎)母羊中没有发现该突变。虽然贵州白山羊GDF9基因中G1189A突变的发生率仅为5%,但该位点编码的氨基酸与FecGH突变(S77F)仅相隔1个氨基酸,因此推测GDF9基因中的G1189A突变可能与贵州白山羊的高繁殖力有关。     

3个山羊品种角蛋白辅助蛋白7基因的遗传多态性分析

本研究采用PCR-SSCP方法对陕北白绒山羊、太行黑山羊及南疆绒山羊的角蛋白辅助蛋白(keratin-associated proteins,KAP)7基因进行遗传多态性研究。结果显示,KAP7基因在3个山羊品种中有多态性,有AA和AB 2种基因型,AA基因型均为其优势基因型。测序结果发现,KAP7基因在129 bp处存在C→G的突变,突变的位置位于5'调控区。     

哈萨克羊GDF9、ESR、BMPR-IB基因的PCR-RFLP多态性研究

为了探索绵羊多胎性的分子机理以及为绵羊繁殖力的标记辅助选择和育种提供理论依据,特开展了哈萨克羊品种多胎主效基因筛选和标记辅助育种研究。实验采用PCR-RFLP方法,对哈萨克羊GDF9、ESR、BMPR-IB基因进行PCR-RFLP多态性检测。结果表明:在哈萨克羊群体中GDF9、ESR、BMPR-IB基因的酶切位点上均未发现多态性,说明GDF9、ESR、BMPR-IB基因的酶切位点均不能作为控制哈萨克羊繁殖力的潜在分子标记位点。     

山羊抑制素-α第1外显子的PCR-SSCP分析

采用PCR-SSCP技术检测了抑制素α(inhibin-α,INHA)基因第1外显子在高繁殖力山羊品种(黄淮山羊和长江三角洲白山羊)以及低繁殖力品种(波尔山羊)中的单核苷酸多态性,并研究了该基因对黄淮山羊产羔数的影响.设计4对引物扩增山羊INHA基因外显子1序列,只有引物1在3个山羊品种中检测到多态性,出现了3种基因型(AA、AB、BB),测序结果表明,BB型和AA型相比在INHA基因第1外显子1 006 bp处都发生了碱基突变(C→A),导致脯氨酸改变为苏氨酸.黄淮山羊突变纯合型(BB)平均产羔数比野生型(AA)少0.65只(P＜0.05).研究结果初步表明:INHA基因可能是影响黄淮山羊繁殖力的一个主效基因或是与之存在紧密遗传连锁的一个分子标记.     

湖羊和川中黑山羊GDF9、BMPR-IB、GnRHR基因多态性及其与产羔数的关联分析

为了研究湖羊和川中黑山羊生长分化因子9(GDF9)基因、骨形态蛋白受体(BMPR-IB)基因和促性腺激素释放激素受体(GnRHR)基因多态性及其与产羔数之间的关系,试验以594只湖羊和333只川中黑山羊为研究对象,用PCR-RFLP技术分析了湖羊和川中黑山羊BMPR-IB、GnRHR、GDF9基因序列的多态性,并与产羔数进行关联分析。结果表明:在湖羊和川中黑山羊中均未检测到GDF9基因的G8突变,说明该突变在这两种羊中比较保守,不存在多态性;湖羊BMPR-IB基因存在FecB突变,表现出三种基因型(GG、GA、AA),等位基因G比等位基因A频率高,G为优势等位基因,基因型分布偏离了Hardy-Weinberg平衡,GG型平均产羔数分别比GA型和AA型多0.19,0.33只(P0.05);川中黑山羊GnRHR基因存在G698A突变,表现出三种基因型(GG、GA、AA),达到了Hardy-Weinberg平衡,不同基因型个体间的产羔数差异不显著(P0.05)。     

绵羊高繁殖力候选基因BMPR-IA的研究

以骨形态发生蛋白受体IA（bone morphogenetic protein receptor IA，BMPR-IA）基因为候选基因，采用PCR—SSCP技术检测该基因在高繁殖力绵羊品种（小尾寒羊、湖羊）以及低繁殖力绵羊品种（多赛特羊、特克塞尔羊、德国肉用美利奴羊）中的单核苷酸多态性，同时研究该基因对小尾寒羊高繁殖力的影响。结果表明：在小尾寒羊中检测到AA、AB两种基因型，在湖羊中只检测到一种基因型BB，而在低繁殖力的3个绵羊品种中只检测到一种基因型AA。统计结果表明：小尾寒羊A等位基因频率为0．964，B等位基因频率为0．036。测序结果表明：BB型与AA型相比有6处核苷酸发生了突变。独立性检验表明：外尾寒羊与低繁殖力绵羊品种间基因型分布差异不显著（P〉0．05），而湖羊与小尾寒羊、低繁殖力绵羊品种间基因型分布差异极显著（P〈0．001）。AB基因型小尾寒羊平均产羔数比AA基因型多0．15只，但差异不显著（P〉0．05）。研究表明：BMPR-IA基因不是小尾寒羊和湖羊高繁殖力的主效基因。     

6个绵羊群体BMP15、GDF9基因多态性分析

本研究旨在检测新吉细毛羊、中国美利奴羊(无角型)、东北细毛羊、杜×寒杂交羊(F1)、杜×寒杂交羊(F3)、白头杜泊羊6个绵羊群体骨形态发生蛋白15(bone morphogenetic protein 15,BMP15)、生长分化因子9(growth differentiation factor 9,GDF9)基因的多态性,为绵羊繁殖力的标记辅助选择和育种提供理论依据。以6个绵羊群体共378只个体为研究对象,利用PCR-SSCP技术检测BMP15、GDF9基因多态性;用DNAStar软件与I-TASSER软件预测蛋白质二级结构和三级结构;计算基因频率、基因型频率、Hardy-Weinberg平衡、杂合度(He)、纯合度(Ho)、有效等位基因数(Ne)和多态信息含量(PIC)。运用GraphPad Prism 6软件对新吉细毛羊群体BMP15基因多态性与产羔数进行相关性分析。结果显示,BMP15基因P1引物扩增片段存在多态性,6个群体共呈现3种基因型:AA、AC、CC,该突变为BMP15基因外显子1上58-60bp 3个碱基(CTT)缺失,新吉细毛羊、杜×寒杂交羊(F3)、白头杜泊羊的χ~2值均达到显著水平,处于Hardy-Weinberg不平衡状态,不同基因型间新吉细毛羊平均产羔数差异均不显著(P0.05);GDF9基因P2引物扩增片段存在多态性,6个群体共呈现3种基因型:DD、DE、EE,其中新吉细毛羊仅有1种基因型:DD,该突变为GDF9基因外显子2上477bp处T→C的转换,该突变未导致氨基酸的改变,除新吉细毛羊外其余5个群体χ~2值均未达到显著水平,处于Hardy-Weinberg平衡状态,说明GDF9基因T477C突变不能作为新吉细毛羊多胎性状遗传标记位点。