用间接免疫荧光检测方法评价猪瘟兔化弱毒活疫苗效力的研究

为用体外试验方法评价猪瘟兔化弱毒活疫苗效力,以猪瘟病毒抗体（兔源）为一抗、荧光素标记羊抗兔IgG 为二抗,建立了CSFV兔化弱毒株的间接免疫荧光检测方法（ IFA）。特异性试验表明,用该IFA方法检测CSFV兔化弱毒株接种的RK细胞为阳性,而检测伪狂犬病毒、猪细小病毒病、牛病毒性腹泻/粘膜病毒接种的RK细胞均为阴性。 CSFV兔化弱毒株和活疫苗的兔体感染量（ RID）用兔体测定,半数组织感染量（ TCID50）用IFA测定,拟合RID与TCID50的线性回归方程,确定1RID/mL＝（ TCID50/0．1mL＋200）/12。     

IFA和IPMA方法测定猪瘟兔化弱毒病毒含量

本研究使用间接免疫荧光方法(IFA)和过氧化物酶单层试验(IPMA)测定猪瘟兔化弱毒的组织半数感染量(TCID50)。优化了两种方法的一抗使用浓度;筛选了IPMA方法中敏感、易辨识的酶作用底物。优化后的IFA和IPMA方法测定猪瘟兔化弱毒疫苗半成品和成品的TCID50,可以作为兔体感染量(RID)和猪体半数保护量(PD50)效力检验标准的补充,应用到猪瘟兔化弱毒活疫苗生产中,加强质检、质控力度。     

猪瘟活疫苗效力检验替代方法的研究

目前,我国猪瘟活疫苗效力检验最常用的方法是测定猪瘟疫苗中病毒的兔体感染量(RID),但是用该方法易受到检验兔品种、个体和饲养环境的影响。为了探索一种不依赖动物的疫苗效力检验新方法,本研究将待检猪瘟活疫苗系列稀释后分别接种易感细胞,使用抗原捕获ELISA、RT-nest PCR和RT-PCR三种方法检测不同稀释度疫苗中活病毒在感染细胞后增殖的子代病毒,计算疫苗病毒的最高细胞感染剂量,建立了猪瘟疫苗病毒的细胞感染量(CID)的效力检验方法。结果显示:疫苗中活病毒粒子越多,CID就越高;对不同类型猪瘟疫苗的检测结果表明,该方法适用于传代细胞源和细胞源猪瘟活疫苗的效力效检。使用CID和RID两种检测方法同时对12批猪睾丸传代细胞源(传代细胞源)和3批牛睾丸原代细胞源(细胞源)猪瘟活疫苗进行了比对效检,结果表明,用CID测定方法检验,12批猪瘟活疫苗(传代细胞源)每头份均含105CID,3批猪瘟活疫苗(细胞源)每头份含量均为104CID;用兔子感染体温测定法,12批猪瘟活疫苗(传代细胞源)每头份含量在2.6×104~3.0×104RID之间,3批猪瘟活疫苗(细胞源)每头份含7.0×103~8.0×103RID。试验证明:本实验室建立的CID检测结果与现有质量标准RID的结果存在良好的相关性,能够较好反映疫苗中活病毒的含量,有望成为RID的替代方法。     

用PPA-ELISA测HCLV抗体和抑制法测HCLV

对早期建立的PPA-ELISA测猪瘟兔化弱毒(HCLV)抗体和PPA-ELISA抑制法测HCLV毒价的2种方法作总结性回顾。前者用于猪瘟的免疫监测,以抗体的分布曲线显示HCLV的免疫效果,出现低谷为免疫力不足,出现特异高峰则可能有强毒侵入;如群体保护率小于50%,表明免疫失败。后者主要用于细胞培养液小样的HCLV毒价测定,方法简单,一次能测多个样品。检测结果表明,在现用的疫苗中抑制价高的,完全有可能用16万或20万倍稀释通过兔体测毒。对此,建议将兔体半数反应量(RID50)标准提高至16万或20万倍稀释,一次通过,免疫剂量用400RID50,与国际接轨,达到早日消灭猪瘟的目标。     

应用定量RT-PCR对猪瘟兔化弱毒疫苗的质量评价研究

为进一步验证猪瘟兔化弱毒(HCLV)疫苗荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)与兔体定型热试验之间存在正相关性,本研究利用qRT-PCR方法对278批次HCLV疫苗进行检测,分别检测其疫苗含量及牛病毒性腹泻病毒(BVDV)污染情况。结果表明,278批次猪瘟疫苗中有66批(24%)疫苗含量达不到规程标准,有42批(15%)疫苗存在BVDV污染;从所检疫苗中抽取6份qRT-PCR检测HCLV含量较低的疫苗,采用兔体定型热试验进行验证,两种方法结果吻合,表明qRT-PCR方法可以作为评价猪瘟疫苗质量的一种备选方法。     

用微量细胞培养ELISA测定HCLV TCID_(50)

应用猪瘟兔化弱毒制备的猪瘟兔化疫苗常因为剂量不足而引起免疫失败。究其原因主要是因为兔检(RID)合格的猪瘟兔化苗批间差异较大,质量不稳定。为此建立微量细胞培养ELISA用以测定HCLV TCID50,并获得成功,可以替代RID测毒。     

猪瘟兔化弱毒疫苗株TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立及初步应用

为建立一种快速鉴定猪瘟兔化弱毒疫苗株(HCLV)的方法,本研究根据GenBank中登录的HCLV株基因组序列,在Erns基因序列区内设计一对引物和一条TaqMan探针,建立了检测HCLV的荧光定量RT-PCR(FQRT-PCR)方法。该方法检测的灵敏度可达3.84拷贝/μL;而对猪细小病毒、猪伪狂犬病毒、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒、牛病毒性腹泻病毒基因组扩增结果均为阴性。实验组批内变异系数为1.05%～1.84%,批间变异系数为3.70%～5.43%。通过对32批HCLV半成品抗原和9批成品疫苗,分别用经典的兔检法测定兔体感染量(RID)和新建立的FQRT-PCR方法进行检测比较,两者有较好的相关性。结果表明,该方法具有快速、敏感、特异性强、稳定性好等优点,对HCLV生产配制及成品检验具有指导作用。     

利用荧光定量RT-PCR法与间接免疫荧光法比较测定猪瘟兔化弱毒病毒含量

利用荧光定量RT-PCR技术与间接免疫荧光技术(IFA)对12份猪瘟兔化弱毒(ST细胞毒)病毒含量与毒价进行了测定,并与兔体反应热法测定结果进行了比较分析。结果显示:12份猪瘟兔化弱毒(ST细胞毒)可根据兔体感染量分为4组,各组间荧光定量RT-PCR法与IFA法测得的病毒含量间差异极显著(P<0.01);3种方法的检测结果间呈显著正相关性(γ>0.9)。研究结果提示:可用荧光定量RT-PCR技术结合IFA替代传统的兔体反应热法,高通量、快速、准确地测定猪瘟兔化弱毒病毒含量,其有助于简化疫苗检验工作并提高准确度。     

荧光定量RT-PCR方法与兔体定型热试验对于检测猪瘟兔化弱毒疫苗的平行关系

为探讨荧光定量RT-PCR技术与传统兔体定型热试验对于检测猪瘟兔化弱毒疫苗的平行关系,本研究采用荧光定量RT-PCR方法与兔体定型热试验对5份猪瘟兔化弱毒细胞苗成品和6份半成品样品进行平行检测.结果表明,两种检测方法存在正相关性,最低105个病毒拷贝可以使家兔产生定型热反应,最低103个病毒拷贝可以使家兔产生轻热反应.荧光定量RT-PCR检测方法的检测过程仅需3.5h,大大缩短了猪瘟疫苗的检测时间,该方法可以补充传统的兔体定型热反应用于猪瘟兔化弱毒疫苗半成品与成品的检验.     

猪瘟强化免疫措施

<正>1技术措施1.1疫苗选用可选用质量好,不易被外源病毒污染的猪瘟活疫苗(传代细胞源),即猪瘟ST苗进行免疫。该苗采用了进口克隆同源细胞,避免了使用和培养异源细胞(如牛睾丸细胞)易被外源病毒污染的缺陷。该疫苗病毒滴度高,可达牛睾丸细胞苗的10倍以上,成品苗RID(即疫苗感染量或反应量)可达15000个以上,由于RID含量高,可控制猪瘟亚临床感染,故该苗对体内有一定母源抗体和免疫抗体的猪的免疫效果也较