雁鹅遗传多样性的ISSR研究*

本试验以来自安徽省郎溪县雁鹅原种鹅场的雁鹅为研究材料,应用ISSR技术对雁鹅种群的遗传多样性进行研究。筛选出43个ISSR引物,对94个供试样本进行了扩增,共扩增出216个位点,每条引物扩增出的谱带数在2~7之间,平均为5.0条;多态条带比率在16.67~100%之间,平均为65.60%,材料间遗传距离为0.2～0.45。用不加权算术平均组对法（UPGMA）对94个个体间的关系进行聚类分析,构建了雁鹅种群的遗传系谱图。     

毛薯ISSR-PCR反应体系的建立

本研究主要建立毛薯ISSR-PCR的最佳反应体系。研究采用改良CTAB法提取毛薯总基因组DNA,应用单因子实验法设定模板DNA,Mg2＋浓度,dNTP浓度,Tap酶浓度以及退火温度的5个不同梯度,探讨单因素变化对毛薯ISSR-PCR扩增的影响。实验结果表明,毛薯ISSR-PCR最佳反应体系为：总体积20μL,模板DNA为50ng、Taq酶为0.8U、Mg2＋浓度为2.0mmol/L、引物浓度为0.5μmol/L、dNTPs浓度为0.5mmol/L。     

利用正交设计优化黄菠萝ISSR-PCR反应系统

利用正交设计L16（45）对黄菠萝ISSR-PCR反应体系的5因素在4个水平上进行优化试验,PCR结果用SPSS分析：1各因素的不同水平对PCR反应结果又显著影响,2筛选出各因素的最佳水平,建立了黄菠萝ISSR-PCR反应的最佳体系（20ul）为：Taq酶1.5U,Mg2＋2.0mmol/L,DNA40ng,dN TP0.15mmol/L,引物0.3μmol/L。     

栝楼ISSR－PCR反应体系的建立和优化

用改良SDS法提取栝楼（Trichosanthes kirilowii Maxim）叶片DNA为模板,通过单因素试验研究模板、引物、Tat／DNA聚合酶和dNTPs等4因素各7个水平对栝楼ISSR-PCR扩增结果的影响,并通过正交试验对各因子的浓度进行优化,首次建立了栝楼ISSR-PCR分析的最适反应体系：20μL的反应体系中,1×buffer,模板含量为50ng,引物的浓度为0．5μmol／L,TaqDNA聚合酶的用量为0．8U,dNTPs的浓度为200μmol／L。随机选取10条引物验证体系稳定性,并对190条ISSR引物初筛,得到条带清晰、多态性好的引物126条。经验证,本实验所建立的栝楼ISSR-PCR反应体系具有稳定可靠、可重复性好、多态性较强等特点,能够较好的应用于栝楼的ISSR分子生物学分析。     

雁鹅遗传多样性的ISSR分析

以安徽省郎溪县雁鹅原种鹅场的雁鹅(Anser)为研究材料,应用ISSR技术对种群的遗传多样性进行研究.筛选出43个ISSR引物,对94个供试样本进行了扩增,共扩增出216个位点,每条引物扩增出的谱带数在2～7之间,平均为5.0条;多态谱带比率在16.67%～100%之间,平均为65.60%,材料间遗传距离为0.2～0.45.用不加权算术平均组对法(UPGMA)构建了雁鹅种群的遗传系谱,结果94个个体可分为3大类群,第1类群由1个个体组成,第2类群由6个个体组成,第3类群由87个个体组成.     

油茶SRAP-PCR反应体系的建立和优化

为了建立油茶SRAP-PCR扩增体系,本研究使用单因素试验设计,对反应体系的Taq酶、Mg2＋、模板DNA、dNTP和引物浓度5个主要影响因子各设10个不同的水平梯度,筛选出适宜的因子范围;在此基础上,进一步采用L16（45）正交设计,对影响油茶SRAP-PCR反应体系的5个因素在4水平上进行优化,建立了油茶SRAP-PCR最佳反应体系,即25μL体积中包含模板DNA30ng,Mg2＋2.8mmol/L,引物0.44μmol/L,dNTP0.2mmol/L和Taq酶1.0U。该SRAP-PCR体系的建立为油茶种质资源遗传多样性分析、品种鉴定及指纹图谱构建等研究提供了一个标准化的程序。     

利用正交设计优化黄菠萝ISSR-PCR反应系统

利用正交设计L16(45)对黄菠萝ISSR-PCR反应体系的5因素在4个水平上进行优化试验,PCR结果用SPSS分析:1各因素的不同水平对PCR反应结果又显著影响,2筛选出各因素的最佳水平,建立了黄菠萝ISSR-PCR反应的最佳体系(20ul)为:Taq酶1.5U,Mg2+2.0mmol/L,DNA40ng,dN TP0.15mmol/L,引物0.3μmol/L。     

药用菊花SRAP-PCR反应体系的优化

基于方差分析方法,利用正交试验从Taq酶、Mg2+、dNTP、引物和模板DNA等5因素4水平对药用菊花反应体系进行优化。结果标明：药用菊花SRAP-PCR的最佳反应体系为：在20μL的反应体系中,模板DNA 60ng,Taq酶1.00U,Mg2+ 2.00mmol•L-1,dNTP 0.20mmol•L-1,引物0.40μmol•L-1。Taq酶、Mg2+、dNTP和引物对SRAP反应结果有显著影响。所建立的药用菊花SRAP反应体系具有标记位点清晰、反应系统稳定、检测多态性能力较强、重复性好等特点,可用于药用菊花的遗传多样性研究。     

杨树ISSR反应体系的建立及正交设计优化

采用正交设计的方法,对杨树ISSR-PCR反应中5个因素(Taq酶、Mg2+、模板DNA、dNTP和引物)在4个水平上进行优化试验。建立了适合杨树的既稳定又能扩出最多数量谱带的ISSR-PCR最佳反应体系,即25μl的反应体系中含有1×buffer,0.12mmol/L dNTP,0.4μmol/L引物,3.5 mmol/L Mg2+,1.5UTaqDNA聚合酶和40ng模板DNA。对杨树ISSR-PCR最佳反应体系的退火温度进行梯度试验,发现引物W95142的最适退火温度为56.1℃,且最适退火温度因引物而异。这一优化的ISSR-PCR反应体系的建立为今后利用ISSR技术进行杨树种质资源分类、遗传图谱构建和基因定位奠定了技术基础。     

唐古特大黄SRAP反应体系优化及引物筛选

SRAP-PCR反应体系的优化是SRAP分子标记的基础,为建立高效稳定的唐古特大黄SRAP反应体系,进一步对唐古特大黄进行遗传多样性、种质资源分析,本研究在单因素试验基础上,对唐古特大黄SRAP-PCR反应体系主要影响因素Mg~(2+)、d NTPs、引物、Taq酶进行正交试验L9(34)。结果表明,唐古特大黄最佳SRAP-PCR反应体系为:Mg~(2+)0.5 mmol·L~(-1),d NTPs 0.4 mmol·L~(-1),引物0.2μmol·L~(-1),Taq聚合酶0.06 U·μL~(-1),总体积25μL。利用最优体系进行引物筛选,从58对SRAP引物中获得了30对条带清晰、多态性好的引物对组合。SRAP-PCR优化反应体系的建立为利用SRAP技术进行唐古特大黄种质资源分析、遗传多样性研究等奠定了基础。     

茄子基因组DNA提取及ISSR-PCR反应体系优化

在易金鑫等(2004)的研究基础上,对常规CTAB提取方法进行改良。不同植物类群ISSR的最佳反应条件有所差别,如模板DNA浓度、Mg2 用量、dNTP浓度、退火温度等。对于     

魔芋DNA快速微量提取及其ISSR-PCR扩增

魔芋属天南星科魔芋属草本植物,其组织富含多糖和多酚等次生物质,这类物质的存在不仅使DNA提取变得困难,还会影响下游的分子生物学操作。采用改进的提取方法,主要包括在2mL Eppendorf离心管中液氮研磨,CTAB-SDS裂解细胞,β-巯基乙醇浓度从2％提高到5％和添加PVP抑制多酚氧化,缓冲液去多糖等步骤,成功的提取了魔芋鲜叶的高质量DNA,其A260／A280位于1．80-2．00之间,产率超过470μg／g,ISSR0PCR扩增效果好。该方法具有快速、低廉、微量、稳定等特点,为深入研究魔芋资源遗传多样性、标记辅助育种和种芋纯度的鉴定奠定了基础。     

荔枝SRAP—PCR反应体系的优化

SRAP（sequence-related amplified polymorphism）是基于基因的内含子和外显子区域进行检测的新型分子标记技术,具有多态性高、重复性好、易测序、便于克隆目标片段等特点,在荔枝（Litchi chinensis Sonn）中还没有相关的研究报道。为了建立适合荔枝的SRAP反应体系,对反应体系中的DNA模板、Mg^2＋、dNTP、引物、砌DNA聚合酶诸因子的用量进行了探索,确立了适合荔枝的SRAP反应体系为：在20μL反应体系中,模板DNA为40ng,Mg^2＋浓度2．5mmol／L,dNTP0．3mmol／L,引物5mmol／L,TaqDNA聚合酶1．0U。扩增程序为：94℃预变性3min,反应前5个循环在94℃1min、35℃1min、72℃1 min的条件下运行;随后的35个循环退火温度提高到50℃;最后72℃延伸10min。利用该反应体系对荔枝10个不同品系进行SRAP反应,用5％的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,结果显示：不同品系间DNA谱带多态性丰富。证实该体系稳定可靠,可以用于荔枝的分子标记研究。     

梨SRAP-PCR反应体系的建立与优化

SRAP标记是一种对ORFs进行扩增的新的分子标记技术，其具有方法简便、稳定，产率中等，不需预知物种的序列信息等特点，近年来在连锁标记的寻找与基因定位，种质鉴定，生物多样性研究，遗传图谱构建及比较基因组学等研究领域得到了应用。本研究开展了SRAP标记技术在梨树上应用的探讨，以3个不同梨品种为试验材料，对影响SRAP-PCR反应体系的Mg２＋、dNTP、引物浓度、Taq酶等因子设置梯度实验，筛选和建立可扩增多态性高、重复性好、带型清晰的最佳反应条件。结果表明：在20μL反应体系中，模板DNA30ng，MgCl2 2.0mmol/L，dNTP 200μmol/L，正、反向引物各0.2μmol/L，DNA聚合酶1U。     

落羽杉属树木基因组总DNA的提取及SRAP反应体系的优化

本文针对落羽杉属植物组织中多糖、多酚等次生物质含量高的特点,对其基因组DNA提取方法进行研究,比较了SDS法、CTAB法提取落羽杉属植物基因组DNA的效果,结果表明：CTAB法提取效果较佳。在此基础上,利用正交设计法,对SRAP反应体系中的各个主要影响因子Mg^2＋．dNTP、引物、TaqDNA聚合酶进行了优化筛选,确立了适合落羽杉属植物SRAP-PCR反应的最佳体系,即10μL体系中含有1μL 10×PCR bufier,Mg^2＋2．0mmol／L,dNTP100μmol／L,引物0-3μmol／L,彻DNA聚合酶0．5U和50ng模板DNA。利用该优化体系,通过48对SRAP引物组合对2个落羽杉属植物（落羽杉和墨杉）及4个杂交后代进行SRAP扩增,结果发现,SRAP引物及优化后的反应体系能够有效地用于落羽杉属植物种质资源鉴定及遗传多样性分析等研究。     

东兴金花茶SSR-PCR反应体系的优化及引物筛选

采用L16（45）正交设计试验对东兴金花茶SSR-PCR反应的五因素（Mg^2＋,dNTPs,引物,Taq酶和模板DNA浓度）四水平进行了优化试验,然后利用优化后的反应体系,将31对同属植物SSR引物（4对茶树,7对山茶和20对金花茶引物）运用于东兴金花茶材料上,筛选适宜东兴金花茶遗传分析的SSR引物。结果表明,东兴金花茶最佳反应体系（15μL）及扩增条件为：Mg^2＋1.50 mmol/L、dNTP 0.30 mmol/L、引物0.40μmol/L、Taq酶0.75 U、模板DNA 40.00 ng;最佳扩增程序为：94℃预变性5 min;94℃变性30 s,58℃退火30 s（因引物而异,该温度为引物CN10的退火温度）,72℃延伸40 s,共36个循环;72℃最后延伸10 min。山茶属的不同植物之间可以共享部分SSR引物信息,东兴金花茶获得了9对能扩增出条带清晰且具有多态性的引物,引物最适退货温度为54-60℃,观测杂合度（HO）和期望杂合度（HE）分别为0.433-1.000和0.391-0.932。本试验为下一步进行的东兴金花茶遗传多样性分析、遗传图谱的构建等研究奠定了基础。