产志贺毒素大肠杆菌流行病学及主要毒力因子研究进展

产志贺毒素大肠杆菌(Shiga toxin-producing Escherichia coli,STEC) 是一类能引起包括水样腹泻、出血性结肠炎、尿毒综合症等一系列人体疾病的人畜共患肠道致病菌,其感染在世界范围内包括中国都有过暴发流行。文章阐述了STEC O157血清型和非O157血清型的分布特征及流行趋势,同时还对该病的主要毒力因子进行了综述,以期为该病的防控提供科学依据。     

某定点肉牛屠宰场中非O157致病性STEC的分离鉴定

为了了解新疆伊犁地区肉牛屠宰过程中大肠杆菌的污染情况,检测非O157致病性产志贺毒素大肠杆菌（Shiga toxin-producing Escherichia coli,STEC）的感染情况,本试验采集新疆伊犁地区某定点肉牛屠宰场中屠宰肉牛的粪样和屠宰后的胴体表面拭子,并对样品进行了大肠杆菌的分离鉴定、毒力基因（eae、stx1、stx2）的PCR检测、O157鉴定（rfbE）、ERIC-PCR基因分型和小鼠致病性试验。结果显示,在采集的45份样品中分离鉴定出42株大肠杆菌,分离率为93.3%。其中2株菌株同时编码了毒力基因stx1和stx2,检出率为4.8%,毒力基因eae未被检出。PCR鉴定均为非O157 STEC。ERIC-PCR基因分型检测发现,2株菌的基因型非常相似,同源关系密切。对小鼠进行腹腔注射攻毒,攻菌6 h后,小鼠开始出现死亡,立即解剖死亡小鼠发现,其肠道出血,肝脏、脾脏、肾脏明显出血肿大,解剖对照小鼠表现正常,表明菌株具有一定的致病性。综上所述,在肉牛屠宰过程中存在大肠杆菌污染,其中粪便中非O157 STEC菌株对胴体造成了污染,需要加强控制肉牛的屠宰加工关键环节的环境卫生。     

聚合酶链反应扩增大肠杆菌志贺样毒素基因

两对寡核苷酸引物通过聚合酶链反应扩增大肠杆菌志贺样毒素Ｉ（ＳＬＴ Ｉ）和志贺样毒素Ⅱ（ＳＬＴⅡ）基因,在单一反应中,两对引物分别扩增出１３０ｂｐ（ＳＬＴⅠ）和３４６ｂｐ（ＳＬＴ Ⅱ）的ＤＮＡ 片段,扩增片段经地高辛标记寡核苷酸探针Ｓｏｕｔｈｅｒｎ 印迹杂交分析,证实为ＳＬＴ Ⅰ和ＳＬＴ Ⅱ基因产物。同一扩增反应中应用ＳＬＴⅠ和ＳＬＴⅡ复合引物进行扩增,不同基因型志贺样毒素大肠杆菌从样品中鉴定出。８６９份牛、猪腹泻粪样ＤＮＡ 样品通过ＰＣＲ进行了测定,其中,３％ 检出志贺样毒素大肠杆菌,与牛出血性腹泻、猪水肿病有关。     

新疆牛源产志贺毒素大肠杆菌耐药性及其ESBLs基因鉴定

本研究的目的是通过调查新疆地区分离的牛源产志贺毒素大肠杆菌(STEC)的耐药表型和基因型,掌握STEC耐药性的发展和传播规律。本研究对新疆6个地区的牛源(非O157:H7)STEC分离株进行了18种抗生素的药物敏感性试验,并检测菌株中携带的超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)基因。结果显示:4.31%STEC表现为多重耐药,1.91%为产ESBLs菌株。检测到的主要ESBLs基因包括bla_TEM和bla_CTX-M。这是首次在新疆STEC中检测到bla_TEM和bla_CTX-M。本研究分离出的多数多重耐药STEC属于系统发育A群。多重耐药STEC可能是由非致病性大肠杆菌获得毒性和耐药基因而形成的。抗生素的选择压力可能对细菌在牛肠道中的定植表现出一定竞争优势,从而增加了耐药STEC对食物的污染。     

川西北牦牛肉中产志贺毒素大肠杆菌的分离鉴定及stx2基因的序列分析

为了解中国川西北牦牛肉中产志贺毒素大肠杆菌(STEC)的携带情况及stx2的亚型和特征,试验将采集的204份川西北牦牛肉样品(各25g)增菌培养后,每份挑取5个可疑菌落,采用stx1、stx2双重PCR方法检测STEC,对分离株中的stx2分型并克隆测定stx2编码区序列。结果显示,在204份样品中分离出8株STEC,平均分离率为3.9%(8/204);存在4个不同的O血清型,分别为O38(4)、O50(1)、O74(2)、O150(1);在6株含有stx2的菌株中,其中有2株为stx2a型、4株为stx2c型。结果表明牦牛源分离株氨基酸序列与人源和牛源菌株同源性较高;由stx2A、B亚基的氨基酸序列系统进化树可知,牦牛源分离株与人源、牛源菌株聚为一支,表明它们之间遗传距离相对较近,牦牛源stx2各自分布在自己的小分支中,表明牦牛源STEC stx2与人源和牛源stx2相比,尽管亲缘关系较近,但仍存在一定程度的差异。     

牛源产志贺毒素大肠杆菌分离株的毒力基因分布和遗传进化分析

为了探讨牛源产志贺毒素大肠杆菌（Shiga toxin-producing Escherichia coli,STEC）分离株在毒力基因分布和遗传进化方面与人源EHEC O157菌株之间的关系,本试验选择收集来自江苏某奶牛场的STEC菌株18株以及人源、羊源、猪源、禽源STEC参考菌株9株,参照美国疾病预防控制中心PulseNet推荐的方法,运用XbaⅠ酶进行酶切并完成脉冲肠凝胶电泳（PFGE）分型和聚类分析;同时对部分STEC菌株进行毒力基因检测。结果表明,经毒力基因检测,不同来源的O157菌株毒力基因分布不尽相同,其中牛源STEC O157与参考株EHEC O157∶H7（EDL933W）的基因排谱最为相近;牛源STEC O18和O26的基因排谱与参考株EHEC O157∶H7（EDL933W）类似,但存在部分基因的缺失。对27株不同来源的STEC分离株进行PFGE,产生了22种不同的酶切图谱。总体来看,不同来源的STEC Dice相似性系数在72%~100%之间。牛源O157分离株与猪源及禽源O157菌株的相似度偏低,而与两株人源O157分离株的相似度偏高,Dice相似性系数在83%~95%之间,牛源O26（克隆群Ⅶ、Ⅷ）与人源O157的相似性系数 > 82%。显然,从牛群中分离到的部分STEC菌株与人源EHEC O157具有较近的遗传进化关系。     

产志贺毒素大肠杆菌志贺毒素Ⅰ型双抗体夹心ELISA检测方法的建立

为建立双抗体夹心ELISA法检测产志贺毒素大肠杆菌(STEC)Ⅰ型志贺毒素(Stx1),利用重组Ⅰ型志贺毒素A亚单位(Stx1A)免疫小鼠,制备单克隆抗体,从中筛选出非竞争性的2株单抗,构建双抗体夹心法ELISA检测方法,并对试验样品中的志贺毒素进行检测。结果显示:共获得4株针对Stx1A的单克隆抗体,分别为1H2-G7、2H1-C12、8E7-E6和2F6-F8。当8E7-E6作为包被抗体,而2F6-F8作为检测抗体时,其检测毒素的OD值最高。对样品中的Stx进行检测,表明该方法只有效识别Stx1,对Stx2不识别。结论:成功建立了用于检测Stx1的双抗体夹心ELISA法,为临床上快速诊断STEC感染奠定了基础。     

牛源产志贺毒素大肠杆菌血清型及耐药性分析

为了调查青岛地区牛源产志贺毒素大肠杆菌(STEC)的流行情况和耐药情况,本试验对保存的780株牛源大肠杆菌进行PCR鉴定、血清分型以及药敏试验,经测序确认共检出27株STEC,随后对检出的STEC进行了30种血清型的鉴定,鉴定出14株共9种血清型,占定型菌株的51.9%,其中以O78、O2、O45血清型为主且O78占定型菌株的14.8%,为优势血清型。药敏试验结果显示,27株STEC对四环素、氨苄西林的耐药率分别为88.9%和81.5%;对氟苯尼考、磷霉素、恩诺沙星、萘啶酸、头孢噻呋、链霉素、甲氧苄啶-磺胺甲噁唑的耐药率介于11.1%～59.3%;对卡那霉素具有较高敏感性,耐药率仅为7.4%;所有受试菌株均对阿米卡星、环丙沙星和左氧氟沙星敏感。本试验结果对青岛地区牛源STEC的治疗提供理论依据。     

大肠杆菌O157和其它产志贺毒素大肠杆菌的毒力因子——粘附素

大肠杆菌O157的致病性已引起全世界公众和微生物学家的关注，而O157的致病因子有很多，本文就大肠杆菌O157可能的粘附素：菌毛、OMP及紧密素在致病中的作用进行综合评价，并对这些因子在其它产志贺毒素大肠杆菌中的出现率及与致病的关系进行分析，以期对大肠杆菌O157的致病机理有一个比较清楚的认识，推动我国对大肠杆菌O157的研究，以填补我国在这方面的相对空白。     

五重PCR检测大肠杆菌O157∶H7菌体抗原和毒素基因

针对 O1 5 7∶H7大肠杆菌 O抗原抗血清同多种细菌有交叉反应 ,而单一毒素基因并不是 O1 5 7∶ H7所独有这一特点 ,建立了五重和四重 PCR方法 ,同时检测大肠杆菌 O1 5 7∶ H7的 O抗原、H抗原和 4种毒素基因 ,可在较短的时间内检测、鉴定大肠杆菌 O1 5 7∶ H7,并有较高的特异性 ,解决了传统细菌检测方法耗时长、灵敏度低 ,并有交叉反应等问题     

新疆部分地区牛羊源产志贺毒素大肠埃希菌菌株检测与分析

产志贺毒素大肠埃希菌（Shiga toxin-producing Escherichia coli,STEC）是一类携带了前噬菌体编码的一种或两种志贺毒素基因的新发高致病性食源性病原菌,已成为威胁人类健康的重要公共卫生问题。为了解新疆部分地区牛、羊源各个环节产志贺毒素大肠埃希菌的感染情况及其遗传多样性,以及分离株对17种常见抗生素的敏感性,笔者采用PCR方法对STEC分离株进行了4种毒力基因（stx1、stx2、eae、hlyA）的检测和ERIC-PCR基因分型研究。结果表明：从屠宰场、养殖场和市场共431份样品中分离出产志贺毒素的大肠埃希菌64株,其中,编码stx1+stx2的STEC有31株（48.4%）,只编码stx1的STEC有29株（45.3%）,只编码stx2的STEC有4株（6.3%）,4种毒力基因同时存在的有1株。药物敏感性检测发现STEC菌株对麦迪霉素（61%）、头孢噻吩（4.7%）、头孢西丁（4.7%）、氨苄西林（3.1%）、哌拉西林（1.6%）、妥布霉素（1.6%）、头孢唑啉（1.6%）等7种抗生素存在耐药。ERIC-PCR检测结果呈多态性分布,分为A（36株）和B（28株）两个簇。STEC菌株在新疆部分地区牛、羊源各个环节被检出,其中一些菌株可能会增加对食物的污染,从而引起人发病。     

Detection and Analysis of Shiga Toxin-producing Escherichia coli Isolates from Cattle and Sheep Sources in Some Regions of Xinjiang,China

Shiga toxin-producing Escherichia coli(STEC) is a new class of highly pathogenic food-borne pathogens carrying a prephage encoding one or two Shiga toxin genes. It has become an important public health issue that threatens human health. The present work aimed to characterize STEC strains isolated from cattle and sheep at various stages, in parts of Xinjiang, in terms of the presence of prevalence, genetic diversity, and antimicrobial susceptibility to 17 common antibiotics. Through amplification of four virulence genes (stx1, stx2, eae, hlyA)by PCR and ERIC-PCR genotyping to detection STEC isolates. In the present study, a total of 64 STEC strains were isolated from 431 samples from slaughterhouses, farms and markets. Of these, 31 (48.4%) of the isolates harbored stx1 + stx2, and only 29 (45.3%) of the isolates possessed stx1, only 4 (6.3%) of the isolates harbored stx2, and 1 isolates harbored all the 4 virulence genes. Drug sensitivity tests found that STEC strains displayed 7 antimicrobial resistance to midecamycin(61%), cephalothin(4.7%), cefoxitin(4.7%), ampicillin(3.1%), piperacillin(1.6%), tobramycin(1.6%), cefazolin(1.6%). The ERIC-PCR results showed a polymorphic distribution, which was divided into two clusters of A (36 strains) and B (28 strains). STEC strains isolated from cattle and sheep at various stages, in parts of Xinjiang, some of which might have the potential to cause food contamination and human diseases.     

Study on the Virulence Gene Distribution and Genetic Evolution of Cattle Shiga Toxin-producing Escherichia coli Isolates

This study was aimed to understand the relationship of virulence gene distribution and genetic evolution between cattle originated Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC) and human originated enterohaemorrhagic Escherichia coli (EHEC) O157. This experiment collected 18 strains STEC in a dairy farm from Jiangsu province and 9 STEC reference strains (human, sheep, swine and avian), according to the method of U.S. Centers for Disease Prevention and Control Center (PulseNet), using the XbaⅠ enzyme digestion and pulsed field gel electrophoresis (PFGE) analysis, virulence genes were detected in some STEC isolates. The virulence gene distribution of O157 from different origin was remarkably different. The cattle originated STEC O157 and the human originated EHEC O157:H7 (EDL933W) had the most similar virulence gene distribution. In contrast, virulence genes were lack in cattle STEC O18 and O26, even though the cattle STEC O18 and O26 had the similar genotype as human EHEC O157:H7 (EDL933W). PFGE of Xba Ⅰ digested chromosomal DNA from 27 isolates of STEC exhibited 22 profiles. In general,the Dice coefficients of different originated STEC ranged from 72% to 100%.Cattle STEC O157 had a high similarity with two strains of human originated EHEC O157, while a low similarity was demonstrated between cattle STEC O157 and STEC O157 of swine and avian. The Dice coefficients of the cattle STEC O157 and the two strains of human EHEC O157 ranged from 83% to 95%. The Dice coefficients of cattle STEC O26 (Ⅶ,Ⅷ) and the two strains of human EHEC O157 were more than 82%. Therefore, it was concluded that the cattle STEC O157 and human EHEC O157 had a closer relationship in terms of virulence gene distribution and in genetic evolution.     

新疆牛、羊和骆驼源产志贺毒素大肠埃希菌的系统进化分群、血清群与毒力基因及耐药性分析

旨在了解新疆牛、羊和骆驼源产志贺毒素大肠埃希菌（Shiga toxin-producing Escherichia coli,STEC）的系统进化分群、血清群、毒力基因、耐药性及其遗传多样性,本研究采用PCR方法对牛、羊和骆驼源STEC进行了系统发育分群、血清群和毒力基因stx₁、stx₂（包括亚型）、eaeA、hlyA检测,通过K-B纸片法对分离株进行药物敏感性检测,并对其进行ERIC-PCR基因分型。结果表明：94株非O157 STEC以B1群为主,含9个血清群,包括O146（n=14）、O22（n=7）、O3（n=4）、O168（n=4）、O8（n=3）、O167（n=2）、O88（n=1）、O112ab （n=1）和O147（n=1）。毒力基因检测显示,46.8%（44/94）仅携带stx₁,6.4%（6/94）仅携带stx₂,46.8%（44/94）同时携带stx₁+stx₂。羊源STEC以携带stx₁+hlyA为主（68.0%）;牛源STEC以携带stx₁+stx₂+hlyA为主（57.9%）;骆驼源STEC以携带stx₁+hlyA为主（25.0%）。stx_1a主要分布于牛源STEC,stx_1c主要分布于羊源STEC。14株（14.9%）为耐药菌,对头孢他啶、四环素、头孢噻肟、氨苄西林和氨曲南的耐药率为3.2%~5.3%,对复方新诺明、头孢吡肟、哌拉西林-他唑巴坦、氨苄西林-舒巴坦、阿莫西林-克拉维酸和多黏菌素B的耐药率为1.1%~2.1%。ERIC-PCR结果显示牛、羊和骆驼源STEC亲缘关系较近。牛、羊和骆驼携带多种已知血清群STEC,贮存丰富的毒力基因,存在感染人类的风险,应在屠宰加工过程中予以预防和控制。     

Prevalence,O-genotype and Shiga toxin (Stx) 2 subtype of Stx-producing Escherichia coli strains isolated from Argentinean beef cattle

The aims of this study were to investigate prevalence, O-genotype, and virulence gene profile including Shiga toxin (Stx) 2 gene-subtype of Stx-producing Escherichia coli (STEC) in beef cattle from the Bahía Blanca in Argentina. Rectal swabs were collected from 283 beef cattle in 2012. stx genes were detected in 90 (32%) out of the 283 rectal swabs by stx gene-specific PCR assay. The positive cases were 13 with stx1, 58 with stx2, and 19 with both stx1 and stx2. Among 90 stx gene-positive samples, 45 STEC strains were isolated, which included 3 stx1, 34 stx2, and eight stx1 and stx2 genes positive isolates. O-genotyping grouped 45 STEC strains into 19 different O-genotypes such as Og8, Og145, Og171, Og185 (4 from each), Og22, Og153, Og157 (3 from each) and others. Various stx2 gene-subtypes were identified in 42 STEC strains: 13 positive cases for stx2a, 11 for stx2c, 3 for stx2g, 10 for stx2a and stx2d, 4 for stx2a and stx2c, and 1 for stx2b, stx2c and stx2g. efaI gene, generally prevalent in clinical strains, was detected in relatively high in the STEC strains. These data suggest that stx2a and stx2c were distributed not only in O145 and O157 but also in minor O-genotypes of STEC in Argentina.     

牛源大肠杆菌O157:H7的分离鉴定

为调查新疆部分地区E.coli O157：H7的感染情况和菌株致病性,从新疆阿克苏、伊犁、塔城3个地区的牛场采集新鲜粪样564份,对E.coli O157：H7进行分离与鉴定。利用E.coli营养肉汤（EC肉汤）对样品进行增菌后,用山梨醇麦康凯培养基（SMAC）平板选择性培养,再经过4-甲基伞形酮-β-D葡萄糖醛酸苷培养基（MUG）的筛选,对疑似菌株进行生化和PCR鉴定,并将分离鉴定到的菌株进行小鼠攻毒试验。结果显示,从伊犁地区采集的样品中共分离出2株E.coli O157：H7（Y166和Y226）,其检出率为0.88%;小鼠攻毒试验中,Y166和Y226试验组小鼠在48 h内全部死亡,具有一定致病性;从阿克苏、塔城所采样品中未分离到E.coli O157：H7。     

鸭源大肠杆菌的分离鉴定及致病性分析

【目的】了解江苏、江西、安徽地区鸭源大肠杆菌的分布以及致病性情况。【方法】本研究对江苏、江西、安徽地区的病死鸭进行了鸭源大肠杆菌的分离鉴定,运用PCR结合玻片凝集法测定鸭源大肠杆菌分离株的血清型,并进行了18种毒力基因的PCR检测,随后进行雏鸭致病性试验,并对毒力较强和毒力较弱的菌株进行生长曲线以及半数致死量(LD₅₀)测定。【结果】本研究共分离鉴定获得鸭源大肠杆菌74株,鉴定为O1、O2、O18、O78血清型的分别有1、2、2和4株,其余均未定型;18种毒力基因鉴定结果表明,ibeB、yijp、OmpA和mat基因检出率分别为97.3%、97.3%、95.95%和90.54%。动物致病性试验结果表明,经10⁷ CFU/只攻毒后,74株分离株均引起雏鸭不同程度发病,但仅有2株对雏鸭致死率≥50%。生长曲线测定结果表明,2株强毒株与2株弱毒株的生长速度无显著差异(P>0.05),2株强毒株的LD₅₀分别为10^4.75和10^7.375 CFU。【结论】本研究分离的74株鸭源大...     

牦牛产志贺毒素大肠杆菌主要黏附因子相关基因的分子流行病学调查

为了解中国牦牛产志贺毒素的大肠杆菌(Shiga toxin-producing Escherichia coli, STEC)中主要黏附因子的流行情况,采用PCR方法对来自四川甘孜阿坝等地区健康牦牛的70株STEC的eae、saa、iha 3种与黏附相关的毒力基因进行检测,并对部分含有相关黏附因子的阳性分离株的毒力基因进行了克隆及序列分析。结果显示,牦牛STEC中saa、iha的阳性率分别为71.42%(50/70)和78.57%(55/70),无eae基因序列(0/70),saa、iha的测序结果与GenBank上序列的同源性分别为100%和93%~99%。健康牦牛分离的STEC无LEE毒力岛编码eae,其他的一些与黏附相关的主要毒力基因saa、iha的携带率较高。