陆川猪磷酸酪氨酸互作结构域1基因克隆及序列分析

试验旨在对陆川猪磷酸酪氨酸互作结构域1(phosphotyrosine interaction domain containing 1,PID1)基因进行克隆和生物信息学分析。利用GenBank公布的猪序列设计引物,用RT-PCR扩增得到目的基因片段,并用生物信息学方法分析和预测了陆川猪PID1基因的理化性质与二级结构。结果显示,陆川猪PID1基因编码区全长654bp,编码217个氨基酸;陆川猪PID1基因与莱芜猪、牛、猕猴、人、小鼠、原鸡、大鼠、斑马鱼和非洲爪蟾相对应序列相似性分别为99.08%、87.61%、93.88%、93.58%、90.06%、83.79%、66.94%、66.52%和60.09%。系统进化树分析结果表明,PID1基因在不同物种及进化的过程中具有高度保守性。本研究成功克隆陆川猪PID1基因,为阐明其在陆川猪生长发育及脂肪沉积方面的调控研究奠定了理论基础。     

白洗猪PID1基因克隆及序列分析

本研究旨在对白洗猪磷酸酪氨酸互作结构域1 (phosphotyrosine interaction domain containing 1,PID1)基因进行克隆和生物信息学分析。采用Nest PCR及T克隆技术对白洗猪PID1基因进行克隆测序,运用生物学分析软件分析其结构功能及其在种内及种间的遗传进化关系。结果表明,白洗猪PID1基因CDS区全长654 bp,编码217个氨基酸,白洗猪与山东莱芜猪、广西陆川猪PID1蛋白氨基酸同源性为98.2%与97.7%;进化树分析结果表明白洗猪与两个猪种间遗传关系相对较远,种间比对黄牛、牦牛、猕猴、小鼠、眼镜王蛇、人、原鸡、非洲爪蟾、大鼠和斑马鱼PID1蛋白氨基酸同源性依次为96.6%、96.6%、96.3%、95.0%、93.9%、91.7%、90.8%、88.2%、69.7%和67.3%;系统进化树分析表明PID1基因在多物种之间的进化高度保守,结构功能分析表明白洗猪PID1基因功能区主要是编码链氨基酸C端的PTB结构域。本研究成功克隆了白洗猪PID1基因,为探究其对白洗猪肌内脂肪沉积方面的影响及为白洗猪种资源开发利用奠定理论基础。     

使用GWAS和Meta-GWAS鉴定与猪甘油三酯含量相关候选基因

本实验旨在挖掘影响猪甘油三酯(TG)含量的有效SNP位点以及候选基因,为生产优良猪肉的选育工作提供理论依据。收集Beadchips 60K SNP芯片分型莱芜猪、二花脸猪和杜洛克×(长白×约克郡)(DLY)群体共1 256头猪的数据,并运用FarmCPU模型对1 256头猪的TG含量进行全基因组关联分析(GenomeWide AssociationStudy,GWAS)及Meta-GWAS分析。GWAS分析结果显示：共检测到32个与TG含量相关的SNP位点,其中莱芜猪中有6个(P<1.8×10^-5),二花脸猪中有8个(P<1.8×10^-5),DLY中有18个(P<1.8×10^-5);Meta-GWAS分析结果显示：发现2个与TG含量相关的新SNP位点;并利用Ensembl数据库,在显著SNP位点上下游0.5 Mb区域内进行基因鉴定,一共发现8个与TG含量调控有关的候选基因,其中在莱芜猪中发现的基因为PDCD6IP;在二花脸猪中发现的基因为CD24、ADGRF5和ADAMTS5;在DLY中发现的基因为DM...     

大长杂交猪DJ-1基因克隆、生物信息学及表达分析

【目的】克隆大长杂交猪DJ-1基因CDS区并进行生物信息学分析,探讨DJ-1基因在猪脂肪组织中的表达规律,为后续探究该基因在猪脂肪沉积中的功能奠定基础。【方法】以大长杂交猪腹股沟皮下脂肪组织cDNA为模板,PCR扩增DJ-1基因CDS区,利用在线工具对DJ-1蛋白进行生物信息学分析;利用实时荧光定量PCR检测DJ-1基因在大长杂交猪、大白猪（瘦肉型猪）和莱芜猪（脂肪型猪）脂肪组织中的表达量,并比较表达差异。【结果】大长杂交猪DJ-1基因CDS区全长570 bp,编码189个氨基酸。系统进化树分析表明,大长杂交猪和牛亲缘关系最近,与斑马鱼亲缘关系最远。DJ-1蛋白分子质量为19.94 ku,是一种稳定的酸性、亲水性蛋白,且含有1个GAT_1超家族成员Thij结构域;无信号肽和跨膜结构域,具有21个磷酸化位点、4个N-糖基化修饰位点和1个O-糖基化修饰位点。DJ-1蛋白二级结构由α-螺旋、延伸链、β-转角、无规则卷曲组成,占比分别为42.86%、17.99%、7.94%和31.22%,三级结构预测结果与其一致。蛋白互作分析发现,DJ-1蛋白可能与SOD2、NDUFV2、SNCA、BCL2L1和MAP3K等蛋白存在相互作用。实时荧光定量PCR结果表明,DJ-1基因在大长杂交猪背膘、腹股沟脂肪和肾周脂肪组织中均有表达,但无显著差异（P>0.05）;且在大白猪脂肪组织中的表达量显著或极显著低于莱芜猪（P<0.05;P<0.01）。【结论】本研究成功克隆了大长杂交猪DJ-1基因CDS区,其编码蛋白属稳定的酸性、亲水性蛋白,在莱芜猪脂肪组织中的表达量显著或极显著高于大白猪。本试验结果为进一步研究猪DJ-1基因功能提供理论参考。     

FSHβ亚基基因和ESR基因的多态性对莱芜猪合成系产仔数的影响

研究分析了莱芜猪合成系及其育种素材莱芜黑猪和大约克夏猪FSHβ亚基基因和ESR基因的多态性及其与产仔性能的关系。结果表明:对于FSHβ亚基基因,莱芜猪合成系群体内AB基因型占多数,而在莱芜黑猪和大约克夏群体内分别以AA基因型和BB基因型占绝对优势;FSHβ亚基基因的3种基因型中,以AA基因型的产仔数最高,但各基因型间差异没达到显著水平。对于ESR基因,在3个猪种内,AA和AB基因型均占优势,BB基因型频率很低,且莱芜黑猪群体内未检测到BB基因型。由于ESR基因在莱芜猪合成系及莱芜黑猪和大约克夏猪均表现出极端的偏态分布及样本数量少,因此难以精确计算出各基因型在产仔数上的差异。     

猪MSTN基因的多态性和生长性状关联分析

基于肌肉生长抑制素(Myostatin,MSTN)基因结构及功能研究报道,将其作为猪生长发育性状的候选基因进行多态性检测与关联分析,旨在为猪分子遗传标记提供依据。本研究以长白猪、大白猪、杜长大、通城猪、莱芜猪、五指山猪6个不同猪种基因组DNA为模板,通过克隆测序鉴定MSTN基因启动子区、第1内含子区、第2内含子区、第1外显子区、第2外显子区及3′UTR区SNPs位点;以长白猪和杜长大2个试验猪群为材料,利用基质辅助激光解吸飞行时间质谱法对MSTN基因进行SNP分型。建立最小二乘法分析模型,利用SAS软件分析数据。结果表明:在6个猪种76个个体中,共筛选出16个SNPs,其中有4个位于启动子区,5个位于第1内含子,7个位于第2内含子,在外显子1、外显子2和3′UTR区域并未检测到SNP位点。对MSTN基因的4个SNPs位点(P1、P3、P4、P5;其中P1、P3、P4位于启动子区,P5位于内含子1区)的生长性状关联分析显示,P4和P5 2个位点的多态性与猪生长性状显著相关(P<0.05)。P4和P5 2个位点具有作为分子标记辅助猪育种的潜在应用价值。     

猪钙蛋白酶抑制蛋白基因的多态性分析

钙蛋白酶抑制蛋白的638位氨基酸由丝氨酸(Ser)突变为精氨酸(Arg)可改善猪的肉质,是一个有重要育种应用前景的分子标记。本研究采用PCR-RFLP技术对47头莱芜猪,53头大白猪,45头杜洛克和60头商品杂交猪共205个个体钙蛋白酶抑制蛋白Ser638Arg突变的多态性进行了分析。结果表明:4个猪群均检测到AA、CA和CC3种基因型。其中莱芜猪突变等位基因A频率最低,为0.415;大白猪、杜洛克和商品杂交猪A的频率分别为0.632、0.800和0.750。莱芜猪A的基因频率极显著低于其他4个猪种(P<0.01)。所检测的4个猪群在该突变位点均处于Hardy-Weinberg平衡状态(P>0.05)。     

莱芜猪ACSL4和H-FABP基因的多态性及育种应用

选取了106头莱芜猪核心群及部分后备猪,用PCR-RFLP的方法分别检测了酰基辅酶A合成酶长链4（Acly-CoA synthetase long chain family 4,ACSL4）基因的SNP G2645A位点和心脏型脂肪酸结合蛋白（Heart fatty acid-binding protein,H-FABP）基因的HinfⅠ及MspⅠ位点的多态性。结果显示,在ACSL4的SNP G2645A位点共检测到AG和GG 2种基因型,没有检测到AA基因型;G等位基因是优势等位基因;莱芜猪该位点呈高度多态。在H-FABP的HinfⅠ位点共检测到HH、Hh和hh 3种基因型,莱芜猪在该位点呈中度多态。莱芜猪在上述2个位点均处于Hardy-Weinberg平衡状态。经测序验证,莱芜猪H-FABP基因HinfⅠ位点的多态性是1 324位点T的插入、缺失所造成的。莱芜猪在H-FABP的MspⅠ位点没有多态性。在莱芜猪本品种选育中,可以顺序选择ACSL4G2645A位点GG基因型纯合个体和H-FABP HinfⅠ位点HH基因型纯合个体,提高莱芜猪IMF性状的均一性,将进一步促进莱芜猪种质的保护和利用。     

撒坝猪SPDEF基因克隆及其生物信息学分析

为明确猪SPDEF基因的遗传特性,试验对不同猪种SPDEF基因的CDS区进行序列扩增、测序、拼接,并对撒坝猪SPDEF基因CDS序列进行生物信息学分析。采用PCR直接测序法测定猪SPDEF基因外显子序列,运用SeqMan进行序列拼接。采用生物信息学软件分析撒坝猪SPDEF基因开放阅读框及其编码蛋白的基本理化性质、疏水性、信号肽、跨膜区、亚细胞定位、磷酸化位点、糖基化位点、二级结构、三级结构、功能结构域,并构建系统进化树。结果表明,各猪种SPDEF基因编码区仅在外显子1、2分别检测到1个同义突变(C13971T、C16541T),表明该基因编码区在所检测的猪群中高度保守。生物信息学分析发现,该基因有1个长1 092 bp的完整开放阅读框;SPDEF蛋白中丝氨酸(Ser)含量最高(10.7%),体外理论半衰期为30 h,属于不稳定的亲水性蛋白;该蛋白不存在信号肽及跨膜结构,存在39个潜在的磷酸化位点和1个糖基化位点,亚细胞定位于细胞质;二级结构预测中,参与无规则卷曲的氨基酸最多(55.10%),其次是α-螺旋(28.37%);功能结构域预测发现,该蛋白存在1个ETS功能结构域和1个SAM-PNT功能结构域。系统进化树结果显示,撒坝猪与牛、绵羊和山羊的亲缘关系较近。本研究为进一步分析撒坝猪SPDEF基因的功能奠定了一定的理论基础。     

撒坝猪SPDEF基因克隆及其生物信息学分析

为明确猪SPDEF基因的遗传特性,试验对不同猪种SPDEF基因的CDS区进行序列扩增、测序、拼接,并对撒坝猪SPDEF基因CDS序列进行生物信息学分析。采用PCR直接测序法测定猪SPDEF基因外显子序列,运用SeqMan进行序列拼接。采用生物信息学软件分析撒坝猪SPDEF基因开放阅读框及其编码蛋白的基本理化性质、疏水性、信号肽、跨膜区、亚细胞定位、磷酸化位点、糖基化位点、二级结构、三级结构、功能结构域,并构建系统进化树。结果表明,各猪种SPDEF基因编码区仅在外显子1、2分别检测到1个同义突变(C13971T、C16541T),表明该基因编码区在所检测的猪群中高度保守。生物信息学分析发现,该基因有1个长1 092 bp的完整开放阅读框;SPDEF蛋白中丝氨酸(Ser)含量最高(10.7%),体外理论半衰期为30 h,属于不稳定的亲水性蛋白;该蛋白不存在信号肽及跨膜结构,存在39个潜在的磷酸化位点和1个糖基化位点,亚细胞定位于细胞质;二级结构预测中,参与无规则卷曲的氨基酸最多(55.10%),其次是α-螺旋(28.37%);功能结构域预测发现,该蛋白存在1个ETS功能结构域和1个SAM-PNT功能结构域。系统进化树结果显示,撒坝猪与牛、绵羊和山羊的亲缘关系较近。本研究为进一步分析撒坝猪SPDEF基因的功能奠定了一定的理论基础。     

Cloning and Sequence Analysis of the VP0 Gene of Porcine Kobuvirus

In this study, specific primers were designed according to VP0 gene of porcine kobuvirus (PKV), and the full-length coding region of VP0 gene was amplified by RT-PCR method and sequenced, then bioinformatics analysis were conducted to investigate the structure and function of the porcine kubovirus VP0 gene.The results showed that the porcine kobuvirus VP0 gene was 1 098 bp in length, coding an open reading frame (ORF) with 366 amino acids.The isoelectric point, molecular weight and instability index of porcine kubovirus VP0 were 6.71, 38.489 ku, 34.65, respectively.The maximum and minimum hydrophobicity were 2.622 and —2.122, respectively.Compared with the porcine kubovirus VP0 genes published previously in GenBank, the sequenced gene shared the highest homology with HNXX-4 strain, which was 89.1%;And shared the lowest homology with S-1-HUN strain, which was 81.1%.The porcine kubovirus VP0 gene shared two different phylogenetic genotype branches, and the Chinese porcine kubovirus isolates distributed in the two phylogenetic genotype branches.     

猪嵴病毒VP0基因的克隆与序列分析

本研究根据猪嵴病毒(porcine kobuvirus,PKV)VP0基因序列特征设计特异性扩增引物,采用RT-PCR方法扩增猪嵴病毒VP0基因全长编码区。将特异性扩增目的片段克隆后进行序列测定,将结果进行拼接后获得猪嵴病毒VP0基因全长并进行相关生物信息学分析。所扩增的目的片段编码有完整的VP0基因开放阅读框,全长为1 098 bp,编码有366个氨基酸,理论等电点为6.71,理论分子质量为38.489 ku,不稳定系数为34.65,最大疏水指数为2.622,最小疏水指数为-2.122。将获得的VP0基因和GenBank中的猪嵴病毒代表株VP0基因序列进行核苷酸同源性比对和遗传进化分析,其与HNXX-4核苷酸同源性最高,为89.1%,与S-1-HUN核苷酸同源性最低,为81.1%。从遗传进化上看,猪嵴病毒VP0基因在遗传进化上呈两个独立的基因亚群,猪嵴病毒中国分离株在两个遗传基因亚群上均有分布。     

猪恒定链的原核表达及其分子结构与功能分析

为研究猪恒定链(Ii)分子结构与功能,通过PCR扩增编码完整Ii及其异构体的基因片段,克隆至T pMD18-T载体,在对目的基因进行测序及分析其基因与编码蛋白分子结构,确定功能域及其分子遗传变异的基础上,构建pET-32a-Ii重组载体,转化BL21进行诱导表达,并分析表达产物的免疫活性。结果显示,PCR扩增了645bp和837bp的Ii及其异构体编码基因,DNA序列分析其编码氨基酸分别为215个和279个,异构体Ii多出了64个氨基酸构成的Tg区;分子结构分析显示,猪Ii分子由胞内区、跨膜区和胞外区3部分组成,包含有内体定位基元、Ii-key、CLIP、TRIM等功能域,其中内体定位基元含有特征性L7I和PML17双亮氨酸基序,Ii-key、CLIP、TRIM氨基酸序列与人和小鼠Ii具有高度一致性。遗传变异分析表明,猪Ii分子与人、小鼠等哺乳动物的Ii同源性为62.7%~95.6%,与鸡、鸭、鸽、鹅等禽类Ii的同源性为48.7%~49.5%;空间结构分析显示,猪Ii有3个相似的α-helix构成,其间间隔由相似氨基酸构成的2个转角,转角关键位点氨基酸具有高度一致性;Ii编码基因在BL21细胞获得了有效表达,目的蛋白大小约41ku,Western blot和免疫荧光检测显示,表达产物具有良好的反应原性。试验成功获得了猪Ii及其异构体编码基因,明确了其功能区、分子遗传变异等特征,诱导表达获得了具有良好免疫活性的Ii重组蛋白,为进一步研究猪Ii分子结构与功能奠定了基础。     

猪β防御素-1的研究进展

猪β防御素-1 (porcine β-defensin 1,PBD-1)是广泛分布于猪消化道、呼吸道、肝肾等多种组织细胞内的一类活性多肽,在猪防御系统中有着重要的作用,大量研究结果证明PBD-1具有独特的作用机制,几乎无耐药性, 已引起各国研究者的日益重视。目前对PBD-1科研工作在不断深入,可以相信PBD-1将在动物养殖、疾病预防和提高畜产品品质方面发挥重要作用。作者就PBD-1的分布、分子结构、抗菌作用机制和基因表达调控研究进展作一综述。     

猪NAP1L5基因克隆、序列鉴定及在不同妊娠时期胎盘中的差异表达分析

旨在获得猪NAP1L5基因的序列特征、组织表达及生物学功能等相关信息.本试验通过RT-PCR克隆了猪NAP1L5基因,并运用生物信息学方法分析了不同物种序列进化关系,运用荧光定量PCR技术检测了NAP1L5在梅山猪不同妊娠时期胎盘中的表达.序列分析结果表明,猪NAP1 L5基因CDS全长579 bp,编码193个氨基酸.其核苷酸序列与牛的相似性为89％,其中氨基酸序列包含一段保守的核小体组装蛋白(Nucleosome assembly protein,NAP)特征序列.荧光定量结果表明NAP1L5基因随着妊娠时期的增长呈上升表达,在26和50 d之间表达量差异极显著(P＜0.01).以上结果支持了NAP1L5基因可能与猪胎儿营养获取及早期发育有关,为进一步研究猪NAP1 L5基因的功能奠定了基础.     

猪NDUFS2基因的定位、克隆和组织表达谱分析

利用辐射杂种克隆板对猪NDUFS2(NADH dehydrogenase(ubiquinone)Fe-S protein 2)基因进行了染色体定位,克隆了该基因的CDS序列,用相关软件进行了基因结构和功能预测,并利用半定量RT-PCR对基因的组织表达谱进行了分析。研究结果表明:NDUFS2基因定位于猪的4号染色体SSC4q,与标记SW589紧密连锁。获得NDUFS2基因的CDS为1 392 nt,编码463个氨基酸。物种间系统进化树分析表明:猪与牛的NDUFS2基因序列同源性更高。结构预测发现猪NDUFS2基因具有一个NuoD保守结构域,与能量的产生和转化功能有关。根据组织表达谱分析结果,NDUFS2在猪的11种组织中的表达量有差异。     

猪SENP1基因克隆、生物信息学分析与表达研究

试验旨在对猪SUMO特异性蛋白酶1(sentrin-specific protease 1,SENP1)基因CDS区进行克隆和生物信息学分析,并探讨SENP1基因在乙脑病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)感染PK15细胞后的表达情况。根据GenBank中公布的猪SENP1基因预测序列(登录号:XM_013997974.2)设计特异性引物,通过RT-PCR和T/A克隆技术对猪SENP1基因CDS区序列进行克隆测序,并进行生物信息学分析,利用实时荧光定量PCR分析猪SENP1基因在JEV感染PK15细胞不同时间点(0、12、24、36、48 h)的表达情况。结果显示,猪SENP1基因CDS序列全长2 034 bp,共编码677个氨基酸。序列比对和系统进化树分析结果表明,猪SENP1蛋白序列和山羊、犬、人、牛的相似性分别为94.8%、94.2%、93.9%和93.8%,说明在这些物种中SENP1的保守性较强;猪与犬的SENP1分子亲缘关系较近。生物信息学分析结果显示,猪SENP1蛋白相对分子质量为76 825.76,等电点为8.53,体外半衰期为30 h,不稳定系数为53.59,总平均亲水指数为－0.622。SENP1蛋白不含信号肽序列,无跨膜结构域。二级结构分析结果显示,SENP1蛋白中α-螺旋、无规则卷曲、延伸链和β-转角分别占31.31%、46.68%、16.25%和5.76%。三级结构分析结果显示,猪SENP1蛋白中存在8个α-螺旋区和7个β-转角区。实时荧光定量PCR结果显示,猪SENP1基因在JEV感染的PK15细胞中呈现上调表达趋势,其中在感染后48 h SENP1基因表达量显著高于对照组(P<0.05)。本试验结果为后续深入研究SENP1基因功能提供了参考。     

猪嵴病毒非结构蛋白2C的生物信息学分析

本研究运用RT-PCR方法从猪嵴病毒感染阳性样品中扩增出其非结构蛋白2C全基因,并将其克隆到T载体后进行序列测定。研究结果表明,猪嵴病毒非结构蛋白2C全长为1005 bp,编码335个氨基酸。所编的非结构蛋白2C大小为36.9297 ku,理论等电点为7.18;不稳定系数为39.41,属于稳定蛋白质类;脂肪族氨基酸指数为87.10,平均亲水性为-0.242。与其核苷酸同源性最高的是CH/HZ/2011株(GenBank登录号:JX827598),同源性为91.6%;同源性最低的是XX株(GenBank登录号:KC204684),同源性为88.8%。遗传进化分析结果显示,猪嵴病毒非结构蛋白2C在遗传进化树呈3个明显的结构分支,猪源嵴病毒匈牙利株和泰国株处于第Ⅲ遗传进化分支,猪嵴病毒中国分离株分处于第Ⅰ和第Ⅱ遗传进化分支,呈一定的区域流行性。     

猪细小病毒PPV-SD1株VP2全基因的克隆及原核表达

为研究猪细小病毒PPV-SD1分离株的VP2蛋白的结构与功能,自行设计引物,通过PCR扩增的方法,获得VP2全基因,克隆到pMD18-T载体中进行测序,然后亚克隆到pET30a(+)表达载体中,构建并筛选出阳性重组子,标记为pET30a-VP2。将阳性重组质粒转化进RosettaTM宿主菌中,通过改变IPTG浓度、诱导温度和诱导时间,使重组蛋白获得表达,并确定最佳诱导条件为:IPTG终浓度1.0 mmol/L、诱导温度37℃、诱导时间为3~4 h。经SDS-PAGE和Western-blotting分析表明该重组蛋白相对分子量约为68 ku,具有良好的免疫学活性。     

猪A组轮状病毒VP7基因的克隆及生物信息学分析

为了研究猪A组轮状病毒VP7基因功能,根据GenBank中猪轮状病毒VP7基因DNA序列设计引物,以实验室轮状病毒上海分离株SH-1为模板,进行PCR扩增,将VP7基因克隆到pMD-18T载体后,进行序列测定及分析。结果表明:此序列编码326个氨基酸,其相对分子量为37.38 Ku,理论等电点(PI)为4.77。VP7蛋白以α螺旋为主,主要有13个抗原表位区域。系统进化树分析显示分离株SH-1与KM230930.1株亲缘关系最近,基因型分析结果是G10型,属于人兽共患病毒株。