原癌基因c-myc在塔里木马鹿茸不同生长期的表达

为探讨原癌基因c-myc对鹿茸生长的调控作用,选择3头成年塔里木马鹿生长期为30、60d的新鲜鹿茸,剖分成茸皮层、间充质细胞层、成软骨细胞层和软骨细胞层。首先用2种免疫组化的方法进行基因表达定位,然后通过荧光定量PCR技术对不同组织基因表达定量进行分析。结果显示：该基因在茸皮的毛囊内根鞘、毛母质和皮脂腺呈阳性反应,在动脉血管的环形平滑肌、真皮乳头层与表皮基部连接的基底层呈阳性反应。在静脉血管、神经和其他附属器反应均呈阴性。定量分析结果表明c-myc基因在不同生长阶段不同组织层均有表达。茸皮层从生长期30～60d,c-myc表达下调,而在其他3个组织中均上调表达;同一生长期茸皮和软骨层的表达量均高于间充质细胞层和成软骨层（P〈0.05）;不同生长期30、60d组织间基因的表达没有显著的变化。研究结果表明,c-myc基因在鹿茸快速生长期参与了茸皮的增殖与分化;在软骨组织中高表达特别是生长后期,说明原癌基因c-myc对马鹿茸软骨发育及骨形成有着一定调控作用。     

原癌基因c-fos在塔里木马鹿茸组织中表达特性的研究

为探讨原癌基因c-fos对鹿茸生长的调控作用,采用3头成年塔里木马鹿Cervus elaphus生长期为30、60d的新鲜鹿茸,剖分成茸皮层、间充质细胞层、成软骨细胞层和软骨细胞层。首先用2种免疫组化的方法进行基因表达定位,然后通过荧光定量PCR技术对不同组织基因的表达进行定量分析。免疫组化分析结果表明,该基因在茸皮的毛囊内根鞘和毛母质及皮脂腺、动脉血管的环形平滑肌处呈阳性反应;真皮乳头层与表皮基部连接的基底层呈阳性反应。在静脉血管、神经和其他附属器反应均未观察到阳性细胞。在间充质细胞层、成软骨层和软骨层2种方法均没有观察到c-fos的阳性表达细胞。定量分析发现,c-fos基因在不同生长阶段不同组织层均有表达,且在茸皮的表达量显著的高于间充质细胞层,成软骨层和软骨层(P<0.05)。在同一生长期间充质细胞层、成软骨层和软骨层c-fos的表达量很低;生长30与60d比较,c-fos在间充质细胞层和成软骨层变化不大,在茸皮层和软骨层表现为下调表达。本研究表明c-fos基因在鹿茸快速生长期参与了茸皮干细胞的增殖与分化,并对成骨细胞的分化起着调控作用。     

塔里木马鹿鹿茸VEGF基因克隆及其在不同鹿茸组织中的表达研究

试验旨在从塔里木马鹿鹿茸顶端组织中克隆血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）的编码序列,分析其分子特性及其在鹿茸组织中的表达情况。本研究采用改良的Trizol法提取鹿茸顶端组织总RNA,以RT-PCR方法获得VEGF基因,回收纯化后连接到pMD18-T载体,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞并鉴定,利用免疫组化法确定VEGF蛋白在塔里木马鹿鹿茸顶端组织茸皮层、间充质层和软骨层中的表达水平。结果显示,VEGF基因开放读码框（ORF）全长为648 bp,编码216个氨基酸。通过其序列比对和进化分析发现,塔里木马鹿茸中VEGF与人、牛、羊、猪的VEGF核苷酸序列同源性分别为98.75%、96.55%、97.58%和97.56%,其中与人VEGF同源性较高。免疫组化试验表明,塔里木马鹿VEGF蛋白在间充质、茸皮层和软骨中均有表达,但无明显表达差异。说明塔里木马鹿鹿茸可能会是人类研究再生医学和血管相关疾病的理想模型,同时,本研究为不同发育期塔里木马鹿鹿茸再生干细胞比较蛋白质组学研究提供了基础试验数据。     

塔里木马鹿最佳收茸期探究

为确定不同年龄段塔里木鹿茸的最佳收茸时间,保证鹿茸的药用价值,本研究选取老中青3个年龄段的塔里木马鹿各3头,分别于生茸不同时期进行了鹿茸生长速度、骨密度及外周血中Ca2+含量的测定。结果显示:青年组最佳收茸时期在6月17日;而中、老年组的最佳收茸时期在6月3日,三者存在时间差异。     

饲粮蛋白、磷水平对塔里木马鹿产茸量的影响

正塔里木马鹿为马鹿的新疆特有亚种,主要分布在塔里木河及其支流沿岸,具有耐粗饲、产茸力高的优良品质,是新疆3种马鹿亚种(塔里木马鹿、天山马鹿、阿勒泰马鹿)中单位体重产茸量最高的一种(时孔民,1994),种公鹿鲜茸平均单产最高年达12.61千克(杨德胜,1997)。研究发现,鹿茸的生长发育与自身的激素调节、营养水平、自然环境等有关(高秀华等,2001)。在营养因素中,饲粮蛋白质     

塔里木马鹿茸重性状遗传力重复力及育种值的估测

研究采用同父异母半同胞组内相关法和组内相关系数法,分别对祁连山野生动物保护中心5头塔里木马鹿种公鹿6锯三杈鲜茸重遗传力和育种值,以及9头塔里木马鹿3~9锯三杈鲜茸重的重复力进行了估测。结果表明,其遗传力为0.42,重复力为0.67(P<0.01),5头塔里木马鹿产茸量育种值等级为A128>A27>A152>A63>A77。由此说明,塔里木马鹿茸重为高遗传力和高重复力(P<0.01)性状,祁连山野生动物保护中心引入的27号和128号种公鹿种用价值较高,可以扩大使用。     

鹿茸Ca^2＋含量与塔里木马鹿收茸期的关系研究

为了确定不同年龄段塔里木马鹿鹿茸的最佳收茸时间,保证鹿茸的药用价值,试验选取老、中、青3个年龄段的塔里木马鹿各6头,采用火焰原子吸收分光光度法,分别测定不同生茸时期鹿茸中Ca2＋的含量。结果表明：青年组至6月17日鹿茸上段Ca2＋含量增加显著,确定其最佳收茸时间以6月17日为宜;中年、老年组的最佳收茸时期在6月3日左右,三者存在时间差异。     

鹿茸Ca~(2+)含量与塔里木马鹿收茸期的关系研究

为了确定不同年龄段塔里木马鹿鹿茸的最佳收茸时间,保证鹿茸的药用价值,试验选取老、中、青3个年龄段的塔里木马鹿各6头,采用火焰原子吸收分光光度法,分别测定不同生茸时期鹿茸中Ca2+的含量。结果表明:青年组至6月17日鹿茸上段Ca2+含量增加显著,确定其最佳收茸时间以6月17日为宜;中年、老年组的最佳收茸时期在6月3日左右,三者存在时间差异。     

塔里木马鹿生茸期机体骨骼Ca~(2+)变化规律研究

为了确定不同年龄段塔里木马鹿生茸期机体骨骼中Ca~(2+)的变化规律,试验选取老、中、青三个年龄段的塔里木马鹿各3头,分别于生茸前期、生茸期、骨化期三个不同时期屠宰后取其机体各部位骨骼,采用火焰原子吸收分光光度法进行骨中Ca~(2+)含量的检测。结果表明:中年组塔里木马鹿在三个不同时期Ca~(2+)含量均最高,其次是老年组,最后是青年组;老、中、青三个组机体骨骼Ca~(2+)含量随鹿茸的生长及骨化均呈下降趋势,这表明其对鹿茸生长与骨化均有供钙作用;但各类骨骼中肋骨Ca~(2+)在整个生茸期内变化幅度最大,其对鹿茸生长及骨化的贡献值最高。     

新疆塔里木马鹿茸c-myc基因cDNA克隆和bHLHZIP结构分析及表达

采集6头成年马鹿生长60 d茸组织,获得塔里木马鹿茸c-myc基因cDNA全长序列,并比对分析其转录因子的序列特征;结果表明:得到塔里木马鹿茸c-myc基因cDNA 1 840 bp序列,其中ORF区长1 314 bp,编码438个氨基酸;马鹿茸c-myc序列比对,与牛和羊序列相似性最高分别为96%和97%;氨基酸比对分析,在序列121位处马鹿比牛、羊、猪、人类及鼠少1个天冬氨酸(D);马鹿茸c-myc基因的DNA结合域由bHLHZIP结构组成,共80个氨基酸残基,在bHLH区的第16和46位氨基酸处,塔里木马鹿分别为天冬氨酸D和精氨酸R,而牛、羊、猪、人和鼠为天冬酰胺N和赖氨酸L。6个DNA结合位点和E-box的结合位点没有氨基酸变异;羊、牛、猪、人、鼠和马鹿的cmyc基因的Zip序列变异较大。本实验通过0.8 mmol/L IPTG诱导,2 h后构建的Pet-28b-c-myc原核表达载体开始表达目的基因,PAGE检测获得约48 ku目的蛋白质,同时发现随着诱导时间延长没有发现表达量的变化。     

鹿茸蛋白的提取分离及其抗肿瘤活性

鹿茸粉脱脂后,用ＮａＣｌ－ＨＣｌ缓冲液（ｐＨ６）提取,应用ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－５０层析柱分离纯化后,获得鹿茸蛋白。给腹腔接种Ｓ１８０型小鼠口服鹿茸蛋白提取物,观察生存时间,结果表明,口服鹿茸蛋白的试验组与对照组生存时间相比,差异显著（Ｐ＜００５）。     

梅花鹿三杈茸、二杠茸、角盘中钙、磷含量比较

为探讨梅花鹿茸内在指标性成分 ,于 2 0 0 0～ 2 0 0 1年对吉林省 11个国营鹿场人工饲养的梅花鹿三杈茸、二杠茸及其角盘中钙、磷含量进行了对比分析。结果表明 ,二杠茸钙、磷含量及钙磷之和均略高于三杈茸 ,分别为 7 32 % (Ca)、6 0 9% (P)及 13 4 1% (Ca +P) ;7 0 6 % (Ca)、5 76 % (P)及 12 82 % (Ca +P) ,二杠茸钙、磷以及钙磷之和的比较差异均不显著 (P >0 0 5 ) ,而鹿角盘中的钙、磷及钙磷之和分别为 7 71% (Ca)、7 4 7%(P)及 15 18% ,明显高于二杠茸和三杈茸 (P <0 0 5 )。     

TMEM219基因可变剪切体相对表达量及其对鹿茸重量的影响

试验旨在研究TMEM219基因3种剪切体在不同重量鹿茸尖端的表达规律及TMEM219基因表达对鹿茸重量的影响,以期探究TMEM219基因对鹿茸生长发育的调控机理。利用实时荧光定量PCR技术对TMEM219基因及其3种剪切体在同一重量组鹿茸的不同组织及不同重量组鹿茸的同一组织mRNA的相对表达水平进行检测,同时测定并比较不同产茸量梅花鹿的血清中胰岛素生长因子1（IGF-1）和胰岛素样生长因子结合蛋白3（IGFBP-3）的浓度。结果表明,TMEM219基因的3种剪接体在梅花鹿鹿茸的间充质及前成软骨组织（RP）、过渡组织（TZ）及软骨组织（C）中均有表达,TMEM219-918基因相对表达量极显著高于TMEM219-1005与TMEM219-1960基因（P<0.01）,TMEM219-1005与TMEM219-1960基因相对表达量无显著差异（P>0.05）;高重量组TMEM219基因表达量显著高于低重量组（P<0.05）;同时,高重量组个体血清中IGF-1浓度显著高于低重量组个体（P<0.05）,而IGFBP-3浓度显著低于低重量组个体（P<0.05）。结果提示,TMEM219基因高表达可能会促进鹿茸的生长,增加鹿茸重量;推测其可能的机理是TMEM219竞争性结合IGFBP-3,减少与其结合的IGF-1,加强IGF-1与IGF-1R的亲和力,进而提高IGF-1对鹿茸生长的促进作用。TMEM219基因可能成为影响鹿茸生长发育的候选基因,为提高鹿茸生长提供理论基础。     

鹿茸多肽提取分离纯化及药理作用研究进展

鹿茸多肽具有抗炎、抗氧化、增强免疫并能促进细胞分化、伤口愈合、抑制肿瘤细胞、促进神经系统、周围神经系统组织的再生等药理作用,是鹿茸中最有效的成分之一。文中对鹿茸多肽的提取,分离纯化及药理作用研究进展进行了综述,希望为鹿茸多肽的研究和开发提供参考。     

梅花鹿锯茸时出血特点及止血药物的研究

为达到更好的锯茸止血效果,对梅花鹿锯茸时出血特点及锯茸止血药物应用效果进行了观察:收取初角茸时呈渗出状出血;收取二杠茸时呈线状出血;收取三杈茸和畸型茸时呈喷射状出血,并且有节律地进行搏动。出血量随着鹿茸的产量和茸根围度的增加而增多,但是当收取茸根围度为(20.3±0.6)cm的畸型茸时却不存在这种明显的相关关系。同一茸型不同年龄的鹿,因茸重、茸根围度的不同出血亦有差别。根据鹿茸的组织结构、生长规律和梅花鹿生理特点,选用由中药组成的外用锯茸止血药方剂,通过锯茸止血试验,结果表明,该锯茸止血药无刺激性,止血快,抗感染能力强,创面愈合良好,对再生茸产量没有明显影响(P>0.05)。     

外源褪黑素对鹿茸软骨细胞生长发育的影响

试验旨在探讨褪黑素对体外培养的鹿茸软骨细胞增殖、周期及凋亡的影响。利用甲苯胺蓝、茜素红S、阿利新蓝染色鉴定软骨细胞,采用外源添加褪黑素的方法,用不同浓度（0、400、800、1 200、1 600和2 000 pg/mL）、不同时间（24、48和72 h）处理鹿茸软骨细胞,CCK-8法检测细胞增殖。选取800 pg/mL褪黑素处理软骨细胞24 h,利用流式细胞仪检测细胞周期的分布及细胞凋亡情况,采用ELISA试剂盒检测细胞培养液中睾酮含量。结果显示,经不同浓度的褪黑素处理鹿茸软骨细胞不同时间后,800 pg/mL褪黑素处理鹿茸软骨细胞24 h细胞活力极显著增加（P<0.01）。软骨细胞经褪黑素处理后,与对照组相比,褪黑素处理组细胞G1期比例显著降低（P<0.05）;G2期比例极显著增加（P<0.01）,细胞被阻滞在G2期;褪黑素处理组细胞早期凋亡率无显著变化（P>0.05）,晚期凋亡率显著下降（P<0.05）;ELISA检测睾酮分泌水平均显著上升（P<0.05）。综上,外源添加800 pg/mL褪黑素可以促进鹿茸软骨细胞的增殖,抑制软骨细胞的晚期凋亡,促进睾酮的分泌;以上结果可为阐明褪黑素参与鹿茸生长发育机制提供参考。     

鹿产茸性能的调控因素

在阐述鹿茸的药理作用和营养特性的基础上,分析了鹿品种、年龄、营养及激素、骨化、光照、温度、中草药添加剂、适时收茸、体重等因素对茸鹿产茸性能的影响,为提高鹿茸产量和质量提供了理论基础。     

不同生长时期梅花鹿鹿茸代谢组分析

旨在探究梅花鹿鹿茸不同生长时期小分子代谢物表达差异变化,为鹿茸快速生长与骨化分子机制的研究奠定基础。本研究选取体况良好的4岁龄雄性东北梅花鹿,收取生长25、45、65、100、130 d的鹿茸作为试验样品,每个时期3个生物学重复。利用UHPLC-TOF-MS技术对样品进行代谢组学分析。样品主成分分析与层次聚类分析结果显示,5个生长时期可分为鹿茸生长期(25、45与65 d)与鹿茸骨化期(100与130 d)两个阶段。筛选、鉴定到171种显著差异表达代谢物(VIP>1,P<0.05,|fold change|>2),比对到HMDB数据库的112种代谢物,分为7大类;其中L-焦谷氨酸、L-组氨酸、L-肌肽与阿坎酸等有机酸类化合物在100 d含量最高,15-脱氧-Δ12,14-前列腺素J2、前列腺素H2、前列腺素I2在130 d显著上调,而其他氨基酸及有机酸类化合物均在生长期表达上调。差异代谢物显著富集到氨酰-tRNA生物合成、组氨酸代谢等13种KEGG代谢通路。本研究从代谢组水平为鹿茸快速生长与骨化分子机制的探究提供数据支撑。