氟唑活化酯诱导大白菜抗根肿病效果与机理初步研究

为明确新型植物诱导抗病剂氟唑活化酯对大白菜根肿病的诱导抗病效果及抗病机理,研究了氟唑活化酯的诱导浓度、在白菜根部的运输过程以及氟唑活化酯诱导白菜后相关防御基因的表达情况。结果显示以氟唑活化酯25 mg ? L-1对大白菜进行叶面喷雾诱导时根肿病的病情指数最低。通过台盼蓝（Trypan blue）染色观察到氟唑活化酯诱导大白菜叶片后,根部对根肿菌也产生了一定的抗性。利用Real-time PCR技术检测大白菜防御相关基因的表达,发现氟唑活化酯诱导大白菜2 h后JA途径中的COI1和LOX2基因以及SA途径中的PR-1基因都有显著的过量表达,其中JA信号途径相关基因表达变化更明显。结果说明氟唑活化酯可以诱导大白菜产生系统获得抗性,两种信号传导途径都参与了抗病过程,但以JA途径为主,SA途径为辅。     

核盘菌对观赏向日葵防卫相关基因表达的影响

以观赏向日葵(Helianthus annuus L.)中一个矮向日葵品种为试材,通过对四叶期观赏向日葵进行核盘菌诱导,采用提取RNA进行反转录、PCR荧光定量等方法研究其防卫相关基因的表达,以期探究核盘菌时观赏向日葵防卫相关基因表达的影响。结果表明:核盘菌侵染对观赏向日葵水杨酸(SA)信号路径中的关键基因NPR1、PR1表达量发生上调;ET介导信号传递路径中关键基因PDF1.2表达量有所升高;JA/ET途径的关键"节"点基因MPK4、EDS1表达量上调变化;NPR1、PR1、EDS1、PDF1.2和MPK4均明显上调表达,由此表明,观赏向日葵受SA和JA信号的调控,核盘菌对观赏向日葵相关防卫基因表达有一定的影响。     

水杨酸对梨SOD、PPO 同工酶和NPR1 表达的影响

 以鸭梨（Pyrus bretschneideri‘Yali’）为试材,研究外源水杨酸处理后梨叶片中内源水杨酸（SA）及超氧化物歧化酶（SOD）、多酚氧化酶（PPO）同工酶的变化特点以及病程相关基因非表达子1（NPR1）对水杨酸的早期应答反应。结果表明：水杨酸处理后梨叶片中内源SA含量升高,其中游离态SA含量随处理浓度增大而逐渐升高,但均显著低于对照;结合态SA随处理增大而逐渐降低,但均显著高于对照。SOD、PPO同工酶酶谱分析结果显示,水杨酸处理后酶谱带表达量增强。接种病菌试验表明,0.200 mmol · L^-1 SA可以诱导梨增强对轮纹病的抗性,且诱导处理过的叶片受到病菌侵染时SOD、PPO酶活性增强。实时荧光定量PCR分析表明,0.200 mmol · L^-1 SA诱导后梨叶片中NPR1表达量明显升高,但NPR1在茎中的表达受到抑制。     

茉莉酸甲酯诱导葡萄悬浮细胞防卫反应机制的研究

为明确茉莉酸甲酯(methyl jasmonate,Me JA)诱导葡萄果实抗病反应的机制,以‘巨峰’葡萄悬浮细胞为试材,将其继代培养一次后分别在含10μmol·L-1 Me JA的B5培养基和含100 nmol·L-1隐地蛋白的B5培养基中(模拟病原菌接种)振荡培养15 d,每3 d测定1次细胞质量及抗病相关指标。结果显示:单一Me JA处理未激活葡萄悬浮细胞内的防卫反应;而单一隐地蛋白处理则可立即显著诱导葡萄悬浮细胞内源H2O2迸发,提升vv NPR1.1、PR1和PR2表达水平和植保素含量;经Me JA处理的葡萄悬浮细胞在添加隐地蛋白后,其细胞内出现较单一隐地蛋白处理更为显著的H2O2迸发、PR基因表达和植保素合成现象,说明经Me JA处理的悬浮细胞只在病原激发子胁迫时才表达出较强的系统抗性。因此,Me JA诱导的葡萄悬浮细胞抗病反应可归因于Priming(植物敏化过程或防御准备过程)机制。此外,经Me JA诱导的Priming反应对葡萄悬浮细胞生长无显著影响,暗示其未抑制葡萄细胞生长和胞内物质积累。     

不同葡萄品种对霜霉病的抗性鉴定及相关生理生化研究

【目的】明确不同葡萄品种对霜霉病的抗性,解析葡萄抵御霜霉病菌的相关生理反应及相关信号通路。【方法】采用田间调查、室内测定分析40个葡萄品种对葡萄霜霉病的抗性,研究在葡萄霜霉病菌诱导下,叶片的水杨酸(SA)、过氧化氢(H2O2)含量的变化,PR1、NPR1、Rboh D的表达。【结果】多数品种室内外对霜霉病抗性一致,高抗品种的SA、H2O2较感病品种更快更多量的积累,NPR1、PR1及Rboh D基因在高抗品种中更快更强烈的诱导表达。【结论】SA信号通路、活性氧通路参与了葡萄对霜霉病的抗性。     

黄瓜霜霉病抗性相关基因的初步研究

 以黄瓜高抗霜霉病自交系为材料,构建了两个抑制差减文库,经反向Northern杂交筛选、测序和序列比对,筛选到3个未知功能抗病相关基因。荧光实时定量RT-PCR分析结果表明,未知功能抗病相关基因2I15（GD254229）、3C19（GD254243）和1O08（GD254207）在抗病自交系接种霜霉病病原菌后,可早期高丰度特异上调表达,而在感病自交系中特异上调表达丰度较低或被特异抑制表达。水杨酸（SA）可诱导1O08特异上调表达,抑制2I15和3C19的表达;茉莉酸（JA）处理可诱导1O08特异上调表达,而抑制2I15的表达。ABA处理可显著诱导3C19和1O08特异上调表达,而抑制2I15的表达。机械伤害、高盐、冷害和热激等其它非生物胁迫可显著抑制或诱导这些基因的表达,因此推测,所筛选到的功能未知基因可能具有参与生物和非生物胁迫反应的作用     

U+3B8FNPR1同源基因全长cDNA的分离与表达分析

 NPR1是水杨酸诱导抗病基因表达的重要调控因子之一,主要作用于水杨酸信号转导途径的上、下游。采用稀释池PCR法,筛选U+3B8F（Prunus salicina var. cordata）叶片全长均一化cDNA文库,分离U+3B8F叶片NPR1同源基因的全长cDNA;用不同浓度的水杨酸喷施一年生U+3B8F嫁接苗嫩叶,采用荧光定量PCR技术检测所获得的NPR1同源基因的表达量差异。试验结果表明,共获得了4个NPR1同源基因的全长cDNA,分别命名为PsNPR1、PsNPR3.1、PsNPR3.2和PsNPR3.3,其长度分别为2 442、1 827、2 244和2 615 bp,其ORF长度分别为1 788、1 770、1 767 和1 782 bp,分别编码596、590、589和594个氨基酸的蛋白质;氨基酸序列比对结果表明,U+3B8F这4个NPR1同源基因的编码区均含有BTB/POZ和ANK两个保守域及核定位信号（NLS）;PsNPR1与拟南芥的AtNPR1和AtNPR2聚为一簇,PsNPR3.1、PsNPR3.2和PsNPR3.3与拟南芥的AtNPR3和AtNPR4聚为另一簇。PsNPR1在喷施1.0 mmol ? L-1水杨酸的叶片中表达量最高;PsNPR1、PsNPR3.1、PsNPR3.2在响应1.0 mmol .  L-1水杨酸诱导过程中表达量持续上升, 30 h表达量最高,之后呈下降趋势,因此,水杨酸诱导抗病基因高表达的最佳处理浓度为1.0 mmol ? L-1,最佳响应时间为30 h。     

唐菖蒲茉莉素受体基因GhCOI1的克隆与表达分析

通过RACE技术在唐菖蒲(Gladiolus hybridus)品种‘Rose Supreme’的籽球苗叶片中克隆得到茉莉素受体COI1基因的c DNA序列,命名为Gh COI1。该基因全长为2 603 bp,包含一个编码613个氨基酸的开放阅读框,5′utr和3′utr分别为484 bp和277 bp,预测的蛋白质分子量为69.46 k D;其氨基酸序列具有典型的F-box基序和LRRs结构域。同源比对和系统进化树的分析结果表明,Gh COI1与番茄Le COI1氨基酸序列的相似性最高,达到64.3%;与水稻Os COI1的亲缘关系最近。利用实时荧光定量PCR分析基因表达的结果表明,Gh COI1在唐菖蒲叶片中的相对表达量最高,根中其次,匍匐茎、新球、籽球、花瓣、雄蕊、雌蕊里中的相对表达量较低,推测在唐菖蒲中存在器官专一性表达的COI1同源基因。采用0.05、0.1和0.5 mmol·L-1 Me JA喷施处理唐菖蒲叶片,检测到施用0.1 mmol·L-1 Me JA可显著上调Gh COI1的表达。同时伴随此浓度Me JA处理时间的增加,12 h内Gh COI1的表达量呈现先上升再下降后上升的趋势。洋葱表皮细胞瞬时表达结果表明Gh COI1蛋白定位于细胞质和质体中。本研究中初步验证了Gh COI1在茉莉素信号途径中的作用。     

唐菖蒲茉莉酸生物合成关键酶基因LOX1的克隆及表达分析

 以唐菖蒲（Gladiolus hybridus）品种‘Rose Supreme’的球茎为试材,通过RT-PCR和RACE技术克隆到了一个全长为2 797 bp的茉莉酸（Jasmonic acid,JA）生物合成关键酶LOX基因的cDNA序列,命名为GhLOX1,属于9-LOX。该序列含有一个2 541 bp的开放阅读框（ORF）,编码846个氨基酸,推导的蛋白质分子量为94.90 kD。RT-PCR表达分析表明,该基因在唐菖蒲叶、花、根、匍匐茎、新球茎和籽球上都表达,而在叶和匍匐茎中表达量最高,在花和籽球中表达量较低;离体条件下,经过0、0.1、0.5、1.0、2.0 mmol · L^-1的不同浓度梯度的水杨酸（SA）处理后,其表达水平随着浓度的升高而降低,当SA浓度达到2.0 mmol · L-1时没有表达。     

■NPR1同源基因全长cDNA的分离与表达分析

NPR1是水杨酸诱导抗病基因表达的重要调控因子之一,主要作用于水杨酸信号转导途径的上、下游。采用稀释池PCR法,筛选■(Prunus salicina var. cordata)叶片全长均一化cDNA文库,分离■叶片NPR1同源基因的全长cDNA;用不同浓度的水杨酸喷施一年生■嫁接苗嫩叶,采用荧光定量PCR技术检测所获得的NPR1同源基因的表达量差异。试验结果表明,共获得了4个NPR1同源基因的全长cDNA,分别命名为PsNPR1、PsNPR3.1、PsNPR3.2和PsNPR3.3,其长度分别为2 442、1 827、2 244和2 615 bp,其ORF长度分别为1 788、1 770、1 767和1 782 bp,分别编码596、590、589和594个氨基酸的蛋白质;氨基酸序列比对结果表明,■这4个NPR1同源基因的编码区均含有BTB/POZ和ANK两个保守域及核定位信号(NLS);PsNPR1与拟南芥的AtNPR1和At NPR2聚为一簇,PsNPR3.1、PsNPR3.2和PsNPR3.3与拟南芥的AtNPR3和At NPR4聚为另一簇。PsNPR1在喷施1.0 mmol·L^-1水杨酸的叶片中表达量最高;PsNPR1、PsNPR3.1、PsNPR3.2在响应1.0 mmol·L^-1水杨酸诱导过程中表达量持续上升,30h表达量最高,之后呈下降趋势,因此,水杨酸诱导抗病基因高表达的最佳处理浓度为1.0 mmol·L^-1,最佳响应时间为30 h。     

石蒜鳞茎膨大过程中内源激素相关基因的差异表达研究

石蒜(Lycorisradiata)鳞茎自然膨大过程很慢,严重制约其商业化生产的发展,研究鳞茎膨大过程中内源激素的变化规律,能够为利用外施生长调节剂调控石蒜鳞茎的膨大提供理论依据。本研究通过构建同一遗传背景下的石蒜鳞茎膨大过程材料,研究鳞茎膨大过程中4种内源激素:生长素(IAA)、细胞分裂素(CK)、赤霉素(GA)以及脱落酸(ABA)含量的变化,并通过转录组测序的方式,研究此过程中内源激素合成及信号转导基因表达的变化。结果表明:内源GA能够负调控石蒜鳞茎的膨大,而内源IAA和CK正向调控,但IAA的作用时期可能更多集中于鳞茎膨大早期,且可能通过调控CK的合成及信号转导过程来发挥作用,内源ABA可能在石蒜鳞茎膨大的调控过程中作用不大。另外,还发现茉莉酸(JA)和水杨酸(SA)相关基因在石蒜鳞茎膨大过程中表达上调,暗示JA和SA的调控作用可能与石蒜鳞茎的膨大呈正相关。     

解淀粉芽孢杆菌BaA-007鉴定及其对苹果腐烂病的抑制作用

从苹果韧皮组织分离获得1株潜在的生防菌菌株。基于形态和16S rDNA、gyrA鉴定其为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens),命名为BaA-007(中国农业微生物菌种保存中心,菌种编号:ACCC60382)。该菌株及其次生代谢物对苹果腐烂病菌(黑腐皮壳菌,Valsa mali)生长具有抑制作用,离体条件下可显著降低腐烂病病斑的扩散速度。以BG培养基为基础培养基,筛选其最佳培养条件为蔗糖0.5%、细菌学蛋白胨1%、硫酸二氢钾0.1%、温度36℃、pH 7.0。BaA-007处理后,苹果水杨酸(SA)响应性基因PR1、PR2和NPR1,茉莉酸(JA)响应性基因PDF1.2、CORONATINE INSENSITIVE 1(COI1)和AOS,乙烯(ET)响应性基因ETR1、ERF1和HEL以及几丁质合成酶B基因(Chitnase B,ChiB)在接种处理后的不同时间点均上调。综上所述,菌株BaA-007对苹果腐烂病有显著的拮抗效果,有望作为防治苹果腐烂病制剂开发的生防菌株。     

杜梨根茎叶特异表达基因的RNA-Seq分析

利用RNA-Seq技术,对杜梨根、茎、叶中特异表达的基因进行了筛选和分析,为探讨梨属植物生长发育及组织间功能差异的分子机制提供理论依据。研究结果表明,杜梨根、茎、叶中分别获得了19 443、19 567、17 876个表达基因,分别注释得到110、110、110个GO功能分类和56、55、65条KEGG代谢途径,主要涉及能量代谢、物质代谢和运输、激素调控、信号转导等多种生物学功能;其中在根、茎、叶中特异表达的基因分别有1 245、971、846个,涉及8、8、11条显著富集的代谢通路,主要集中在亚麻酸、脂肪酸类、糖类等生物大分子物质和各种次生物质的代谢过程以及其他氧化还原、激素信号转导等途径;根、茎、叶中分别有10、6、20个特异表达基因参与调控激素信号转导途径,叶片中特异表达的15个编码合成SAUR蛋白基因,大部分在幼叶中表达较高,并伴随叶片衰老表达量下调;同时,在根、茎、叶中分别得到1 353、1 150、1 232个转录因子,较多WRKY、MYB、AP2-EREBP等家族的转录因子在根中特异表达。选出8个特异表达基因进行qRT-PCR验证,结果与RNA-Seq数据基本一致,表明了RNA-Seq分析是可靠的;综合上述结果,认为特异表达基因可能对维持组织器官的特定功能起重要作用。     

葡萄SPL9和SPL10基因全长cDNA克隆、亚细胞定位和表达分析

 从‘夏黑’葡萄（Vitis vinifera × V. labrusca ‘Summer Black’）中克隆了SBP（Squamosa promoter binding protein）类重要转录因子基因SPL9和SPL10全长cDNA序列,在GenBank的登录号分别是HM018600和HM018601,序列分析表明二者均具备完全保守的核定位信号序列（KKSR）、SBP结构域以及葡萄microRNA156a（Vv-miR156a）的靶序列。进一步构建Vv-SPL9和Vv-SPL10亚细胞定位表达载体,对其是否具有核定位功能进行了研究,并利用半定量、荧光定量RT-PCR研究了这两个基因与Vv-miR156a在葡萄不同组织的表达情况。结果表明：转录因子SPL9和SPL10均定位于细胞核中,而且两个基因在葡萄各个组织中均有表达,但表达量存在差异,两者均在小果中的表达量最高。Vv-miR156a的积累水平与这两个基因在各个组织中的表达呈现一定的消长关系,并且在小果中最为明显。     

欧洲葡萄中CIPK基因的克隆及表达分析

以欧洲葡萄‘佳丽酿’(Carinena)为材料,利用RT-PCR方法获得两个CIPK基因的全长cDNA序列,分别为VvCIPK13和VvCIPK14。VvCIPK13全长为1 501 bp,包括一个1 395 bp的ORF,编码465个氨基酸;VvCIPK14全长为1 616 bp,包括一个1 404 bp的ORF,编码468个氨基酸。生物信息学分析表明两个蛋白均含有两个保守结构域:丝氨酸/苏氨酸激酶结构域和NAF结构域,两个结构域之间有连接域,但VvCIPK13和VvCIPK14的同源性较低,仅有40.33%。利用荧光定量PCR技术研究VvCIPK13和VvCIPK14在葡萄不同组织、植物生长调节剂诱导和逆境胁迫下的表达模式,结果表明:VvCIPK13和VvCIPK14表达具有组织特异性,均在卷须中高表达;VvCIPK13对6-BA诱导有响应,而VvCIPK14对6-BA、ABA、IAA、SA、MeJA和GA_3等诱导均有不同程度的响应;VvCIPK13和VvCIPK14均响应高盐和干旱,但不响应低温,其中VvCIPK14的响应最为强烈。推测VvCIPK13和VvCIPK14在葡萄的非生物胁迫过程中发挥重要的作用。     

‘藤稔’葡萄冬季休眠后期花芽发育相关基因表达的分析

 以6 年生‘藤稔’葡萄（Vitis vinifera L.‘Fujiminori’）为试材,在枝条不同节位进行短截 处理,对9 个花发育相关基因的时空表达进行研究。结果表明,在冬季休眠后期虽然VvAP1、VvAP2、VvAP3、 VvAG、VvFUL、VvSOC1、VvLFY 和VvFLC 基因的相对表达水平较低,但冬芽仍可进行花芽分化;短截 处理可以促进花发育,增加各节位芽中基因的相对表达量;同一枝蔓上的中部芽比上部芽和下部芽发育 好,基因相对表达量高,花芽生长发育时间长。     

利用葡萄氮代谢基因的表达评价不同氮肥肥效

以‘夏黑’葡萄(Vitis labruscana‘Black Summer’)为试材,选择两个生长关键时期(成花期与转色期),利用半定量RT-PCR和荧光定量PCR技术对5个氮代谢基因(VvGHD、VvNiR、VvNR、VvGS和VvAS)在叶面喷施不同氮肥处理后的表达情况进行分析,并对葡萄新梢增长量、叶面积增长量、落花落果率、果实大小等指标进行统计分析。两个时期叶面喷施不同浓度5种氮肥后,5个基因的表达量整体呈现出增高趋势,因喷施氮肥不同,同一基因在响应强度和时间上存在差异,基因响应强度大、时间长的肥料对葡萄生理性状的提高也较显著。综合基因表达与生理变化两方面验证,得出尿素、硝酸铵对葡萄生长发育所起肥效最好,硝酸钙有助于减少落花落果率,硫酸铵与硝酸钠相对肥效较差。