表达H5亚型禽流感病毒不同形式HA基因重组鸭瘟病毒的构建及HA表达形式的鉴定

为研究禽流感病毒(AIV)血凝素(HA)基因的信号肽以及跨膜区对HA蛋白在重组病毒中表达的影响,本研究以鸭瘟病毒(DEV)为载体,在DEV基因组的US7和US8基因之间通过同源重组插入去除信号肽或跨膜区的H5N1亚型AIV HA基因编码序列,分别构建了缺失信号肽HA基因的DEV重组病毒(r DEV-PK)和缺失跨膜区HA基因的DEV重组病毒(r DEV-PSM),并传至20代,经PCR对插入的外源基因编码序列扩增及序列测定,表明外源基因能够在重组病毒基因组中稳定存在;间接免疫荧光和western blot鉴定结果表明去除信号肽的HA蛋白能够在重组病毒感染的鸡胚成纤维细胞浆中正确表达,而去除跨膜区的HA蛋白能够在感染细胞的培养液中检测到。本研究为表达H5N1亚型AIV HA基因重组DEV载体弱毒疫苗在鸭体内免疫机制的进一步研究奠定基础。     

鸭瘟病毒疫苗株UL44.5和UL44基因间隔区作为复制非必需区的鉴定

为探寻鸭瘟病毒(DEV)基因组中适合外源基因插入的复制非必需区,本研究利用本实验室前期建立的DEV疫苗株多片段拯救系统,结合E/T克隆技术、LR克隆技术将含有红色荧光蛋白(RFP)表达框架的目的片段,定向插入到含DEV基因组复制非必需区的粘粒中,该位点位于DEV基因组UL区的UL44.5和UL44之间,拯救获得了重组病毒(rDEV)。通过PCR和荧光显微镜鉴定该重组病毒。结果显示,经PCR扩增,r DEV可以扩增到预期目的片段,观察可见红色荧光,表明RFP基因能够在重组病毒中稳定存在并正确表达;生长动力学结果显示,重组病毒在CEF中的增殖效率与DEV疫苗株无显著差异。将r DEV以105 TCID50的剂量免疫SPF鸭后,DEV攻毒保护试验结果显示,r DEV和亲本株DEV活疫苗对SPF鸭的保护效率均为100%。本研究筛选到DEV基因组中的一个可供外源基因插入的位点,为以DEV为载体构建相关重组疫苗研制提供依据。     

河北省猪星状病毒4型全基因组测定及遗传进化分析

为了解河北省流行的猪星状病毒(PAstV)遗传特性和重组现象,设计了7对特异性扩增引物,利用RT-PCR方法进行全基因组序列扩增;应用DNAStar软件和MEGA 7.0软件对扩增得到的序列进行拼接和核苷酸同源性分析,并建立基于全基因组和ORF2基因的系统进化树;利用生物学分析软件对全基因组序列结构特点和重组现象进行分析。结果显示,成功扩增得到1株PAstV4 HB-SJZ全基因组序列;全基因组遗传分析显示,HB-SJZ株与PAstV4参考毒株同源性显著高于其他基因型毒株,为74.2%～81.0%,与匈牙利4型毒株WBAstV-1同源性最高(81.0%);基于ORF2基因分析显示,HB-SJZ株与PAstV4参考毒株同源性为64.8%～68.9%,与日本毒株PoAstV-VIRES-GX03-C3遗传关系最近(68.9%);重组分析显示,HB-SJZ株的ORF1基因与JPN Bu5 2014株和JPN Mol2-3 2015株存在重组现象。这一研究提示河北省流行的PAstV4是同物种重组毒株,为该病的流行病学调查提供科学依据,也为该病的防控提供理论基础。     

藏猪源捷申病毒的检测和遗传演化分析

旨在调查四川地区藏猪捷申病毒（porcine teschovirus,PTV）的流行及分子特征和遗传演化。用RT-PCR法对2017-2018年采自四川省甘孜藏族自治州康定市14个藏猪场96份粪便样品进行检测,并对全基因组进行序列分析和基因分型。PCR检测结果表明,PTV核酸阳性率为20.8%（20/96,95% CI=13.2%~30.3%）,14个规模藏猪场中PTV猪场阳性率为57.1%（8/14,95% CI=28.9%~82.3%）,并从2份阳性样本中获得了2条近似全长的PTV全基因组序列,分别命名为SWU-E5-2018和SWU-ZG2-2018,核苷酸序列相似性为83.1%。通过VP1序列分析发现2条序列的血清型分别为3型和6型。通过基因重组分析发现SWU-E5-2018存在重组现象,重组区域位于衣壳蛋白基因P1的552-3 082 nt处。为了进一步研究2条PTV序列的演化过程,以贝叶斯进化分析软件进行分歧时间估算,结果表明,SWU-E5-2018的分歧时间约为2010年,SWU-ZG2-2018的分歧时间约为2011年。本研究首次对藏猪源PTV进行了初步调查,结果表明藏猪中存在一定程度的PTV感染,为深入研究藏猪源PTV遗传变异及其生物学特性提供了参考依据。     

藏猪源捷申病毒的检测和遗传演化分析

旨在调查四川地区藏猪捷申病毒(porcine teschovirus, PTV)的流行及分子特征和遗传演化。用RT-PCR法对2017—2018年采自四川省甘孜藏族自治州康定市14个藏猪场96份粪便样品进行检测,并对全基因组进行序列分析和基因分型。PCR检测结果表明,PTV核酸阳性率为20.8%(20/96,95%CI=13.2%～30.3%),14个规模藏猪场中PTV猪场阳性率为57.1%(8/14,95%CI=28.9%～82.3%),并从2份阳性样本中获得了2条近似全长的PTV全基因组序列,分别命名为SWU-E5-2018和SWU-ZG2-2018,核苷酸序列相似性为83.1%。通过VP1序列分析发现2条序列的血清型分别为3型和6型。通过基因重组分析发现SWU-E5-2018存在重组现象,重组区域位于衣壳蛋白基因P1的552—3 082 nt处。为了进一步研究2条PTV序列的演化过程,以贝叶斯进化分析软件进行分歧时间估算,结果表明,SWU-E5-2018的分歧时间约为2010年,SWU-ZG2-2018的分歧时间约为2011年。本研究首次对藏猪源PTV进行了初步调查,结果表明藏猪中存在一定程度的PTV感染,为深入研究藏猪源PTV遗传变异及其生物学特性提供了参考依据。     

鸭瘟病毒疫苗株基因组复制非必需区的筛选

为探寻鸭瘟病毒(DEV)基因组中的复制非必需区,本研究在已建立的DEV疫苗株5粘粒拯救系统的基础上,利用转座子随机插入技术,将含eGFP表达框架的基因片段随机插入DEV US区,救获两株表达绿色荧光蛋白的重组DEV(rDEV-us7eGFP、rDEV-us8us1eGFP)。将两株重组病毒在鸡胚成纤维细胞中连续传至20代后,通过PCR、荧光表达鉴定分析,结果显示gfp基因能够在重组病毒中稳定存在并正确表达;生长动力学结果表明,重组病毒在CEF中的增殖效率与DEV疫苗株无显著差异。攻毒保护实验结果表明,将rDEV-us7eGFP和rDEV-us8us1eGFP以10~5TCID_(50)的剂量免疫SPF鸭后,其对鸭瘟强毒攻击的保护效率与DEV疫苗株一致,均为100%。本研究成功筛选到DEV基因组中的两个可供外源基因插入的复制非必需区,分别位于us7基因内部及us8与us1基因之间,为以DEV为载体构建相关重组疫苗奠定了重要基础。     

鸭肠炎病毒基因组末端的克隆及序列分析

根据已知的鸭肠炎病毒基因组序列设计2对引物RTLT1、RTLT2,取基因组自连产物进行PCR反应,分别得到全长16071、978 bp的序列。将PCR产物克隆至pMD18-T载体,对重组质粒进行PCR和酶切鉴定,将阳性质粒测序,结果显示2对引物扩增的重叠序列部分完全一致。该段序列G+C含量高达75%,含有大量直接和反向重复序列,并发现4个末端特征序列,分别为具有回文结构的α序列、包含两测末端接合位点的β序列、高度保守序列的γ序列和AnTn序列。将该序列与马疱疹病毒Ⅰ型(EHV-1)、牛疱疹病毒Ⅰ型(BHV-1)、水痘带状疱疹病毒(VZV)、猪伪狂犬病毒(PRV)末端序列进行比较,证实所得到的序列为鸭肠炎病毒基因组末端序列,这些特征序列的发现对进一步了解DEV复制机制有很大帮助。     

鸭肠炎病毒UL41基因缺失株的构建及其体外增殖能力分析

旨在构建鸭肠炎病毒（DEV）UL41基因缺失毒株,并对其生物学特性进行分析,本研究以克隆有DEV UL41基因的重组黏粒D1为骨架,利用Red/ET重组技术构建缺失UL41基因的重组黏粒D1 dUL41;将UL41基因缺失重组黏粒D1 dUL41与其他4个克隆有DEV基因组片段的亲本黏粒共转染鸭胚成纤维细胞（DEF）,拯救获得UL41基因缺失毒株rDEV-SD19/dUL41。将该基因缺失病毒感染DEF后,提取病毒基因组进行PCR鉴定及测序,并利用间接免疫荧光试验检测该病毒感染细胞中UL41基因表达情况;绘制拯救的基因缺失病毒的生长曲线,分析其体外复制特性。PCR及测序结果显示,本研究成功构建了缺失UL41基因的重组黏粒D1 dUL41。将该基因缺失黏粒与其他含有DEV基因组的亲本黏粒共转染DEF后能够产生典型的蚀斑病变。PCR及测序结果显示,UL41基因成功从DEV基因组中缺失;间接免疫荧光试验发现,基因缺失病毒rDEV-SD19/dUL41感染DEF后,未见UL41蛋白表达。综上表明,本研究成功构建了DEV UL41基因缺失病毒。体外生长曲线显示,rDEV-SD19/dUL41在DEF中的复制能力明显低于亲本病毒,提示UL41蛋白在DEV复制中发挥重要作用。UL41基因缺失DEV的构建为进一步研究UL41基因在DEV感染和致病中的作用机制奠定了基础。     

广西壮族自治区猪圆环病毒2型（PCV2）分子流行病学调查及遗传变异分析

[目的]了解猪圆环病毒2型（porcine circovirus type 2,PCV2）在广西壮族自治区的流行情况及遗传特征。[方法]采用PCR方法对广西壮族自治区不同地区送检的病料进行PCV2检测和全基因组序列扩增。应用BioEdit、Mega 7.0、RDP 5和SimPlot(ver 3.5.1)软件对获得的24株PCV2毒株全基因组序列进行核苷酸序列相似性、遗传变异和重组分析,并对Cap蛋白氨基酸序列变异位点进行分析。[结果]PCV2广西株基因组大小均为1 768 bp;核苷酸序列相似性分析显示,广西株与参考株PCV1～PCV4的相似性在44.7%～99.7%,与PCV3亲缘性最低;广西株为PCV2b和PCV2d型,PCV2d流行最为广泛;全基因组序列重组分析显示,部分广西株存在重组事件;与疫苗株AY686764-PCV2b和HM641752-PCV2b相比,PCV2广西株的Cap蛋白氨基酸序列共有21个位点发生变异。[结论]PCV2广西流行毒株以PCV2d型为主,部分毒株具有重组现象,部分位点发生独特的氨基酸变异,遗传进化趋势明显。研究结果为广西壮族自治区PCV2的流行病学...     

两株猪细环病毒的全基因组序列分析

为了研究猪细环病毒(Torque teno sus virus, TTSuV)的流行及遗传变异情况,试验采用PCR方法对从河南省南阳市某规模化养猪场采集的疑似TTSuV阳性猪的淋巴结、肺脏、血清等样品进行检测,并对TTSuV1阳性样品进行全基因组序列测定、同源性分析、遗传进化分析和基因重组分析。结果表明：试验成功从样品中鉴定出2株TTSuV1毒株,其全基因组序列长度分别为2 906,2 920 bp,分别命名为HeN1-A9株和HeN1-A11株。两毒株与GenBank中TTSuV1型参考毒株的同源性为68.8%～96.0%,与GenBank中TTSuVk2型参考毒株同源性为46.8%～47.6%,两毒株之间的同源性为86.4%。基于TTSuV1全基因组序列构建的遗传进化树分析,两毒株均属于TTSuV1c亚型;而基于TTSuV1第3段基因组序列构建的遗传进化树分析,两毒株均属于TTSuV1b亚型。两毒株均是重组毒株,以西班牙的G21株(GU570201)为亲本毒株,我国的LNJZ株(KT968712)提供重组片段,重组位点分别位于基因组2 195～2 530 bp和2 147～2 65...     

表达红色荧光蛋白的重组鸭肠炎病毒的构建及鉴定

鸭肠炎病毒(Duck enteritis virus, DEV),又称为鸭瘟病毒,是一种只感染雁形目禽类的疱疹病毒。DEV具有基因组大、非必需基因多、能插入外源基因的容量大、遗传稳定等优点,其庞大而复杂的基因组为外源基因提供了诸多可插入位点,以DEV为载体,成功表达了禽流感病毒HA蛋白_^[1]、鸭病毒性肝炎病毒VP0蛋白_^[2]、鸭坦布苏病毒E基因_^[3]以及鹅细小病毒VP2蛋白_^[4]。构建重组DEV的重要一步是将报告基因插入到基因组中,目前常用的报告基因有绿色荧光蛋白(GFP)、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)、红色荧光蛋白(RFP)以及LacZ报告基团。本研究用RFP报告基团插入DEV UL2基因中,获得表达红色荧光的重组病毒,一步生长曲线表明,RFP对DEV的生长无影响;连续传代12代,RFP能够稳定表达,为DEV载体研究奠定基础。     

Cloning and sequence analysis of US1gene in duck enteritis virus

In this paper,a 1,860 bp sequence in IRs region of duck enteritis virus(DEV) was amplified by single oligonucleotide nested PCR with a single primer designed according to partial sequence of US1 and then a pair of primers designed according to the 3' UTR of US8 gene and 5' end of the new getting sequence were used to amplify a 2,426 bp sequence toward the TRs region.Sequence analysis revealed that the both sequences contained an identical 990 bp open reading frame of DEV US1 gene.The two ORFs were in opposi...     

鸭肠炎病毒囊膜蛋白gB和gC主要抗原域的原核表达与鉴定

根据GenBank中已经发表的鸭肠炎病毒(DEV)基因组序列,在抗原性分析的基础上,设计5对引物,以DEV标准强毒株DPV-F37基因组DNA作为模板分别扩增DEV gB基因主要抗原域编码区(328～552 nt、667～1 164 nt和1 519～1 797 nt)和gC基因主要抗原域编码区(67～402 nt和472～837 nt).将目的片段克隆入原核表达载体pGEX-6P1中获得重组表达栽体pGEX-6P1-gB1、pGEX-6P1-gB2、pGEX-6P1-gB3、pGEX-6P1-gC1和pGEX-6P1-g02.将重组表达载体转化至BL21宿主菌,经IPTG诱导,外源基因获得了良好表达,融合蛋白大小分别为35、45、37、38和40ku左右.以兔抗DEV多抗血清进行Western blot分析,抗血清与表达的5种融合蛋白均能发生特异性反应.结果提示所有表达出的目的蛋白均具有与天然蛋白相似的反应原性.     

含绿色荧光蛋白基因的鸭肠炎病毒SD-01株US2基因缺失转移载体的构建

以鸭肠炎病毒(DEV)SD-01株DNA为模板,根据Gen Bank上已发表的基因序列设计一对引物,利用PCR技术扩增出US2全基因,将PCR产物连入pGM-T载体。用BamHI和EcoR V双酶切重组载体,使US2基因缺失约130bp,将含双loxP酶切位点的EGFP完整表达盒插入BamH I和EcoR V酶切位点之间,成功构建了以US2基因为重组臂的含EGFP基因的转移质粒载体pUS2-loxP-EGFP-loxP。     

鸭肠炎病毒UL41、UL42基因的克隆与分析

依据GenBank登录的鸭肠炎病毒(DEV)核苷酸序列设计引物,利用长片段PCR技术扩增了DEV基因组UL36与UL43基因之间的未知序列,扩增所得片段长度约为15 kb.经EcoRV单酶切,将其中的3.9 kb片段克隆到pUC18中.序列分析表明该3.9 kb EcoR V片段含有2个完整的转录方向相反的与单纯疱疹病毒(HSV)UL41和UL42基因同源的ORF,命名为DEV UL41和ULA2基因.通过氨基酸序列比对发现:DEV UL41基因含有5个高度保守位点,而UL42含有2个,进化树分析表明DEV与疱疹病毒科a疱疹病毒亚科的马立克病毒、火鸡疱疹病毒的进化关系非常相近,为DEV的分类提供了参考依据.     

Efficient strategy for constructing duck enteritis virus-based live attenuated vaccine against homologous and heterologous H5N1 avian influenza virus and duck enteritis virus infection

Duck is susceptible to many pathogens, such as duck hepatitis virus, duck enteritis virus (DEV), duck tembusu virus, H5N1 highly pathogenic avian influenza virus (HPAIV) in particular. With the significant role of duck in the evolution of H5N1 HPAIV, control and eradication of H5N1 HPAIV in duck through vaccine immunization is considered an effective method in minimizing the threat of a pandemic outbreak. Consequently, a practical strategy to construct a vaccine against these pathogens should be determined. In this study, the DEV was examined as a candidate vaccine vector to deliver the hemagglutinin (HA) gene of H5N1, and its potential as a polyvalent vaccine was evaluated. A modified mini-F vector was inserted into the gB and UL26 gene junction of the attenuated DEV vaccine strain C-KCE genome to generate an infectious bacterial artificial chromosome (BAC) of C-KCE (vBAC-C-KCE). The HA gene of A/duck/Hubei/xn/2007 (H5N1) was inserted into the C-KCE genome via the mating-assisted genetically integrated cloning (MAGIC) to generate the recombinant vector pBAC-C-KCE-HA. A bivalent vaccine C-KCE-HA was developed by eliminating the BAC backbone. Ducks immunized with C-KCE-HA induced both the cross-reactive antibodies and T cell response against H5. Moreover, C-KCE-HA-immunized ducks provided rapid and long-lasting protection against homologous and heterologous HPAIV H5N1 and DEV clinical signs, death, and primary viral replication. In conclusion, our BAC-C-KCE is a promising platform for developing a polyvalent live attenuated vaccine.

Electronic supplementary material

The online version of this article (doi:10.1186/s13567-015-0174-3) contains supplementary material, which is available to authorized users.     

鸭肠炎病毒gL蛋白在鸡胚成纤维细胞中动态表达的检测

为研究鸭肠炎病毒(DEV)gL蛋白在感染鸡胚成纤维细胞(CEF)过程中的表达情况,本研究以DEVClone-03基因组为模板,应用PCR方法分别扩增得到截短的(gLt,181 bp～711 bp)和全长的gL(1 bp～711 bp)两个基因片段。将gLt基因片段克隆至pET-30a原核表达载体,转化E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达并对表达产物进行纯化复性,免疫BALB/c小鼠,制备鼠抗gL蛋白多克隆抗体。同时将全长gL基因克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+),构建真核表达重组质粒pcDNA-gL,转染293T细胞。采用获得的抗gL蛋白抗体检测DEV感染CEF后及真核表达质粒pcDNA-gL转染293T细胞后gL蛋白在不同时间点的表达情况。结果表明,在pcDNA-gL转染293T细胞后12 h应用western blot方法能够检测到gL蛋白的表达,其表达量随着转染时间增加而增加;在病毒感染CEF后24 h应用间接免疫荧光方法能够检测到gL蛋白少量的表达,western blot方法在病毒感染CEF48 h后检测到gL蛋白的表达,其表达量随着病毒感染时间增加而增加。上述结果提示,编码gL蛋白基因可能是病毒复制的晚期表达基因。     

Identification and characterization of duck enteritis virus dUTPase gene

Deoxyuridine triphosphatase (dUTPase) is a ubiquitous and important enzyme that hydrolyzes dUTP to dUMP. Many viruses encode virus-specific dUTPase, which plays an essential role in maintaining the integrity of the viral DNA both by reducing the dUTP levels and by providing the substrate for the thymidylate synthase. A 1344-bp gene of duck enteritis virus (DEV) homologous to herpesviral dUTPase was first reported in this paper. The gene encodes a protein of 477 amino acids, with a predicted molecular mass of 49.7 kDa. Multiple sequence alignment suggested that DEV dUTPase was quite similar to other identified herpesviral dUTPase and functioned as a homotrimer. The five conserved motifs of DEV dUTPase with 3-1-2-4-5 arrangement have been recognized, and the phylogenetic analysis showed that DEV dUTPase was genetically close to the avian herpesvirus. Furthermore, RNA dot blot, western blot, and immunofluorescence analysis indicated that the enzyme was expressed at early and late stages after infection. Immunofluorescence also confirmed that DEV dUTPase localized in the cytoplasm of DEV-infected duck embryo fibroblasts as early as 4 hr postinfection (hpi). Later, the enzyme transferred from cytoplasm to nucleus at 8 hpi, and then reached its expression peak at 12 hpi, both in the cytoplasm and nucleus. The results suggested that the DEV dUTPase gene might be an early viral gene in DEV vitro infection and contribute to ensuring the fidelity of genome replication.     

Molecular characterization of duck enteritis virus CHv strain UL49.5 protein and its colocalization with glycoprotein M

The UL49.5 gene of most herpesviruses is conserved and encodes glycoprotein N. However, the UL49.5 protein of duck enteritis virus (DEV) (pUL49.5) has not been reported. In the current study, the DEV pUL49.5 gene was first subjected to molecular characterization. To verify the predicted intracellular localization of gene expression, the recombinant plasmid pEGFP-C1/pUL49.5 was constructed and used to transfect duck embryo fibroblasts. Next, the recombinant plasmid pDsRed1-N1/glycoprotein M (gM) was produced and used for co-transfection with the pEGFP-C1/pUL49.5 plasmid to determine whether DEV pUL49.5 and gM (a conserved protein in herpesviruses) colocalize. DEV pUL49.5 was thought to be an envelope glycoprotein with a signal peptide and two transmembrane domains. This protein was also predicted to localize in the cytoplasm and endoplasmic reticulum with a probability of 66.7%. Images taken by a fluorescence microscope at different time points revealed that the DEV pUL49.5 and gM proteins were both expressed in the cytoplasm. Overlap of the two different fluorescence signals appeared 12 h after transfection and continued to persist until the end of the experiment. These data indicate a possible interaction between DEV pUL49.5 and gM.