圆斑星鲽MHC IIB基因结构、多态性及组织表达分析

通过表达序列标签法和cDNA末端快速扩增(RACE)技术,分离和克隆了圆斑星鲽(Verasper variegatus)主要组织相容性复合体(MHC)IIB的全长cDNA序列,该cDNA全长为1144bp,5'UTR(untranslated region)为7bp,3'UTR为450bp,开放阅读框(ORF)长度为687bp,可编码228个氨基酸,包含信号肽、抗原结合域(β1)、IGC区(β2)、跨膜区和胞质区5个结构域。同源分析表明,圆斑星鲽MHCIIB氨基酸序列与其他硬骨鱼具有49%～79%的同源性,与鼠、人、红原鸡和护士鲨的相似性较低,分别为34%、33%、31%和30%。圆斑星鲽MHC ⅡB基因含有5个内含子,与其他硬骨鱼不同,其β2结构域编码区内存在1个109bp的内含子。根据获得的MHC ⅡB基因组序列设计特异性引物,在10尾野生圆斑星鲽中扩增了包括完整内含子1和外显子2的长度约388bp的DNA片段,PCR产物直接测序后发现在270bp的抗原结合域中共有23个位点发生变异,密码子第1位和第2位的变异明显高于第3位。利用荧光定量PCR分析组织表达发现,MHCIIB基因在健康圆斑星鲽9种组织中均有...     

圆斑星鲽MHCⅠα基因的克隆与组织表达分析

采用表达序列标签法和cDNA末端快速扩增(RACE)技术,成功获得了圆斑星鲽主要组织相容性复合体MHC Ⅰα的全长cDNA序列.该cDNA全长2171 bp,5'UTR为20 bp,3'UTR为1053bp,开放阅读框(ORF)长度为1098 bp,可编码365个氨基酸,包含信号肽、抗原结合域(α1、α2),IGC类似...     

金钱鱼MHC II β 基因结构、多态性与组织表达分析

为探究金钱鱼(Scatophagus argus)MHC Ⅱβ基因的结构和特性,采用同源克隆和RACE等技术,在获得cDNA全序列的基础上,分析其内含子序列、基因多态性和组织表达情况。结果表明,金钱鱼MHC IⅡβ基因cDNA序列全长1172 bp,其中5′UTR长34 bp,3′UTR长388 bp,开放阅读框(ORF)长750 bp,编码249个氨基酸,包含信号肽、β1结构域、β2结构域、连接肽(CP)、跨膜区(TM)和胞质区(CYT);MHC Ⅱβ基因由6个外显子和5个内含子组成,其中内含子3将β2结构域分开。从43尾金钱鱼的209个有效克隆中,获得209条不同的核苷酸序列,可归为48个等位基因主型,分别命名为Scar-DXB*0101~Scar-DXB*4801,揭示金钱鱼MHC Ⅱβ基因的多态性很丰富。RT-PCR检测发现,金钱鱼MHC Ⅱβ基因在所检测的11种组织中均有表达,其中在脾、鳃、肠和皮肤中表达量较高,在肾、胃、心脏表达量中等,而在眼、脑、肝、肌肉中表达量较低。对健康金钱鱼人工感染嗜水气单胞菌后,发现其MHC Ⅱβ基因在肝、脾、鳃、肾等组织中的表达量均发生了不同程度的变化,证明该基因在金钱鱼免疫反应中有重要作用。在NJ法构建的系统树中,金钱鱼与舌齿鲈、大西洋鲑等硬骨鱼类的亲缘关系相对较近,而与铰口鲨、原鸡、小鼠、人等的亲缘关系则依次渐远。     

圆斑星鲽sox9基因的克隆与表达

本研究筛选到圆斑星鲽(Verasper variegatus)的性别相关基因sox9,并通过RACE技术获得了全长序列,基因全长为3287 bp,包括1431 bp的ORF,编码477个氨基酸,368 bp的5¢ UTR和1488 bp的3¢ UTR。在3¢ UTR中有多聚腺苷酸尾和加尾信号AATAAA。通过荧光定量PCR测定了sox9基因在圆斑星鲽成鱼不同组织中的表达水平,发现sox9基因在圆斑星鲽的脑、眼、鳃、心、肝、胆、肠、精巢、卵巢、肾和肌肉等各个组织中都有不同程度的表达。在鳃、脑和精巢组织中检测到较高水平的sox9转录,其中精巢中的转录水平显著高于其他组织,sox9基因在性腺中的表达显示出性别两相性差异。其在精巢中的表达水平要显著高于卵巢,说明sox9基因与雄性性腺发育相关。通过测定sox9基因在圆斑星鲽幼鱼不同发育时期(20、30、40、50、60、70和80日龄)的表达水平,发现其在20~50日龄表达量逐渐下降,在60日龄时表达量上升,推测表达量上升可能与幼鱼性腺分化相关。     

圆斑星鲽piwil2基因的克隆与表达分析

本研究采用RACE末端扩增方法,得到全长为3872 bp的圆斑星鲽(Verasper variegatus) piwil2基因序列,命名为Vvpiwil2,开放阅读框(ORF)长为3192 bp,编码1063个氨基酸,5?-UTR和3?-UTR的长度分别140 bp和540 bp。基于ExPASy、SMART、Signal4.1和NCBI的保守结构域(CDD)数据库在线分析对蛋白序列结构进行预测,推断Vvpiwil2编码的氨基酸分子量为118.6 kDa,理论等电点为9.02,无跨膜结构及信号肽,有3个结构域：ArgoL1结构域、PAZ结构域及PIWI结构域。利用实时荧光定量PCR技术对圆斑星鲽不同发育时期的胚胎、仔稚鱼以及雌雄成鱼的不同组织表达模式进行分析。结果显示,Vvpiwil2基因从胚胎发育早期至高囊胚期均大量表达,之后呈下降趋势,直至孵化阶段。由于胚胎从卵裂至囊胚时期的发育过程主要受细胞质成分引导,直至原肠早期,mRNA开始大量转录合成,实现由母源型向合子型的过渡,推断Vvpiwil2是母源性基因。孵化后仔稚鱼68 d时,Vvpiwil2基因表达量显著高于其他时期,表明Vvpiwil2的功能可能与圆斑星鲽性腺分化过程相关;Vvpiwil2基因在雌雄成鱼性腺中的表达量显著高于其他组织,且卵巢中的表达量显著高于精巢,推测Vvpiwil2基因在卵巢功能的维持中发挥重要作用。本研究结果为解析圆斑星鲽性别决定机制提供了新的靶标基因,为建立全雌化苗种繁育技术打下坚实的理论基础。     

圆斑星鲽促性腺激素释放激素基因克隆及表达特性

采用RACE技术,在圆斑星鲽(Verasper variegatus)脑中克隆到3种GnRH基因的cDNA序列: cGnRH-Ⅱ、sGnRH和sbGnRH.每种GnRH都包括1个信号肽、1个Gly-Lys-Arg连接序列和1个GnRH相关肽.其中, cGnRH-Ⅱ的cDNA全长为568 bp,编码85个氨基酸, ORF为255 bp,5′UTR为141 bp,3′UTR为169 bp.sGnRH的cDNA全长为457 bp,编码90个氨基酸, ORF为270 bp,5′UTR为41 bp,3′UTR为143 bp.sbGnRH的cDNA全长为381 bp,编码98个氨基酸, ORF为294 bp,5′UTR为48 bp,3′UTR为36 bp.分析了3种GnRH基因的编码氨基酸序列与其他脊椎动物的同源性,圆斑星鲽 GnRH 与鲽形目鱼类氨基酸同源性最高,其次为鲈形目鱼类.对3种 GnRH 基因的系统进化分析表明,圆斑星鲽 GnRH 基因与其他鲽形目鱼类亲缘关系最近,其次为鲈形目、鲑形目和鳗鲡目鱼类.荧光定量PCR分析表明,3种GnRH基因都在脑中表现出最高表达水平且具有性别特异性表达模式:雌性中不同组织的 GnRH mRNA 表达水平都相应高于雄性.组织表达分析表明, cGnRH-Ⅱ的 mRNA 仅在脑中表达,而sbGnRH在各个组织都有表达, sGnRH仅在脑、垂体和性腺中表达.脑中sbGnRH mRNA的表达水平在卵巢成熟过程中变化显著(P<0.05),而其他两种GnRH的mRNA表达水平变化不显著(P>0.05).本研究首次在圆斑星鲽脑中克隆到3种GnRH基因,其组织和季节表达水平变化表明sbGnRH可能是圆斑星鲽生殖调控的关键GnRH类型,本结果可为圆斑星鲽生殖调控机制和人工繁育技术研究提供理论支撑.     

圆斑星鲽染色体核型分析

以圆斑星鲽(Verasper variegatusTemminck et Schlegel)头肾细胞为材料,采用PHA体内注射,空气干燥法制备了染色体,并对其染色体核型进行了分析。结果表明,圆斑星鲽的染色体为46条,全部为端部染色体,核型公式为:2n=48t,NF=46。在已进行过染色体核型分析的鲽形目鱼类中,只有圆斑星鲽具有该核型。     

水温对圆斑星蝶摄食和生长的影响

采用实验生态学的方法研究了水温时圆斑星鲽(Verasper variegatus)摄食和生长的影响.试验结果表明:水温对圆斑星鲽生长发育的影响明显,在适宜的水温条件下,圆斑星鲽的生长发育速度是不适宜水温条件下的5倍.圆斑星鲽的适宜摄食温度为15～24℃,最佳摄食温度为18～21℃,每天的平均摄食率为鱼体重的1%左右.水温<18℃或＞21℃时,摄食量开始迅速下降,到了12℃时,摄食率比最高时下降了80%左右,6℃时几乎不摄食.2～26℃水温是圆斑星鲽养殖生产的安全上下限.     

圆斑星鲽肌肉和脾脏组织cDNA文库构建及部分ESTs分析

构建了圆斑星鲽肌肉和脾脏组织的cDNA文库,2个文库的库容量分别为5.0×106和1.1×106,重组率为97.3%和93.2%,平均插入片断长度大于800 bp.进行了1002个(肌肉541个,脾脏461个)ESTs测序,得到621个(肌肉192个,脾脏429个)单基因簇,其中包括110个(肌肉87个,脾脏23个)重叠群和511个(肌肉105个,脾脏406个)单拷贝.BLASTX分析的结果显示,318(51.2%)个基因簇有相关同源性,其他的303个EST(48.8%)无明显的同源性(E值≤E-5).     

尼罗罗非鱼MHC ⅡA基因的克隆、表达及多态性分析

为进一步了解鱼类MHC ⅡA基因的特点及其在免疫反应中的功能,采用同源克隆、RACE-PCR、巢式PCR等技术,从健康的尼罗罗非鱼体获得1 205 bp的MHC ⅡA基因cDNA全序列(Orni-DBA-0101,Genebank登录号:JF719813)及1 388 bp的基因组序列。序列分析发现,尼罗罗非鱼MHC ⅡA基因含4个外显子和3个内含子,开放阅读框长720 bp,编码239个氨基酸。从4尾尼罗罗非鱼中共得到8条不同的cDNA序列,分别编码不同的氨基酸序列。氨基酸序列比对后发现,序列间存在丰富的多态性,且主要集中在α-1区,多态性位点数远远高于半滑舌鳎MHC ⅡA基因。生物信息学分析表明,尼罗罗非鱼MHC ⅡA编码的蛋白质分子包含1个信号肽、2个胞外结构域、1个跨膜区和1个胞质区,存在4个保守的半胱氨酸残基以及丰富的磷酸化位点,与其他物种的相似性为23%～65%。RT-PCR结果表明,MHC ⅡA基因在脾、肾、肠、鳃、性腺、肝、心脏表达量很高,在鳔和肌肉中表达量最低。人工感染嗜水气单胞菌后,肝、脾、肾、鳃、肠5个组织中MHC ⅡA基因的mRNA水平均发生了不同程度的变化,提示MHC ⅡA分子作为一种重要的免疫因子,在清除病原的免疫反应中起着重要作用。     

Egg collection from hatchery-reared broodstock of spotted halibut Verasper variegatus treated with LHRH analog

The objective of this study is to establish a method for acquiring large quantities of high-quality eggs for artificial fertilization from hatchery-reared broodstock of spotted halibut Verasper variegatus. We estimated the optimum conditions for implantation of luteinizing hormone-releasing hormone analog (LHRHa) cholesterol pellet (LHRHa-CP) to induce ovulation from two experiments which focused on the dose and the timing combined with monitoring of oocyte development by ovarian cannulation. From the results of cannulation, vitellogenesis of hatchery-reared broodstock was suggested to occur normally, although final oocyte maturation was not initiated in the first clutch of oocytes. In late December, oocytes in the most advanced clutch still underwent vitellogenesis, having diameter of about 0.82?mm. LHRHa-CP implantation during this period had no remarkable effects, except for administration at high dose (100???g/kg). In contrast, in mid January, when oocyte diameter reached about 0.95?mm, ovulation occurred in most individuals, even at low dose (20???g/kg). In mid February atretic oocytes became remarkable and LHRHa-CP implantation showed much lower performance in terms of egg quality. The diameter of growing oocytes converged to about 0.95?mm, which was that of fully grown postvitellogenic oocytes. Thus, oocyte diameter is suggested to be an effective indicator to estimate the timing of LHRHa-CP implantation.     

圆斑星鲽线粒体基因组全序列结构及其进化

利用圆斑星鲽(Verasper variegatus Temminck et Schlegel)和相关鱼类的部分线粒体基因序列,设计出6对扩增引物,通过PCR扩增产物直接测序和引物行走(Primer walking)法测定圆斑星鲽线粒体基因组全序列,并对其进行结构与进化分析。圆斑星鲽线粒体基因组序列长17273 bp,其基因序列及构成都与其他硬骨鱼基本相同,包括37个基因(2个rRNA基因、22个tRNA基因和13个蛋白质编码基因)和2个非编码区(控制区和WANCY区)。在22个tRNA基因中,tRNAGln、tRNAAla、tRNAAsn、tRNACys、tRNATyr、tRNASer(第2个)、tRNAGlu和tRNAPro的编码基因位于L链上,其余则位于H链上。在13个蛋白质编码基因中,除了COⅠ基因的起始密码子为GTG外,其余均以ATG为起始密码子。蛋白质编码基因包括具有完整TAA终止密码子的ND1,COⅠ,ATP8,ND4L,ND5,而其他蛋白编码基因则具有不完全终止密码子。在L链上,ND6是仅有的一个蛋白质编码基因。圆斑星蝶的控制区包含1个终止相关序列区(ETAS)、6个中央保守序列区(CSB-A、B、C、D、E、F)和3个保守序列区(CSB-1、2、3)以及长串联重复区(Tandemly repeat sequence)。用NJ法和MP法对5个目22种鱼mtDNA的13个蛋白质编码基因的氨基酸序列进行系统分析,结果显示,圆斑星蝶与石鲽关系最近,鲽形目的鲆、鲽类与鲈形目的科(Carangidae)、鲷科(Sparidae)鱼类亲缘关系较近,而同属于鲽形目的塞内加尔鳎(Solea senegalensis)没有和任何目聚在一起,成为一个独立的分支。圆斑星蝶的基因组全序列序列已提交到GenBank,登录号为DQ403797,控制区单元型序列的GenBank登录号为DQ834444~7。     

Pedigree analysis of recaptured fish in the stock enhancement program of spotted halibut Verasper variegatus

ABSTRACT:   Spotted halibut Verasper variegatus hatchery juveniles produced in 2002 were genotyped using three microsatellite DNA markers (msDNA) and then released into natural waters. Subsequently, recaptured individuals were examined using msDNA. In order to evaluate the effectiveness of the stock enhancement program, from the genetic point of view, a pairwise F _ST test was implemented to estimate the genetic divergence between the wild captive broodstock, the hatchery offspring and the recaptured samples. The analysis showed significant differentiation between the broodstock and recaptured samples. Pedigree determination using msDNA was used to calculate the effective population size of the recaptured stock, which was found to be very low ( N _e ≈ 8). Equal family survivability was observed between the two recaptured stocks, but not between the released and recaptured stock. The number of identified families was higher and more equalized in the hatchery offspring compared to the recaptured samples, where the number of families declined. This fact was caused by an unequal family survivability just before or just after release. Separately, the number of contributing parents to the hatchery offspring was lower than the broodstock census number. Consequently, these two facts caused the genetic divergence of the recaptured stock from the broodstock.     

圆斑星鲽卵巢发育的组织学和数量形态特征研究

研究了圆斑星鲽卵巢年周期发育的组织学规律及其数量形态特征变化.结果表明,圆斑星鲽产卵属1年1次成熟分批产卵类型,卵巢发育属非同步分批成熟类型.性成熟亲鱼在年周期发育中经历5个发育时期,同时可见5个发育时相的卵母细胞,不同发育时期的卵巢中卵母细胞类型和组成比例不同.性腺指数(GSD、肝脏指数(HSI)和肥满度(CF)在亲鱼的年周期发育中呈现规律性的变化,与卵巢发育呈现密切的关联.亲鱼卵巢发育的有效积温为1050日度.