黄海希瓦氏菌胞外产物特性研究

为研究黄海希瓦氏菌(S. smarflavi)AP629胞外产物(ECPs)的致病性,用平板玻璃纸法提取胞外产物。结果显示,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)发现ECPs蛋白条带主要在114 kDa、66 kDa、39kDa、36 kDa、79 kDa;ECPs具有酪蛋白酶、淀粉酶、卵磷脂蛋白酶和脂肪酶活性,无明胶酶活性;一些金属离子和化学试剂对菌株AP629ECPs的酶活有影响,EDTA、PMSF、SDS、MnCl_2作用浓度分别为10、5、5、5 mM时,ECPs酶活受到不同程度抑制;Ca~(2+)和Mg~(2+)则提高ECPs的酶活,可分别提高3%～19%和12%～28%的酶的活性。菌株AP629的胞外产物人工感染小白鼠和仿刺参试验结果表明,黄海希瓦氏菌AP629的胞外产物不显示致病性。该文为揭示黄海希瓦氏菌AP629发病机理奠定了基础。     

大肠埃希氏菌和肺炎克雷伯氏菌的药敏试验

大肠埃希氏菌和肺炎克雷伯氏菌是动物肠道内的常见细菌,体弱和幼龄动物受气温变化或食物变换等因素的影响时,肠道内的这些条件性病原菌便大量繁殖,引起胃肠道疾病或败血病。采集这2种病原菌EL-1株(大肠埃希氏菌)和EL-2株(肺炎克雷伯氏菌),在培养基上培养生长,再制备各种抗菌药片进行药敏试验。经动物试验肠霉素试验和抗原性研究,证明EL-1株和EL-2株能致死小白鼠,能产生肠毒素,具有较好的抗原性和较强的毒性。本试验通过药敏试验来检测这2种病原菌对不同抗菌药物的敏感性,以选择出有效药物用于预防和治疗这类疾病。试验表明,EL-1株和EL-2株除对氟哌酸、氟嗪酸、氯霉素和复方磺胺抗菌素有较高敏感性外,对其它抗菌药物具有不同程度抗药性。     

柱状噬胞菌与迟缓爱德华氏菌混合感染鳗鱼报告

1995年3月至1997年2月，我们多次从病鳗的鳃、肝、肾、腹水病料中同时检出柱状噬胞菌和迟缓爱德华氏菌，对其生物学特性和病原学进行了初步研究，现报告如下：1病鳗症状初期鳗鱼摄食下降，傍晚和夜间在水面上无力逆游晃动或紧贴池壁或挂在食台上，反应迟钝，2天后每池有死鳗20余尾。捞起病鳗只见腹部各处皮肤出血，一片潮红，肝区肿大，鳍充血，严重的前腹部穿孔。解剖见鳃上粘液很多，鳃丝肿胀，呈暗红色或灰白色，鳃片缺损，有的只剩下鳃柄，指压鳃部有血水流出，肝脏、肾脏肿大，有脓疡病灶，胃内多有积水，有的腹水达20ml。2病原菌分离…     

团头鲂源肺炎克雷伯氏菌的分离鉴定

建立肺炎克雷伯氏菌感染团头鲂的模型,为团头鲂疾病的有效检验与防治及鱼类病原肺炎克雷伯氏菌的进一步研究提供参考和依据。2014年8月江苏省常州市某养殖场暴发出血病,团头鲂大量死亡,濒死团头鲂呈现轻微细菌性败血症症状,但未见大量充血发红,仅腹部、鳍基部有出血点,鳃丝发白,肠道无食物,肝胰腺轻微充血发红。采用常规的培养特征、理化特性及分子生物学的方法,于濒死团头鲂的肝、脾中分离到优势菌株CZBY-1,进行了形态观察、药敏试验、毒力因子检测等,并对其16S rRNA基因序列(Gen Bank登录号:KF413424)进行分析。构建系统发育树确定供试菌株与肺炎克雷伯氏菌同源性最高,在99%以上,结合表型及分子生物学分析,判定为肺炎克雷伯氏菌,人工回感可导致团头鲂死亡并呈现同检测鱼患病特征。利用设计的特异性引物进行外膜蛋白C(ompC)基因的PCR扩增,发现分离菌在252 bp对应位置有明显扩增条带,证明其具有毒力因子ompC。药敏试验表明,菌株对磷霉素、复方新诺明等27种抗生素敏感,对链霉素、妥布霉素、万古霉素3种抗生素耐药。     

产胞外多糖的近海海洋细菌的筛选

海洋微生物是海洋生物的重要组成部分,海洋微生物可产生大量不同于陆生生物的活性物质,是重要的海洋药物资源。实验所用泥样采集于黄海近海海岸,对其进行海洋细菌的分离与纯化,获得了25株纯化的海洋细菌。采用苯酚-硫酸法和乙醇沉淀法检测这些菌株的发酵液中是否含有胞外多糖,进一步筛选出胞外多糖的高产菌株。实验结果表明,胞外多糖产量高于0．22g／L的菌株共7株,占总测定菌株数的28％,胞外多糖产量高于0．20g／L的菌株共13株,占总测定菌株数的52％。有48％的菌株胞外多糖产量介于0．19g／L和0．20g／L之间。其中以MBN003中多糖含量为最高,产量达到0．2305g／L。此研究结果表明MBN003菌株具有较高的产胞外多糖能力,可以选用MBN003作为胞外多糖提取物研究的来源。     

哈维氏弧菌GYC1108-1胞外蛋白酶的制备及免疫原性研究

胞外蛋白酶(ECPase)是哈维氏弧菌GYC1108-1胞外产物的主要致病因子,经鉴定其为半胱氨酸蛋白酶,分子量约55kD,能够分解脱脂奶中的酪蛋白,命名为1108-ECPase。本实验建立了胞外蛋白酶活性平板法检测1108-ECPase和YZ-ECPase的相对酶活(YZ为由本实验室构建的能够分泌目的蛋白酶的重组菌),并利用这个方法确定了细菌分泌ECPase达最高峰的培养时间为36h,粗提ECPase最适的饱和硫酸铵浓度为70%。GYC1108-1和YZ培养上清经硫酸铵盐析,SephadexG-25凝胶过柱后,得到较为纯化的1108-ECPase和YZ-ECPase。选择白油、蜂胶和弗氏3种不同佐剂与适量抗原混匀,分别免疫3只ICR小鼠,并设不加佐剂免疫组及空白组作为对照。3次免疫后制备小鼠血清,间接ELISA测定抗体效价,除空白对照外,其他8组小鼠的免疫血清效价达1∶1.6×104～1∶2.56×105,免疫组的效价从高到低依次为弗氏白油蜂胶不加佐剂,不同佐剂的免疫效果依次为:弗氏白油蜂胶。免疫印迹实验结果表明,小鼠血清在55kD处有明显的反应条带。     

哈维氏弧菌TS-628菌株胞外产物(ECP)蛋白酶活性的研究

采用复性电泳技术,研究环境pH、温度及培养时间对哈维氏弧菌TS-628菌株胞外产物(ECP)蛋白酶活性的影响。结果表明,胞外产物蛋白酶最适反应pH在8.5左右,酸对ECP蛋白酶活性的抑制明显强于碱对它的抑制作用;最适反应温度在20～50℃之间,20℃以下或50℃以上蛋白酶活性则受到明显抑制,表明蛋白酶不仅对高温敏感,对低温也很敏感;培养12h的胞外产物蛋白酶活性最强。最适温度和pH条件下,主要出现3种蛋白酶,其中分子量为94kDa和26kDa的两种蛋白显示了很强的蛋白酶活性,而且能在比较极端的温度和pH值条件下保持活性,而分子量为35kDa蛋白酶只在最适反应条件下出现,并且该蛋白酶的最适反应条件与弧菌病暴发时的环境条件极为相似。由此可推测分子量94kDa和分子量为26kDa的两种蛋白可能是弧菌维持生存所必需,而分子量为35kDa的蛋白酶虽然只出现在特定条件下,却可能在致病过程中起重要作用。     

哈氏弧菌胞外产物对红鳍东方鲀的致病性

采用平板玻璃纸覆盖技术提取哈氏弧菌(Vibrio harveyi)H-06091菌株的胞外产物(ECP),通过肌肉和腹腔注射2种方式研究其对红鳍东方鲀(Fugu obscurus)的致病性。采用双层纸片法对其主要酶成份进行初步研究;测定其对绵羊红细胞和红鳍东方鲀红细胞的溶血活性;将哈氏弧菌在不同温度下(15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃)培养36h和25℃下培养不同时间(12h、18h、24h、36h、48h、60h、72h)后提取其胞外产物并对其蛋白质含量进行测定;经SDS-PAGE分离粗提胞外产物中蛋白成分,并用Dot-ELISA和Western-blot方法对其成分进行分析。实验结果显示,该胞外产物对红鳍东方鲀具有致病性;具有淀粉酶和酪蛋白酶活性,不具有卵磷脂酶、脂肪酶和明胶酶活性;对红鳍东方鲀红细胞有溶血活性,对绵羊红细胞无溶血活性;胞外产物蛋白质总含量在35℃培养36h后出现高值,与温度变化无明显相关性;25℃下培养24h、36h和48h的粗提胞外产物经SDS-PAGE分离,有3条蛋白质条带最明显,分子量分别约为31kD、38kD、60kD;其中分子量约为60kD蛋白条带,经Dot-ELISA和Western-blot方法证实其为半胱氨酸蛋白酶-1。根据以上结果认为哈氏弧菌H-06091菌株胞外产物含有多种毒力因子,与该菌的致病性密切相关。     

柱状黄杆菌胞外多糖对草鱼的免疫促进作用

将柱状黄杆菌胞外多糖（EPS）溶液经腹腔注射免疫草鱼，以注射灭菌生理盐水作对照。免疫一周后，分别提取受免鱼与对照鱼肝脏、脾脏、体肾和头肾4种组织中的总RNA，并通过RTPCR半定量的方法检测不同组织中C反应蛋白（CRP）、白介素1（IL-1）、主要组织 相容性复合体I（MHC-I）、免疫球蛋白M（IgM）、干扰素（IFN）等5种免疫基因的表达情况。结果显示，CRP在受免鱼肝脏中的表达显著上升；MHC I在受免鱼脾脏、体肾中的表达显著下降；IgM在受免鱼4种组织中的表达皆显著上升；IL-1在受免鱼4种组织中的表达与对照组没有显著差异；无论受免组还是对照组都只能检测到微弱的IFN表达，且两组之间没有显著差异。结果表明，柱状黄杆菌EPS对草鱼的先天免疫能力以及特异性体液免疫能力具有促进作用。     

鸭疫里默氏菌的研究进展

鸭传染性浆膜炎是由鸭疫里默氏菌引起的一种重要的鸭细菌病。由于该病分布的广泛性以及引起鸭的高死亡率、发育迟缓和淘汰率增加,给养鸭业造成巨大的经济损失。所以,对鸭疫里默氏菌进行深入研究,以便预防和控制、乃至最终消灭本病,有着重要的经济意义。文章从血清型、诊断方法、疫苗等方面概述了近年来鸭疫里默氏菌研究进展。     

杀鲑气单胞菌杀日本鲑亚种胞外产物毒性及免疫原性分析

用玻璃纸平板法提取了杀鲑气单胞菌杀日本鲑亚种Aeromonassal monicida masoucida的胞外产物（ECP）。毒性试验证实,ECP对剑尾鱼Xiphophorus helleri具有致死性,其半致死量（LD50）为4.72μg蛋白/g体重。SDS-PAGE表明,ECP由13条蛋白带组成。利用大鼠抗ECP血清进行的Western-blot印迹显示,组成ECP的13条蛋白带中有7条具有免疫原性,能够引发机体的免疫应答反应产生抗体,其分子量分别为88、70、42、39、36、22和15kDa。     

海藻酸钠/浒苔多糖复合膜的制备及性能

为探讨海藻酸钠与浒苔多糖的协同作用,本研究首次以海藻酸钠和浒苔多糖为基材,甘油为增塑剂制备生物降解复合膜,探究了海藻酸钠与浒苔多糖质量比、共混溶液总浓度、甘油含量对复合膜拉伸强度、断裂伸长率、水蒸气透过率和水溶性的影响,同时,利用扫描电子显微镜技术(SEM)、傅里叶红外光谱(FTIR)进行微观结构表征。结果显示,海藻酸钠与浒苔多糖之间具有良好的相容性和协同作用,无明显的相分离现象。组分质量比、共混总浓度和甘油含量均对膜性能有较大影响,其中,质量比影响最显著,添加适量浒苔多糖可提高海藻酸钠膜的拉伸强度和断裂伸长率,降低海藻酸钠膜的水蒸气透过率,但膜水溶性略微提高。在组分质量比为8∶2时,膜拉伸强度从99.22 MPa增加到108.41 MPa,断裂伸长率从5.14%增加到6.20%,水蒸气透过率从6.445×10–11 g/(m·s·Pa)降低到6.027×10–11 g/(m·s·Pa),复合膜的综合性能达到最优。进一步优化了共混总浓度和甘油含量,最佳共混总浓度为1.6%(m/v),最佳甘油含量为0.9%(m/v)。本研究表明,浒苔多糖的添加增强了海藻酸钠膜的机械性能和阻隔性能。     

患病黄额闭壳龟中产酸克雷伯菌的分离与鉴定

从患病黄额闭壳龟(Cuora galbinifrons)肝脏中分离到一株致病菌HE01,经人工感染健康巴西龟,可复制与自然发病相同的症状,且从人工感染病龟体内再次分离到相同的病原菌。经Biolog微生物自动鉴定系统的鉴定,以及进一步的16 S rDNA基因序列和系统发育分析都表明,此致病菌为产酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca)。药物敏感性试验表明,该菌株对头孢噻肟、头孢曲松、头孢哌酮等10种药物高度敏感。     

云芝多糖和副溶血弧菌灭活苗对斜带石斑鱼免疫功能的影响

采用注射云芝多糖和副溶血弧菌灭活苗的方法免疫斜带石斑鱼后,测定了受免鱼的吞噬细胞的吞噬活性、杀菌功能和免疫保护率。结果表明,云芝多糖组在第3天,吞噬细胞的吞噬百分比(PP)达到峰值(90%),显著高于对照组(P0.05),然后开始下降,到第7天即与对照组相当(P0.05);30 m in和60 m in的杀菌率显著提高(P0.05)。灭活苗组和云芝多糖+灭活苗组的PP值和杀菌率显著高于对照组(P0.05),并维持在较高水平,但2组之间差异不显著(P0.05);用副溶血弧菌攻毒后,斜带石斑鱼的免疫保护率达87.6%。由此可见,灭活苗不仅能提高斜带石斑鱼的特异性免疫力,而且也能增强吞噬细胞的吞噬和杀菌活性等非特异性免疫力。     

罗非鱼循环水养殖系统中一株肺炎克雷伯氏菌的分离鉴定及其脱氮性能研究

实验从山东德州市一罗非鱼(Oreochromis niloticus)养殖场循环水养殖系统的脱氮池中分离到一株具有高效脱氮特性的菌株(编号DZYC02),分别以葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、丁二酸钠、乙酸钠、柠檬酸钠为碳源,研究了碳源种类对菌株DZYC02脱氨氮效果的影响;同时以蔗糖为碳源、NH4Cl为氮源,研究了不同碳氮比、初始pH及盐度对该菌株脱氮效果的影响。结果显示:菌株DZYC02在以柠檬酸钠为碳源、C∶N≥15、pH 5~7、盐度0~15的条件下具有良好的脱氮效果,24 h内对浓度为20 mg/L的NH+4的去除率达100%,48 h内对浓度为20 mg/L的NO-2去除率高达100%;将该菌采用浸泡方式感染斑马鱼(Danio rerio)进行生物安全试验,结果显示菌株DZYC02对斑马鱼表现出较好的安全特性。分别用Biolog细菌鉴定方法和16S rDNA序列分析比对法对该菌进行鉴定,结果显示菌株DZYC02为一株肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)。     

Effects of polysaccharide from fermented wheat bran on growth performance,muscle composition,digestive enzyme activities and intestinal microbiota in juvenile common carp

The present study evaluated the effect of dietary polysaccharide from fermented wheat bran on growth performance, muscle composition, digestive enzyme activities and intestinal microbiota of juvenile common carp (Cyprinus carpio L.). Four diets supplemented with 0 (D0), 1.0 (D1), 2.0 (D2) and 4.0 (D3) g/kg fermented wheat bran polysaccharide (FWBP) were prepared. Fish were randomly assigned into four groups, each group having four replicates (30 fish/replicate) and fed with experimental diets for 8 weeks. Compared with the D0 group, the D3 group had higher final body weight and weight gain (p < .05). The amylase activity in the intestine and hepatopancreas of D1 and D2 groups and pepsin and trypsin activities in the hepatopancreas of D2 and D3 groups were significantly higher than D0 group. Significantly increased muscle protein and lipid content while reduced moisture content was observed in D1 group; additionally, D3 group had significantly lower muscle lipid content. The population of Bifidobacterium spp. in the intestine digesta of D1 and D2 groups was significantly increased, whereas lactic acid bacteria (LAB) and Escherichia coli were unaffected. Collectively, dietary FWBP supplementation could enhance digestive enzyme activities and Bifidobacterium population and change the muscle composition and improve growth performance of common carp.     

中华鳖虹彩病毒单克隆抗体的制备及其抗原表位的初步分析

以纯化的中华鳖虹彩病毒为抗原免疫Balb/C小鼠,取免疫鼠脾细胞经杂交融合获得了8个能稳定分泌抗中华鳖虹彩病毒特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株。单克隆抗体亚级份分析结果表明,Mab2A4属IgA,Mab8E1是IgG2a,其他的6株单抗Mab1D3、Mab2H1、Mab3A1、Mab4B5、Mab5E1和Mab6F2均为IgG1。酶联免疫吸附剂测定（ELISA）分析表明,8株单抗均能特异性地识别中华鳖虹彩病毒,与EPC、CO、FHM等宿主细胞不产生交叉反应,腹水抗体的ELISA效价在10⁵～10⁶。IFA分析表明,8株单抗中仅Mab5E1没有免疫荧光反应特性,其余7株单抗均能对染毒病灶产生特异性的荧光染色。中和试验结果证实8株单抗均没有中和病毒的特性。应用Western-blotting进行中华鳖虹彩病毒的抗原表位初步分析,结果显示：Mab1D3和Mab2A4分别识别分子量为84 ku和35 ku中华鳖虹彩病毒结构蛋白,Mab3A1能够同时识别分子量分别为14 ku和16 ku的两条多肽,说明这3株单抗结合位点是非构象依赖性抗原决定簇,其余单抗不具备Western-blotting反应特性。这些结果提示上述单抗对中华鳖虹彩病毒抗原特异、灵敏,可用于中华鳖虹彩病毒的检测和结构蛋白分析。     

超声波辅助过氧化氢法降解坛紫菜多糖及其抗氧化活性的研究

该试验比较了超声波法、过氧化氢法、超声波辅助过氧化氢法降解坛紫菜(Porphyra haitanensis)多糖的效果,最后以1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)自由基清除率为指标,通过单因素和正交试验优化了超声波辅助过氧化氢法降解坛紫菜多糖的工艺。对比了降解前后多糖的抗氧化活性,并分析了其与分子量、结构特征及理化性质等的相关性。结果表明,在过氧化氢体积分数10%、温度65℃、超声波辅助2.5 h条件下,该多糖降解前后DPPH自由基清除率的半抑制浓度(Half maximal inhibitory concentration,IC50)由9.37 mg·mL^-1降为1.71 mg·mL^-1;凝胶渗透色谱结果显示分子量由大于670 kD降为235835 D;傅里叶红外光谱表明多糖特征吸收峰依旧存在;高效液相色谱分析发现单糖组成大致相同,糖醛酸质量分数有所降低;理化性质显示硫酸基质量分数增高,3,6-内醚半乳糖质量分数明显降低。因而超声波辅助过氧化氢法可较好地降解坛紫菜多糖,并可改善理化性质及结构特征进而增强抗氧化活性,为低分子量多糖的制备及构效关系分析提供依据。     

中东太平洋金枪鱼延绳钓渔获物组成分析

根据2000年9月至2002年8月两年的中东太平洋金枪鱼延绳钓探捕调查结果,对延绳钓渔获物组成进行了初步分析。结果显示,延绳钓的主要渔获种类有肥壮金枪鱼(Thunnus obesus)和黄鳍金怆鱼(Thunnus albacares)等15种大洋性鱼类,渔获物中金枪鱼类分别占重量和尾数的76．41％和76．91％,旗鱼类占11．05％和7．83％．鲨鱼类占10．80％和12．08％,其他鱼类占1．73％和3．18％。相对重要性指标(IRI)表明,延绳钓渔业以肥壮金枪鱼和黄鳍金枪鱼为目标鱼种,其他大型中上层经济鱼类为兼捕对象。各渔获种类的渔获重量组成比例月间变化和海域变化明显。