GnRHR在不同日龄建昌黑山羊睾丸、附睾中的分布与表达

[目的]定位并比较不同日龄建昌黑山羊睾丸及附睾中GnRHR的分布及表达情况。[方法]分别收集55、104、300、1 140日龄建昌黑山羊的睾丸、附睾头和附睾尾组织,然后进行脱水、包埋、切片后,采用免疫组化定位GnRHR在各个组织中的分布。[结果]GnRHR在建昌黑山羊睾丸、附睾头和附睾尾组织细胞中均有分布,在上皮下层、基质层中分布较多,其表达量在300日龄的附睾尾和1 140日龄的睾丸中达到较高水平。[结论]GnRHR在睾丸、附睾中均有表达,而且不同日龄阶段表达存在组织细胞特异性。     

公鸡生殖器官组织结构及其IL-1β和IL-6在生殖器官中的定位

【目的】IL-1β和IL-6在公鸡生殖器官免疫保护中发挥着重要的作用,研究拟揭示公鸡生殖器官的组织构造,以及定位IL-1β和IL-6在其生殖器官中的表达部位。【方法】通过苏木精-伊红染色方法,制作正常生理状态下公鸡生殖器官切片,观察公鸡生殖器官的组织构造以及生殖管道上皮细胞变化规律;同时采用免疫组化定位IL-1β和IL-6在生殖器官的部位。【结果】实验表明,附睾中的管道在公鸡生殖管道中占有很大比例,且生殖管道的上皮细胞的变化特征与其输送精液高度适应;IL-1β和IL-6主要定位于附睾近端输出管上,且IL-1β主要定位于短皱褶的近端输出管,IL-6主要定位于长皱褶的近端输出管上。【结论】结果表明附睾的输出管,尤其是近端可能是清除生殖道中的异常精子、脱落细胞等异物的主要部位。     

银莱汤对发热大鼠血清IL-1β、TNF-α、IL-6含量的影响

目的 研究银莱汤对发热大鼠体温和血清IL-1β、TNF-α、IL-6含量的影响。方法 90只SD大鼠连续测温3次,选取合格大鼠背部皮下注射20%干酵母混悬液10 mL/kg建立大鼠发热模型,随机平均分为正常组、模型组、阿司匹林组、银莱汤高剂量组、银莱汤中剂量组、银莱汤低剂量组共6组,每组8只大鼠。分别于造模前0.5 h和造模后5 h两次灌胃给药,造模后每小时测温一次,于末次给药后3 h取血,通过ELISA和RIA方法检测血清中炎性介质白介素-1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）含量水平。结果 银莱汤各剂量组体温均低于模型组（P<0.01）,银莱汤各剂量组血清中IL-1β、TNF-α、IL-6含量均低于模型组（P<0.05）。结论 银莱汤对发热大鼠具有明显的退热效果,其作用机制可能与降低机体炎症反应,减少血清中IL-1β、TNF-α、IL-6的产生或加速降解相关。     

CYP19基因在牦牛睾丸及附睾组织中的表达定位

[目的]为了探讨CYP19基因在牦牛睾丸及附睾不同部位的表达差异性.[方法]应用免疫组织化学、qRT-PCR方法、Western-blot等检测方法,研究成年牦牛睾丸及附睾头、体、尾等4个组织中CYP19基因的表达和定位.[结果]免疫组化结果显示在睾丸支持细胞、间质细胞和生殖细胞中P450arom蛋白均有较强表达,在附...     

IL-1β及其受体在雌牦牛主要生殖器官和孤雌激活胚胎中的表达定位

为探索正常生理条件下IL-1β和IL1R1参与雌性牦牛生殖调控及早期胚胎发育的生物学作用,试验采集雌性牦牛主要生殖器官(卵泡期:输卵管、卵巢、子宫;黄体期:输卵管、卵巢、子宫;妊娠期:输卵管、卵巢、子宫),并生产孤雌激活胚胎。实时荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR,qRT-PCR)检测IL-1β和IL1R1 mRNA在组织和胚胎发育过程中的表达;并采用蛋白质免疫印迹(Western-blot,WB)和免疫组织化学方法从蛋白水平分析IL-1β和IL1R1在各生殖器官的表达水平与定位。结果显示IL-1β和IL1R1在牦牛主要生殖器官和孤雌激活胚胎中均有表达。其中卵泡期输卵管中IL-1β和IL1R1表达均高于黄体期和妊娠期,卵泡期卵巢和妊娠期卵巢中IL-1β和IL1R1的表达高于黄体期,妊娠期子宫中IL-1β和IL1R1的表达高于卵泡期和黄体期,孤雌激活胚胎中IL-1β和IL1R1的表达桑椹胚最高,8细胞次之,2细胞和囊胚期最低。免疫组织化学结果显示IL-1β和IL1R1在输卵管黏膜上皮、卵泡颗粒层、黄体细胞、子宫上皮和子宫腺体均有表达。研究结果表明IL-1β和IL1R1参与牦牛生殖周期和胚胎发育的调控作用,为进一步探究IL-1β和IL1R1的作用机制提供了理论基础,有助于牦牛胚胎体外培养技术的改进。     

小花棘豆中毒对家兔睾丸和附睾中SOD表达的影响

【目的】研究小花棘豆毒性成分对家兔睾丸、附睾组织中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性及基因表达的影响。【方法】将48只雄性家兔随机分为对照组和试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组,试验组分别按照Ⅰ组15%(苦马豆素含量30 mg/kg)、Ⅱ组30%(苦马豆素含量60 mg/kg)、Ⅲ组45%(苦马豆素含量90 mg/kg)的比例添加小花棘豆,对照组仅饲喂苜蓿干草,试验期70 d。分别于攻毒后第14、35、70 d每次每组随机采集4只家兔的睾丸和附睾组织,通过羟胺法检测SOD活性的变化,real-time PCR检测SOD mRNA的表达,免疫组化和Western Blot检测SOD蛋白的表达。【结果】从第35 d开始,与对照组相比,各试验组家兔附睾、睾丸中T-SOD、Cu/Zn-SOD和Mn-SOD活性均极显著下降(P﹤0.01),mRNA表达量和蛋白表达量均呈现出明显的下降趋势,而且其差异性随中毒时间的延长而变化。【结论】小花棘豆中毒可导致家兔睾丸、附睾中SOD活性与表达异常,且与小花棘豆中毒呈现一定的时间-剂量效应。     

间接免疫荧光方法检测小鼠睾丸和附睾组织Hsp70的表达

采用间接免疫荧光方法对小鼠睾丸和附睾组织Hsp70的表达进行检测.结果表明,小鼠睾丸组织Hsp70呈极强的表达(+++),并且在各级生精细胞及支持细胞都呈极强表达;小鼠附睾头、附睾体、附睾尾的Hsp70呈现极强表达(+++),主要在附睾上皮细胞,而管腔内精子偶见阳性染色.说明间接免疫荧光方法能够特异性、原位地检测小鼠睾丸和附睾组织Hsp70的表达,而且操作简单,适用于研究Hsp70在精子发生和成熟过程的作用.     

NLRP3/ASC/caspase-1/IL-1β/IL-18轴在大鼠脓毒症急性肾损伤中的作用

[目的]观察盲肠结扎穿孔(Cecal ligation and puncture,CLP)所致的脓毒症诱导急性肾损伤(AKI)后大鼠不同时间点的血清及肾组织中NLRP3/ASC/caspase-1/IL-1β/IL-18的表达情况。[方法]建立大鼠CLP诱导的脓毒症AKI模型,并于手术后不同时间点用ELISA试剂盒方法测定血清尿素氮(BUN)、血清肌酐(Scr)水平及IL-1β/IL-18的表达量;采用Western blotting法检测肾脏组织NLRP3/ASC/caspase-1/IL-1β/IL-18蛋白水平,并对肾脏组织进行HE染色病理分析。[结果]CLP诱导的脓毒症大鼠血清BUN和Scr水平显著增高,肾小管坏死也显著增加,均于CLP术后24 h达到高峰,与假手术组大鼠相比差异显著(P0.05或P0.01);大鼠肾脏组织中NLRP3/ASC/caspase-1/IL-1β/IL-18及血清IL-1β/IL-18水平也随着损伤程度的加重表现出升高趋势,与假手术组相比差异均达到显著水平。[结论]大鼠脓毒症AKI后肾组织或血清中NLRP3/ASC/caspase-1/IL-1β/IL-18蛋白水平表达增加,表明NLRP3炎症小体的激活可能对脓毒症AKI及其病理改变有促进作用。     

P450芳香化酶活性调控对小鼠睾丸和附睾发育及精子发生的影响

［目的］探索P450芳香化酶抑制剂——来曲唑调控内源性雌激素合成,对小鼠睾丸和附睾发育及精子发生产生的影响。［方法］将SPF级昆明系雄性小鼠随机分为对照组和试验组,试验组分为0.001、0.002、0.004、0.006、0.008、0.010 mg/kg来曲唑剂量组,连续灌服3 d,在停药后的第9、15和30天检测小鼠睾丸和附睾的发育及精子的发生情况。［结果］①各试验组与对照组比较,体重增长率无显著差异;②0.010 mg/kg来曲唑组与对照组比较,在灌服后的第15天睾丸系数显著减少（P〈0.05）,其他各试验组与对照组比较无显著差异;③各试验组与对照组比较,附睾系数无显著差异;④在第15和30天,0.006-0.010 mg/kg来曲唑组与对照组比较,精子密度显著减少（P〈0.05）,其他各组与对照组无显著差异。［结论］该研究使用的来曲唑浓度,对小鼠体重增长率及睾丸和附睾的发育率无显著影响或影响很小,但是超过0.006 mg/kg浓度时抑制精子的发生,说明一定程度抑制P450芳香化酶的活性,降低内源性雌激素合成,能够直接影响精子的发生能力。     

奶山羊IL-6与TGF-β1融合蛋白的制备及其活性检测

【目的】制备具有免疫活性的奶山羊白细胞介素6（Interleukin-6,IL-6）与转移生长因子-β1(Transfer growth factor-β1,TGF-β1)融合蛋白。【方法】采集奶山羊外周血,分离外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cell,PBMCs）,将PBMCs用刀豆蛋白A（ConA）刺激后提取其总RNA,RT-PCR扩增IL-6与TGF-β1基因,构建其克隆载体及原核表达载体pET-32a TGF-β1和pET-32a-IL-6,然后进行PCR和测序鉴定。将原核表达载体pET-32a-TGF-β1和pET-32a-IL-6转化至大肠杆菌 BL21(DE3) 中,用 IPTG诱导表达,以镍柱纯化试剂盒纯化IL-6与TGF-β1重组蛋白,对表达产物和纯化后的蛋白进行SDS-PAGE。用纯化的IL-6、TGF-β1蛋白刺激PBMCs,以甘油醛-3-磷酸脱氢酶GAPDH基因为内参,采用qRT-PCR法检测PBMCs -IL-17 mRNA的表达量。【结果】RT-PCR扩增获得了627 bp的IL-6基因片段和1 137 bp的TGF-β1基因片段,成功构建了IL-6和TGF-β1基因的克隆载体及pET-32a-TGF-β1和pET-32a-IL-6原核表达载体,并在大肠杆菌BL21(DE3)中得到成功表达;获得了纯化的奶山羊IL-6与TGF-β1融合蛋白,该融合蛋白联合刺激能使PBMCs的IL-17 mRNA表达水平显著升高。【结论】获得了具有免疫活性的奶山羊IL-6与TGF-β1重组蛋白。     

GPX5在成年绵羊附睾中的表达与蛋白定位

【目的】研究谷胱甘肽过氧化物酶-5（glutathione peroxidase type-5, GPX5）在成年绵羊附睾的表达特征以及GPX5蛋白在附睾中的定位,为绵羊精子在附睾中抗氧化机制的研究提供理论依据。【方法】采取年龄相近的成年蒙古绵羊的附睾、睾丸和输精管。每一只公羊的附睾分别按照附睾头、附睾体和附睾尾进行分割。样品保存于-80 ℃冰箱,采用实时荧光定量PCR和Western blotting的方法,对成年绵羊的附睾、睾丸和输精管的GPX5 表达量进行分析。将新鲜的组织样品各部分切取适合大小浸泡于4%多聚甲醛溶液中24h,按照石蜡切片的方法制做组织切片。用GPX5特异性抗体孵育组织切片,利用DAB显色试剂盒对阳性信号进行标记。【结果】实时荧光定量PCR结果显示,成年绵羊附睾头GPX5基因的表达量极显著高于附睾体和附睾尾（P＜0.01）,而在输精管和睾丸几乎不表达。Western blotting的结果显示,GPX5蛋白在成年绵羊附睾头高表达,在附睾体和附睾尾有微量蛋白存在,睾丸和输精管中未发现GPX5蛋白。这表明GPX5主要在成年绵羊附睾头表达;经过免疫组化染色分析,GPX5蛋白主要位于附睾头上皮细胞质以及静纤毛,附睾体和附睾尾中的GPX5蛋白主要集中在静纤毛。在附睾头、附睾体和附睾尾中的精子上以及附睾腔都可以观察到GPX5蛋白,表明GPX5蛋白从附睾上皮分泌到附睾腔中,随着精子在附睾中的运输与精子结合。【结论】在成年绵羊附睾中,GPX5主要由附睾头上皮细胞合成和分泌,在附睾管腔中与精子结合,为精子功能的正常发挥提供保护。     

山羊 IL-15基因克隆、组织表达谱分析与表达

白细胞介素15(Interleukin-15,IL-15)是一个多功能细胞因子,在免疫系统和非免疫系统中都有重要作用,包括刺激T细胞增殖和激活自然杀伤细胞,可引起肌肉萎缩性刺激和肌肉收缩反应.但是,在山羊中该基因的研究尚未见报道.该研究采用RT-PCR方法克隆了山羊肌肉IL-15基因,使用荧光定量的方法构建该基因组织表达谱.序列分析表明山羊IL-15包含486bp全长编码序列,该序列编码162个氨基酸,可形成4-α-螺旋的空间结构,其核苷酸和氨基酸序列与绵羊(97.55%,94.48%)和牛(95.91%,92.02%)的同源性最高,与鸡的同源性最低(48.59%,27.89%).荧光定量检测表明该基因在肌肉和脾中相对表达量最高,在大脑中相对表达量最低.进一步通过PCR方法获得缺失长信号肽的成熟肽蛋白基因序列,重组到原核表达载体pET32a(+)中进行原核表达,获得29kDa的融合蛋白,并通过Western blot方法进行了鉴定.这些结果说明IL-15序列在哺乳动物间是保守的,在山羊中的功能与其他动物相似.成功构建的山羊IL-15表达系统为进一步研究山羊该基因的功能及应用奠定了基础.     

家蚕Bm595的表达、组织分布及亚细胞定位

 【目的】从家蚕蛹期cDNA文库中获得一条新基因Bm595,分析Bm595在家蚕体内的表达和定位情况。【方法】利用生物信息学分析Bm595序列,并构建重组表达质粒在大肠杆菌中诱导表达,以纯化的融合蛋白抗原,制备多克隆抗体。用荧光定量PCR和Western blot方法分析Bm595基因在家蚕各组织中的分布。用免疫细胞化学的方法研究Bm595蛋白的定位情况。【结果】Bm595在五龄幼虫的转录水平最高,卵中最低。Bm595在家蚕五龄幼虫各组织中的转录水平由高到低依次为：睾丸、丝腺、肠、头、卵巢、脂肪体、表皮、气管。在表达水平方面,睾丸的表达量最高,其次是丝腺和头,脂肪体有较明显的表达。以家蚕Bm5细胞进行免疫细胞化学试验,Bm595主要分布于细胞核内。【结论】在mRNA、蛋白质表达和细胞水平对Bm595进行初步表达分析和定位分析,为进一步研究该蛋白在家蚕中的功能提供重要依据。     

山羊PHGPx基因在不同组织中的表达特点及性腺中的定位

【目的】研究磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶(PHGPx)在山羊各种组织中的表达特点及在性腺中的定位情况。【方法】提取各种组织总RNA,应用实时荧光定量PCR方法检测各种组织PHGPx mRNA表达规律,利用免疫组化技术对睾丸和附睾PHGPx进行定位分析。【结果】PHGPx mRNA在各种组织表达水平由高到低依次为:睾丸心脑附睾肾肝肺脾背最长肌,在性腺和附睾中:睾丸附睾尾附睾头附睾体;免疫组化结果显示睾丸间质组织、生精细胞均有阳性产物,附睾头部平滑肌纤维表达弱阳性,附睾尾部附睾管中的单层柱状上皮表达呈强阳性。【结论】PHGPx在不同组织广泛表达,发挥重要的生物学功能,免疫组化结果直观显示了睾丸及附睾表达差异的部位,需深入研究其作用机制。     

大足黑山羊PHLDA2基因的克隆、组织表达与印记状况分析

【目的】克隆大足黑山羊PHLDA2（pleckstrin homology-like domain, family A, member 2）基因序列,分析其组织表达特征、印记状况以及与胎盘性状的关系,为深入研究该基因在山羊胎盘中的功能积累数据。【方法】根据人、牛和猪PHLDA2的保守区域设计引物以RT-PCR方法扩增大足黑山羊该基因部分cDNA序列,进一步利用5′-和3′-RACE技术获得全长cDNA序列;利用ORF Finder和ProtParam等在线工具分析PHLDA2基因序列特征;采用Real-time PCR方法分析PHLDA2在大足黑山羊心、肝、脾、肺、肾、大脑、肌肉、脂肪、舌和胎盘等10个组织的表达差异;寻找大足黑山羊和波尔山羊PHLDA2基因序列SNP位点,基于表达SNP的方法分析该基因在F₁代组织中的印记状况;采用线性回归的方法分析PHLDA2表达量与胎盘性状的关系。【结果】克隆得到935 bp大足黑山羊PHLDA2的cDNA全长序列,其中5′-UTR、3′-UTR和编码序列分别为62 bp、450 bp和420 bp,其编码140个氨基酸。预测的山羊PHLDA2蛋白分子量大小为15 638.7 Da,等电点为9.18,二级结构由α-螺旋(37.14%)、β-转角(9.29%)、延伸链(23.57%)和无规卷曲(30%)组成, 并且包含保守的PH（pleckstrin homology）结构域。③BLAST分析发现,山羊PHLDA2定位于29号染色体,其与牛、猪、猕猴、马和人同源基因核苷酸序列的相似性分别达到91%,90%,90%,90%和89%,在核苷酸和氨基酸序列上与牛的亲缘关系最近。④荧光定量PCR结果显示PHLDA2在山羊胎盘中表达量最高（P < 0.01),在心、肝、肺、肾、肌肉、脂肪、舌和大脑组织中表达量很低且差异不显著（P > 0.05), 在脾中未检测到表达。⑤印记分析表明,PHLDA2在初生山羊胎盘、心脏和肝脏组织表达母源等位基因,但在肺、大脑和肌肉组织为双等位基因表达。⑥PHLDA2表达水平与山羊胎盘重回归关系显著（n = 15,R²=0.855,P <0.01）。【结论】山羊PHLDA2基因序列和结构特征具有物种间的保守性,但是其印记状况具有组织特异性; PHLDA2为山羊胎盘的生长和功能调控的重要基因。     

大足黑山羊卵泡抑素cDNA的克隆、序列分析及组织表达

 【目的】旨在克隆大足黑山羊卵泡抑素（follistatin）的基因序列,并研究其在不同组织中的表达差异。【方法】采用RT-PCR方法从大足黑山羊卵巢组织总RNA中克隆出follistatin的cDNA序列,用相关软件进行序列分析,并利用real-time PCR技术检测follistatin基因在不同组织中的表达。【结果】序列分析表明,大足黑山羊follistatin的cDNA序列全长为1 217 bp,包括该基因完整的开放阅读框（open reading frame,ORF）1 035 bp,编码344个氨基酸。与牛的核苷酸序列比对同源性高达98%。real-time PCR结果表明,follistatin基因能在心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏、卵巢和垂体中检测出来,在肾脏中表达量相对较高,在垂体中表达量较低。肾脏中follistatin mRNA含量显著高于垂体中follistatin mRNA含量（P＜0.05）;心脏中follistatin mRNA含量显著高于垂体中follistatin mRNA含量（P＜0.05）;其余各组织间follistatin mRNA含量差异均不显著（P＞0.05）。【结论】成功克隆出大足黑山羊follistatin基因cDNA序列,该基因在肾脏中的表达高于其它组织。     

山羊早期胎儿组织TET1与Wnt通路基因的表达变化及其相关性

【目的】通过检测TET1和Wnt信号通路相关基因以及DKK家族基因在山羊胎儿发育早期的表达变化,分析TET1与Wnt通路基因的相关性,为TET1调控山羊胎儿发育研究提供理论依据。【方法】选取12只健康大足黑山羊母羊,自然发情后与同一只种公羊自然交配。采用剖腹产手术的方法,分别获得妊娠20、25、30、60和90d的胎儿,对胎儿的生长指标(体重、体长)进行统计,并采集了60和90d胎儿的组织器官样品(心、肝、肺、肾、脑、皮肤),通过Real-time PCR(RT-PCR)检测各样品中TET1基因,DKK家族基因(DKK1、DKK2、DKK3)和Wnt家族基因(Wnt2、Wnt2b、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt7b、Wnt16)的相对表达量。利用SPSS软件分析山羊胎儿发育早期不同阶段TET1与WNT信号通路相关基因相关性以及基因表达显著性(P0.05)。【结果】山羊妊娠早期胎儿生长在60d后有显著变化。荧光定量检测结果表明,TET1基因表达随妊娠天数的增加呈上升趋势。Wnt家族基因在山羊胎儿发育中都检测到表达(Wnt2,-2b,-4,-5a,-5b,-7b,-16)。其中,Wnt2和Wnt7b表达量随胎儿发育逐渐增高;Wnt2b、Wnt5a、Wnt5b、Wnt7b在妊娠30 d时有显著高表达(P0.05);Wnt4在胎儿发育20 d时表达显著(P0.05);Wnt16基因在妊娠25 d有显著高表达(P0.05)。DKK家族基因表达检测结果显示,DKK1在胎儿发育早期阶段都有表达,DKK2/3在妊娠初期表达量较低,后期表达增高。通过组织中基因表达检测显示,TET1在90d胎儿肝、肺、肾和脑中的表达水平相比于60d胎儿组织升高,肝中表达量显著(P0.05)。Wnt家族基因Wnt2在组织器官中有相对活跃的表达,妊娠90d胎儿肺中表达量极显著(P0.01);Wnt16基因在胎儿皮肤组织中表达显著(P0.05),且维持在一个较高的水平;Wnt5a和Wnt7b在肾中表达显著(P0.05),其他Wnt基因在组织中都有表达。相关性分析显示,胎儿生长指标(体重、体长)变化与TET1的表达呈极显著正相关(P0.01);TET1在胎儿发育早期的表达与Wnt2、Wnt7b、Wnt16呈现正相关,与Wnt2b、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b呈负相关,其中与Wnt5b呈显著负相关(P0.05),与Wnt7b呈极显著正相关(P0.01)。Wnt通路基因之间也有相互关系,Wnt2与Wnt4呈极显著负相关(P0.01)。Wnt2与Wnt7b,Wnt2b与Wnt5a、Wnt5b,Wnt5a与Wnt5b呈极显著正相关(P0.01)。Wnt4与Wnt5a呈显著正相关(P0.05)。【结论】获得了TET1与Wnt基因在山羊胎儿发育早期的表达模式,并进行了相关性分析,填补了这些基因在山羊方面的研究空白;TET1与Wnt基因对山羊胎儿早期的发育和组织的形成是一个动态的调控变化过程;TET1基因表达与部分Wnt基因呈现显著正相关,部分呈现显著负相关;Wnt通路基因之间表达量呈现一定的相关性。这些数据为TET1与Wnt分子调控山羊早期胎儿发育的机制深入研究提供了参考。